本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種防治煙草青枯病發(fā)酵液及其制備方法。
背景技術(shù)：
：土傳病害是危害煙草生產(chǎn)的毀滅性病害，在我國目前發(fā)生最為嚴(yán)重的是煙草青枯病。煙草青枯病(TobaccoBacterialWilt)是由青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的煙草上毀滅性病害之一，每年造成巨額經(jīng)濟(jì)損失。對于這種病害的防治，目前還沒有有效地生物防治藥劑和防治藥劑技術(shù)。一方面是因為防治青枯病的生防制劑開發(fā)相對滯后，有效藥劑較少，再加上大量使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治會造成農(nóng)藥殘留，環(huán)境污染；同時化學(xué)農(nóng)藥的長期使用，使得病原菌對其產(chǎn)生抗藥性。另一方面是對用于控制這青枯病的藥劑的應(yīng)用技術(shù)的研究也很薄弱。由于病原菌的多樣性和同步進(jìn)化特性，單一拮抗菌株也無法達(dá)到很理想的防治效果，因此，生防菌的很多生物功能需要依靠兩株或兩株以上的細(xì)菌間的協(xié)同作用，才能發(fā)揮出更好的作用。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的是提供一種防治煙草青枯病的發(fā)酵液，本發(fā)明通過將不同的生防菌組合后以不同的比例混合發(fā)酵，并篩選出穩(wěn)定、有效的組合，將篩選出來的組合通過澆根的施用方法能有效控制煙草青枯??；該防治煙草青枯病的發(fā)酵液的原料配比為：淺多色鏈霉菌種子液20-40份，累西菲鏈霉菌種子液20-40份，沙福芽孢桿菌發(fā)酵液20-50份，中孢短芽孢桿菌發(fā)酵液20-50份，褐紅木霉種子液30-60份，甘蔗糖蜜20-40份，大豆糖蜜40-60份，棉粕粉40-60份，復(fù)合氨基酸原粉40-60份，黃腐酸鉀40-60份，碳酸鈣5-10份，硫酸鎂2-6份，水800份。在所述發(fā)酵液中，淺多色鏈霉菌，累西菲鏈霉菌，沙福芽孢桿菌，中孢短芽孢桿菌，褐紅木霉等五種菌是從400多株微生物菌株中篩選得到的能共生共存，能產(chǎn)生多種抗菌素如四環(huán)素，多色霉素A，B等；它們對抑制煙草青枯病病原菌--青枯雷爾氏菌有特別強(qiáng)大的效果，從而達(dá)到防治煙草青枯病的作用；另一方面，本發(fā)明的菌種能夠全面的利用微生物種間或種內(nèi)的抗生、競爭、重寄生、溶菌作用，以及通過次級代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗病性，增強(qiáng)其防病效果；再次，本發(fā)明中所使用的這5株菌株都是可從土壤中直接分離得到，都具有根跡促生作用，可在作物表面、植株內(nèi)部或土壤中繁殖生長的同時，并定向植物根際分泌某些次生代謝產(chǎn)物，能夠提高植物對養(yǎng)分的吸收、刺激植株生長起到肥料的效果；本發(fā)明的第二目的在于提供一種防治煙草青枯病的發(fā)酵液的制備方法，該方法為多菌種混合發(fā)酵，步驟簡單，且能確保防治煙草青枯病的效果突出。為了達(dá)到上述目的，該防治煙草青枯病發(fā)酵液的制備方法，包括以下步驟：⑴、在發(fā)酵罐中依次加入：甘蔗糖蜜20-40份，大豆糖蜜40-60份，棉粕粉40-60份，碳酸鈣5-10份，硫酸鎂2-6份，水800份，121℃滅菌30min，冷卻至30℃；⑵、在步驟⑴制取的冷卻液加入淺多色鏈霉菌種子液20-40份，累西菲鏈霉菌種子液20-40份，褐紅木霉種子液30-60份；28℃-30℃，開攪拌160-200r/min，每分鐘通無菌空氣量與發(fā)酵液體積比為0.8：1-1:1；發(fā)酵36-48小時，檢測其菌體總含量達(dá)到100g/L，即可加入沙福芽孢桿菌發(fā)酵液20-50份，中孢短芽孢桿菌發(fā)酵液20-50份，混勻后結(jié)束發(fā)酵；⑶、向步驟⑵中發(fā)酵好的菌液，加入復(fù)合氨基酸原粉40-60份，黃腐酸鉀40-60份，混勻，包裝成品，即為防治煙草青枯病的發(fā)酵液。其中，所述的淺多色鏈霉菌種子液，累西菲鏈霉菌種子液，沙福芽孢桿菌發(fā)酵液，中孢短芽孢桿菌發(fā)酵液，褐紅木霉種子液按如下方法制備：、淺多色鏈霉菌種子液的制備取出淺多色鏈霉菌菌種保藏管，用高氏一號固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)7天。在平板下挑取單個菌落劃線接種裝有150毫升高氏一號固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-8天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子粉即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.1億cfu/ml，即為淺多色鏈霉菌種子液。、累西菲鏈霉菌種子液的制備取出累西菲鏈霉菌菌種保藏管，用高氏一號固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)7天。