本發(fā)明涉及中藥材育種、栽培等領(lǐng)域，具體涉及云南重樓或其多芽品系種子的萌發(fā)和出苗方法。
背景技術(shù)：
云南重樓Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.為歷版《中國(guó)藥典》收載的重樓藥材的基源植物之一。由于重樓類(lèi)植物種植需要6-8年才能采挖；云南重樓可采用根莖或種子進(jìn)行繁殖，根莖繁殖技術(shù)雖簡(jiǎn)單成熟，但是種植戶(hù)無(wú)法可持續(xù)性承擔(dān)需要消耗大量的高價(jià)格重樓根莖種源的重樓種植業(yè)；種子繁殖具有繁殖系數(shù)大、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，但其存在二次休眠，自然發(fā)芽率低，需經(jīng)過(guò)2次低溫休眠才能萌發(fā)，在自然情況下需要兩冬一夏才能出土成苗，l5個(gè)月的出苗率僅為46.2％。
云南白藥集團(tuán)、四川光大制藥有限公司和通化萬(wàn)通藥業(yè)股份有限公司等相關(guān)企業(yè)對(duì)重樓藥材資源需求量大，過(guò)度采挖導(dǎo)致野生資源日益稀少，市場(chǎng)價(jià)格暴漲，導(dǎo)致重樓藥材野生資源日漸瀕危，人工種植目前尚無(wú)優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定的種源供給市場(chǎng)，已經(jīng)成為制約重樓制藥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。多芽品系是一類(lèi)具有典型的云南重樓植物學(xué)特征的新品系，如花瓣上部狹匙形，藥隔凸出明顯等，但其具有眾多叢生芽，每個(gè)芽均可作為繁殖材料。
目前破除其休眠雖有較多文獻(xiàn)報(bào)道，但沒(méi)有成體系地應(yīng)用到云南重樓的種植生產(chǎn)環(huán)節(jié)，且效果欠佳。如云南省大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院張琳、李海峰等人，先將赤霉素(50mg/L)浸種的種子在4℃下濕沙層積120天，然后20至25℃條件下無(wú)菌培養(yǎng)90天，種子萌發(fā)率可達(dá)68.67％。(注：種子萌動(dòng)率＝胚根或胚芽突破種皮的種子數(shù)占接種種子數(shù)的百分?jǐn)?shù)；以胚根或胚芽長(zhǎng)度≥5mm視為萌發(fā))。云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高山經(jīng)濟(jì)植物研究所陳翠等人，采用18℃恒溫培養(yǎng)120天發(fā)芽率能達(dá)到94％，但播種大田后的出苗率僅能達(dá)到32％。
因此，建立一套同時(shí)提高發(fā)芽率和在地出苗率的種子萌發(fā)、出苗技術(shù)是目前解決重樓種源的有效途徑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明希望對(duì)近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的云南重樓(多芽品系)與普通云南重樓的種子萌發(fā)力進(jìn)行對(duì)比研究，以期為云南重樓及其多芽品系重樓的種苗繁育提供科學(xué)指導(dǎo)，緩解目前重樓優(yōu)質(zhì)種源嚴(yán)重不足，商品藥材嚴(yán)重供不應(yīng)求，市場(chǎng)價(jià)格高居不下的瓶頸問(wèn)題，從而規(guī)范重樓品種、品質(zhì)混亂的情況，為解決云南和四川地區(qū)重樓野生變家種的優(yōu)良種源供給問(wèn)題和重樓藥材供需之間的巨大缺口做出貢獻(xiàn)，緩解重樓資源的稀缺而制約相關(guān)制藥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。
具體地，本發(fā)明提供了云南重樓或其多芽品系種子的萌發(fā)和出苗方法，其特征在于：它包括如下操作步驟：
(1)取云南重樓或其多芽品系的成熟種子，去外種皮，用100-500mg/L赤霉素水溶液浸泡，浸泡后的種子先于1-5℃下培養(yǎng)60d，轉(zhuǎn)入18℃～20℃培養(yǎng)至發(fā)芽；