在平板下挑取單個菌落劃線接種裝有150毫升高氏一號固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-8天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子粉即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.2億cfu/ml，即為累西菲鏈霉菌種子液；其中，所述的高氏一號固體培養(yǎng)基：硝酸鉀：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氫二鉀：0﹒5克，硫酸鎂：0﹒5克，氯化鈉：0﹒5克，硫酸亞鐵：0﹒01克，瓊脂：20克，蒸餾水補(bǔ)足1000ml，PH7﹒2～7﹒4。③、沙福芽孢桿菌發(fā)酵液的制備取出沙福芽孢桿菌保藏管，用LB固體培養(yǎng)基分別劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)48小時。在平板下挑取單個菌落接種至裝有LB固體培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，用3000ml無菌水將三個茄子瓶中的菌苔洗脫，接種至裝有300L沙福芽孢桿菌培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開攪拌120r/min，前12小時通氣量為200L/min，12小時后通氣量為320L/min，30℃培養(yǎng)26-36小時，待總芽孢含量不低于40億cfu/ml，即可作為沙福芽孢桿菌發(fā)酵液；其中，所述LB固體培養(yǎng)基：酵母提取物5.0g,蛋白胨10.0,NaCl10.0g，瓊脂20g，水1000mL，pH7.2；其中，所述沙福芽孢桿菌培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L，玉米粉28g/L，棉粕粉15g/L，魚粉10g/L，硫酸鎂0.2g/L，硫酸錳0.5g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，pH7.0。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。④、中孢短芽孢桿菌發(fā)酵液的制備取出中孢短芽孢桿菌保藏管，用NA固體培養(yǎng)基分別劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)48小時。在平板下挑取單個菌落接種至裝有NA固體培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，用3000ml無菌水將三個茄子瓶中的菌苔洗脫，接種至裝有300L中孢短芽孢桿菌培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開攪拌120r/min，前12小時通氣量為200L/min，12小時后通氣量為320L/min，30℃培養(yǎng)26-36小時，待總芽孢含量不低于80億cfu/ml，即可作為中孢短芽孢桿菌發(fā)酵液；其中，NA固體培養(yǎng)基：（g/L）牛肉浸膏3.0，蛋白胨5.0，葡萄糖2.5，瓊脂18，pH值7.0±0.1；其中，所述中孢短芽孢桿菌培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L，木薯粉20g/L，菜粕粉25g/L，硫酸鎂0.4g/L，硫酸錳0.5g/L，磷酸二氫鉀0.2g/L，碳酸鈣5g/L，pH7.0。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。⑤、褐紅木霉種子液的制備取出菌種保藏管，用PDA固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)48小時。在平板下挑取單個菌落劃線至裝有PDA固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)3-5天，待菌種產(chǎn)生大量的孢子后，用無菌生理鹽水刮下，調(diào)整褐紅木霉孢子濃度為0.5億CFU/ml，即為褐紅木霉種子液；其中，所述的PDA固體培養(yǎng)基：土豆200g，蔗糖20g，瓊脂20g，水1000mL；其中，防治煙草青枯病的發(fā)酵液的使用方法為先將防治煙草青枯病的發(fā)酵液稀釋100倍-200倍，然后將每株煙草病株澆灌50ml-100ml稀釋液。本發(fā)明的有益效果：、本發(fā)明使用的淺多色鏈霉菌，累西菲鏈霉菌，沙福芽孢桿菌，中孢短芽孢桿菌，褐紅木霉等五種菌是從400多株微生物菌株中篩選得到的能共生共存，能產(chǎn)生多種抗菌素如四環(huán)素，多色霉素A，B等；它們對抑制煙草青枯病病原菌--青枯雷爾氏菌有特別強(qiáng)大的效果，從而達(dá)到防治煙草青枯病的作用；其對煙草青枯病的藥效高，平均防效可達(dá)到89.32%，且針對性強(qiáng)；顯著高于72%農(nóng)用鏈霉素的防治效果38.46%；、本發(fā)明的菌種能夠全面的利用微生物種間或種內(nèi)的抗生、競爭、重寄生、溶菌作用，或者通過次級代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗病性，增強(qiáng)其防病效果；、本發(fā)明中所使用的這5株菌株都是可從土壤中直接分離得到，都具有根跡促生作用，可在作物表面、植株內(nèi)部或土壤中繁殖生長的同時，并定向植物根際分泌某些次生代謝產(chǎn)物，能夠提高植物對養(yǎng)分的吸收、刺激植株生長起到肥料的效果；、本發(fā)明通過將不同的生防菌組合后以不同的比例混合發(fā)酵，并篩選出穩(wěn)定、有效的組合，將篩選出來的組合通過澆根的施用方法能有效控制煙草青枯病，防病效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于單一菌種發(fā)酵的效果。具體實施方式實施例1一種防治煙草青枯病發(fā)酵液，其特征在于，制備該發(fā)酵液的原料按重量份為：淺多色鏈霉菌種子液30份，累西菲鏈霉菌種子液30份，沙福芽孢桿菌發(fā)酵液30份，中孢短芽孢桿菌發(fā)酵液30份，褐紅木霉種子液40份，甘蔗糖蜜30份，大豆糖蜜50份，棉粕粉50份，復(fù)合氨基酸原粉50份，黃腐酸鉀50份，碳酸鈣6份，硫酸鎂4份，水800份。該防治煙草青枯病發(fā)酵液的制備方法，包括如下步驟：⑴、在發(fā)酵罐中依次加入：甘蔗糖蜜30份，大豆糖蜜50份，棉粕粉50份，碳酸鈣6份，硫酸鎂4份，水800份，121℃滅菌30min，冷卻至30℃；⑵、在步驟⑴制取的冷卻液加入淺多色鏈霉菌種子液30份，累西菲鏈霉菌種子液30份，褐紅木霉種子液40份；28℃-30℃，開攪拌160-200r/min，每分鐘通無菌空氣量與發(fā)酵液體積比為0.8：1-1:1；發(fā)酵42小時，檢測其菌體總含量為110g/L，即可加入沙福芽孢桿菌發(fā)酵液30份，中孢短芽孢桿菌發(fā)酵液30份，混勻后結(jié)束發(fā)酵；⑶、向步驟⑵中發(fā)酵好的菌液，加入復(fù)合氨基酸原粉50份，黃腐酸鉀50份，混勻，包裝成品，即為防治煙草青枯病的發(fā)酵液。其中，所述的淺多色鏈霉菌種子液，累西菲鏈霉菌種子液，沙福芽孢桿菌發(fā)酵液，中孢短芽孢桿菌發(fā)酵液，褐紅木霉種子液按如下方法制備：、淺多色鏈霉菌種子液的制備取出淺多色鏈霉菌菌種保藏管，用高氏一號固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)7天。在平板下挑取單個菌落劃線接種裝有150毫升高氏一號固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-8天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子粉即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.1億cfu/ml，即為淺多色鏈霉菌種子液。、累西菲鏈霉菌種子液的制備取出累西菲鏈霉菌菌種保藏管，用高氏一號固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)7天。在平板下挑取單個菌落劃線接種裝有150毫升高氏一號固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-8天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子粉即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.2億cfu/ml，即為累西菲鏈霉菌種子液；其中，所述的高氏一號固體培養(yǎng)基：硝酸鉀：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氫二鉀：0﹒5克，硫酸鎂：0﹒5克，氯化鈉：0﹒5克，硫酸亞鐵：0﹒01克，瓊脂：20克，蒸餾水補(bǔ)足1000ml，PH7﹒2～7﹒4。③、沙福芽孢桿菌發(fā)酵液的制備取出沙福芽孢桿菌保藏管，用LB固體培養(yǎng)基分別劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)48小時。在平板下挑取單個菌落接種至裝有LB固體培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，用3000ml無菌水將三個茄子瓶中的菌苔洗脫，接種至裝有300L沙福芽孢桿菌培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開攪拌120r/min，前12小時通氣量為200L/min，12小時后通氣量為320L/min，30℃培養(yǎng)32小時，檢測其總芽孢含量為45億cfu/ml，即作為沙福芽孢桿菌發(fā)酵液；其中，所述LB固體培養(yǎng)基：酵母提取物5.0g,蛋白胨10.0,NaCl10.0g，瓊脂20g，水1000mL，pH7.2；其中，所述沙福芽孢桿菌培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L，玉米粉28g/L，棉粕粉15g/L，魚粉10g/L，硫酸鎂0.2g/L，硫酸錳0.5g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，pH7.0。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。④、中孢短芽孢桿菌發(fā)酵液的制備取出中孢短芽孢桿菌保藏管，用NA固體培養(yǎng)基分別劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)48小時。