(2)發(fā)芽種子播種于苗床，覆土0.1-1cm，遮陽(yáng)，田間管理直至出苗。
進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述云南重樓或其多芽品系的成熟種子，是指云南重樓或其多芽品系人工授粉或自然授粉的成熟種子；優(yōu)選為人工授粉的成熟種子。
進(jìn)一步地，赤霉素水溶液濃度為100-200mg/L。
進(jìn)一步地，種子先于4℃下培養(yǎng)60天，再轉(zhuǎn)入18℃培養(yǎng)至發(fā)芽。
進(jìn)一步地，步驟(2)中，覆土厚度為0.3-0.7cm，優(yōu)選為0.5cm。
進(jìn)一步地，步驟(2)中，覆土是指覆蓋腐葉土。
進(jìn)一步地，步驟(2)中，遮陽(yáng)選擇遮陽(yáng)率為60～80％遮陽(yáng)網(wǎng)，優(yōu)選為70％遮陽(yáng)網(wǎng)，進(jìn)一步優(yōu)選為75％遮陽(yáng)網(wǎng)。
除本發(fā)明提及的各步驟、參數(shù)外，其余方法均按照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。
經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)5年的實(shí)驗(yàn)，在收集、分析了大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明最終通過(guò)在變溫方式、赤霉素溶液濃度、授粉方式等多個(gè)條件的最佳組合，使得云南重樓和其多芽品系獲得了高達(dá)91.50％的發(fā)芽率，同時(shí)，其在地出苗率也高達(dá)83.26％，遠(yuǎn)高于現(xiàn)有方法。
附圖說(shuō)明
圖1云南重樓(多芽品系)幼苗圖
具體實(shí)施方式
除非本文中另外定義，否則結(jié)合本發(fā)明使用的科技術(shù)語(yǔ)應(yīng)具有一般技術(shù)者通常理解的含義。術(shù)語(yǔ)的含義及范疇?wèi)?yīng)為明確的；然而，若存在任何潛在含糊性，則本文所提供的定義優(yōu)先于任何詞典或外來(lái)定義。
腐葉土，即腐殖土，是植物枝葉在土壤中經(jīng)過(guò)微生物分解發(fā)酵后形成的營(yíng)養(yǎng)土。也是常見(jiàn)的花木栽培用土。
云南重樓多芽品系，也稱(chēng)為多芽重樓。
實(shí)施例1
將人工授粉的云南重樓(多芽品系)種子除去紅色外種皮，于100mg/L赤霉素(GA3)中浸泡24h，晾干水分。
4～18℃變溫培養(yǎng)操作如下：將重樓種子先于4℃中培養(yǎng)60d，轉(zhuǎn)入18℃中培養(yǎng)，保持環(huán)境濕潤(rùn)。
將培養(yǎng)后的種子直接播種墑面上，覆蓋一層0.5cm厚的腐葉土，并搭建遮陽(yáng)網(wǎng)(75％)，田間管理直至出苗。
本發(fā)明實(shí)施例1的實(shí)施地點(diǎn)在四川省阿壩州汶川縣。
實(shí)施例2
將人工授粉的云南重樓種子除去紅色外種皮，于100mg/L赤霉素(GA3)中浸泡24h，晾干水分。
4～18℃變溫培養(yǎng)操作如下：將重樓種子先于4℃中培養(yǎng)60d，轉(zhuǎn)入18℃中培養(yǎng)，保持環(huán)境濕潤(rùn)。
將培養(yǎng)后的種子直接播種墑面上，覆蓋一層0.5cm厚的腐葉土，并搭建遮陽(yáng)網(wǎng)(75％)，田間管理直至出苗。
實(shí)施例3
1材料和方法
1.1儀器和材料
智能人工氣候箱RTOP-2689(浙江托普儀器有限公司)；容聲冰箱BCD-563WY-C(海信科龍電器股份有限公司)。
云南重樓及其多芽品系成熟果實(shí)2015年采自云南省麗江市華坪縣和騰沖市重樓種植基地的，經(jīng)西南民族大學(xué)劉圓教授和四川大學(xué)張浩教授鑒定為百合科
Liliaceae云南重樓Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.果實(shí)。
1.2云南重樓及其多芽品系種子的萌發(fā)
1.2.1種子處理
將種子分別按大果(m≧20ɡ)：中果(20ɡ≤m≧10g)：小果(m≤10ɡ)(每個(gè)等級(jí)10個(gè)鮮果)、平均單果種子粒數(shù)、1000粒種子均重、1000粒去紅色外種皮的種子均重計(jì)算，并按照國(guó)標(biāo)農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程中“水分測(cè)定(GB/T 3543.6-1995)”和“凈度分析(GB/T 3534.3—1995)”項(xiàng)下測(cè)定種子水分和凈度。
1.2.2變溫培養(yǎng)、種子萌發(fā)及種子播種處理
將人工授粉的云南重樓(多芽品系)種子除去紅色外種皮，于100mg/L赤霉素(GA3)中浸泡24h，晾干水分。
4～18℃變溫培養(yǎng)操作如下：將重樓種子先于4℃冰箱中培養(yǎng)60d，轉(zhuǎn)入18℃培養(yǎng)，保持環(huán)境潮濕，設(shè)置3組重復(fù)。
每隔2d記錄一次發(fā)芽情況，當(dāng)胚根長(zhǎng)度約為種子直徑的一半時(shí)視為種子發(fā)芽。發(fā)芽率(％)＝萌發(fā)的種子總數(shù)/200×100％；平均發(fā)芽時(shí)間＝∑(ti×ni)/∑ni，ti表示從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的天數(shù)，ni表示每天發(fā)芽的種子數(shù)。
將培養(yǎng)后的種子直接播種于長(zhǎng)5米，寬1.2米，高25cm的墑面上，覆蓋一層0.5cm厚的腐葉土，并搭建遮陽(yáng)網(wǎng)(75％)，田間管理。每隔2d統(tǒng)計(jì)1次出苗情況，連續(xù)記錄140d。出苗率(％)＝出苗的種子總數(shù)/200×100％；平均出苗時(shí)間＝∑(ti×ni)/∑ni，ti表示從播種開(kāi)始的天數(shù)，ni表示每天出苗的種子數(shù)。
1.2.3溫度對(duì)種子萌發(fā)的影響
考察4℃、18℃、4～18℃三種溫度對(duì)云南重樓種子萌發(fā)的影響。將去紅色外種皮的云南重樓(多芽品系)種子分為3組，4℃和18℃分別置于冰箱中和氣候箱中培養(yǎng)130d，4～18℃變溫組按“1.2.2”項(xiàng)下變溫培養(yǎng)條件處理。其余均按“1.2.2”項(xiàng)下操作。
1.2.4赤霉素濃度對(duì)種子萌發(fā)的影響
設(shè)置0mg/L、100mg/L、200mg/L和500mg/L四種GA3濃度，將去紅色外種皮的云南重樓(多芽品系，人工授粉)種子在相應(yīng)濃度的GA3溶液中浸泡24h。其余均按“1.2.2”項(xiàng)下操作。
1.2.5授粉方式對(duì)種子萌發(fā)的影響
將人工授粉和自然授粉的云南重樓(多芽品系)種子分別按照“1.2.2”項(xiàng)下的步驟操作。
1.2.6比較云南重樓及其多芽品系種子萌發(fā)
將人工授粉的云南重樓及其多芽品系種子按照“1.2.2”項(xiàng)下的步驟操作。
1.3數(shù)據(jù)分析
除種子參數(shù)計(jì)算外，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因數(shù)方差和獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行分析。
2結(jié)果和分析
2.1種子各參數(shù)對(duì)比
云南重樓及其多芽品系種子各參數(shù)計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。
表1云南重樓(多芽品系)種子比較
云南重樓及其多芽品系種子間各參數(shù)并無(wú)明顯的差異。人工授粉果實(shí)較自然授粉果實(shí)主要有以下區(qū)別：(1)與自然授粉比較，人工授粉果實(shí)更加均勻，大果和中果的比例顯著增加；(2)人工授粉單果重量、種子數(shù)、種子千粒重明顯高于自然授粉，水分低于自然授粉。
2.2溫度處理對(duì)種子萌發(fā)的影響
云南重樓(多芽品系)種子各溫度條件下培養(yǎng)的結(jié)果見(jiàn)表2。種子在4℃培養(yǎng)130d均無(wú)萌發(fā)，播種后140d均無(wú)出苗，因其發(fā)芽率和出苗率均為0，故4℃溫度培養(yǎng)結(jié)果不做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。18℃培養(yǎng)52d后種子開(kāi)始萌發(fā)，播種后90d種子開(kāi)始出苗，開(kāi)始出苗后的30d內(nèi)為出苗高峰期。經(jīng)4℃培養(yǎng)60d，再轉(zhuǎn)入18℃培養(yǎng)40d后種子開(kāi)始萌發(fā)，播種后85d種子開(kāi)始出苗，出苗高峰期也是開(kāi)始出苗后的30d內(nèi)。