在平板下挑取單個菌落接種至裝有NA固體培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，用3000ml無菌水將三個茄子瓶中的菌苔洗脫，接種至裝有300L中孢短芽孢桿菌培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開攪拌120r/min，前12小時通氣量為200L/min，12小時后通氣量為320L/min，30℃培養(yǎng)30小時，檢測其總芽孢含量為83億cfu/ml，即作為中孢短芽孢桿菌發(fā)酵液；其中，NA固體培養(yǎng)基：（g/L）牛肉浸膏3.0，蛋白胨5.0，葡萄糖2.5，瓊脂18，pH值7.0±0.1；其中，所述中孢短芽孢桿菌培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L，木薯粉20g/L，菜粕粉25g/L，硫酸鎂0.4g/L，硫酸錳0.5g/L，磷酸二氫鉀0.2g/L，碳酸鈣5g/L，pH7.0。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。⑤、褐紅木霉種子液的制備取出菌種保藏管，用PDA固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)48小時。在平板下挑取單個菌落劃線至裝有PDA固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)3-5天，待菌種產(chǎn)生大量的孢子后，用無菌生理鹽水刮下，調(diào)整褐紅木霉孢子濃度為0.5億CFU/ml，即為褐紅木霉種子液；其中，所述的PDA培養(yǎng)基：土豆200g，蔗糖20g，瓊脂20g，水1000mL。實施例2本發(fā)明發(fā)酵液在溫室盆栽防效試驗煙草品種為中煙98，將催芽后的種子點播到至育苗盤，12天左右后移栽至盆缽中，每盆1株，置于26℃溫室中培養(yǎng)。移栽4天后，每株苗澆灌50ml實施例1制備的發(fā)酵液的100倍稀釋液，24h后灌根接種煙草青枯病菌，接種濃度107cfu/mL，每株20m1。以72%農(nóng)用鏈霉素灌根處理的植株作為農(nóng)藥對照，以發(fā)酵培養(yǎng)基和清水處理的植株作為空白對照。每個處理20株苗，每處理3次重復(fù)。待發(fā)病后每天調(diào)查發(fā)病情況，統(tǒng)計發(fā)病率和病情指數(shù)，直至清水對照發(fā)病率達(dá)到90%以上時結(jié)束實驗。病情分級標(biāo)準(zhǔn)如下:0級:植株葉片無萎蔫癥狀；1級:植株總體1/5以下的葉片出現(xiàn)萎蔫癥狀；2級:植株總體1/5-1/3葉片出現(xiàn)萎蔫癥狀；3級:植株總體1/3以上2/3以下葉片出現(xiàn)萎蔫癥狀；4級:全株萎蔫死亡；發(fā)病率(%)=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100%病情指數(shù)(%)=[Σ病級數(shù)×該病級植株數(shù))/(最高病級數(shù)×總植株數(shù))]×100%防治效果(%)二[(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)]×100%(對照指清水對照處理)表1本發(fā)明發(fā)酵液對煙草青枯病的盆栽防治效果處理病情指數(shù)（%）防效（%）本發(fā)明發(fā)酵液9.62±2.12c89.3272%農(nóng)用鏈霉素1000倍55.46±4.73c38.46發(fā)酵培養(yǎng)基86.72±3.24a3.77對照（清水）90.12±4.42a實驗結(jié)果：如表1所示，本發(fā)明發(fā)酵液能夠顯著降低煙草青枯病的病情指數(shù)，防治效果高達(dá)89.32%，顯著高于72%農(nóng)用鏈霉素的防治效果38.46%。另外從表中還可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)基處理的病情指數(shù)略低于清水對照處理的病情指數(shù)，但兩者差異不顯著。溫室盆栽實驗結(jié)果說明，本發(fā)明的發(fā)酵液具有顯著的防治煙草青枯病的效果。實施例3、本發(fā)明發(fā)酵液在大田中對煙草青枯病治療效果地點：湖南省隆回縣灘頭鎮(zhèn)某種植戶發(fā)病煙草菌劑噴施處理:對出現(xiàn)的發(fā)病病株，每株病株澆灌50ml實施例1制備的發(fā)酵液的100倍稀釋液；農(nóng)藥鏈霉素組：以72%農(nóng)用鏈霉素灌根處理的植株；空白對照對發(fā)病菌株僅僅噴施水。結(jié)果：對于噴施水的煙葉，3天后，枯萎率達(dá)55%，6天后96%枯萎。對于施用農(nóng)藥鏈霉素組的，3天后，枯萎率達(dá)到23%，6天后35%的枯萎，也有40%左右的病株得到了控制；而經(jīng)本發(fā)明的發(fā)酵液處理的病株，在3天后，所有的病株發(fā)病狀況得到初步控制，6天后95%發(fā)病株得到好轉(zhuǎn)，隨后繼續(xù)生長，表現(xiàn)出了較好的治療效果。說明經(jīng)過本發(fā)明的發(fā)酵液處理后，能有較好治療效果，減少種植戶的損失，具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益。當(dāng)前第1頁1 2 3