溫度處理對(duì)云南重樓(多芽品系)種子的萌發(fā)有極顯著的作用(P＜0.001)，18℃處理的發(fā)芽率為40.50％，而4～18℃變溫處理的發(fā)芽率高達(dá)91.50％；對(duì)種子的平均發(fā)芽時(shí)間也有極顯著的影響(P＜0.001)，4～18℃變溫處理的平均發(fā)芽時(shí)間(112.33d)顯著高于18℃處理的(60.67d)(P＜0.001)。溫度處理對(duì)云南重樓(多芽品系)種子出苗率有顯著的影響(P＜0.001)，4～18℃變溫處理的出苗率(83.26％)顯著高于18℃處理的(32.40％)；對(duì)種子平均出苗時(shí)間的影響沒(méi)有達(dá)到顯著差異水平(P＞0.05)。
表2溫度對(duì)云南重樓(多芽品系，人工授粉)種子萌發(fā)的影響(n＝3)
注：*18℃恒溫與4～18℃變溫相比，P＜0.05
2.3授粉方式對(duì)種子萌發(fā)的影響
云南重樓(多芽品系)人工授粉與自然授粉種子的培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表3和圖1。授粉方式對(duì)種子發(fā)芽率有顯著的影響(P＝0.001)，人工授粉的種子發(fā)芽率(92.50％)顯著高于自然授粉的(70.50％)；對(duì)種子平均發(fā)芽時(shí)間的影響沒(méi)有達(dá)到顯著性水平(P＞0.05)。授粉方式對(duì)種子的出苗率有極顯著的影響(P＜0.001)，人工授粉的種子出苗率(86.88％)顯著高于自然授粉的(62.04％)；對(duì)種子的平均出苗時(shí)間無(wú)明顯影響(P＞0.05)。人工授粉的發(fā)芽種子胚根明顯長(zhǎng)于自然授粉。
表3云南重樓(多芽品系)不同授粉方式種子萌發(fā)結(jié)果(n＝3)
注：*自然授粉與人工授粉相比，P＜0.05
2.4赤霉素對(duì)種子萌發(fā)的影響
GA3處理對(duì)云南重樓(多芽品系，人工授粉)種子的發(fā)芽率有極顯著的促進(jìn)作用(P＝0.001)，隨GA3濃度的升高發(fā)芽率先升后降，空白組的發(fā)芽率最低(79.84％)，200mg/LGA3組獲得了最高發(fā)芽率(93.50％)，顯著高于空白組(P＜0.001)和500mg/LGA3組(P＜0.05)，但與100mg/LGA3組的差異沒(méi)有達(dá)到顯著性水平(P＞0.05)；對(duì)種子的平均發(fā)芽時(shí)間也有顯著影響(P＜0.05)，隨GA3濃度的升高平均發(fā)芽時(shí)間越短，但空白組、100mg/L和200mg/LGA3組間的差異并沒(méi)有達(dá)到顯著性水平(P＞0.05)。GA3處理對(duì)種子的出苗率有顯著影響(P＜0.05)，影響趨勢(shì)與對(duì)發(fā)芽率的影響一致；對(duì)種子的平均出苗時(shí)間無(wú)明顯影響(P＞0.05)。
表4赤霉素對(duì)人工授粉的云南重樓(多芽品系)種子萌發(fā)的影響(n＝3)
注：不同的字母表示用LSD檢驗(yàn)在檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05上存在顯著性差異
2.5比較云南重樓及其多芽品系種子萌發(fā)
人工授粉的云南重樓與云南重樓(多芽品系)種子的培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表5。二者的種子發(fā)芽率、平均發(fā)芽時(shí)間、出苗率和平均出苗時(shí)間均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
表5人工授粉的云南重樓與云南重樓(多芽品系)種子萌發(fā)比較(n＝3)
綜上，本發(fā)明通過(guò)在變溫方式、赤霉素溶液濃度、授粉方式等條件的設(shè)置，最終使得云南重樓和其多芽品系獲得了高達(dá)91.50％的發(fā)芽率和83.26％的出苗率。
外種皮在維持種子休眠中起著重要作用，新鮮的云南重樓及其多芽品系的種子有紅色多汁的假種皮，里面可能含有抑制物質(zhì)或阻止了種子內(nèi)萌發(fā)抑制物質(zhì)的溢出。人工授粉的云南重樓及其多芽品系的果實(shí)比自然授粉的更加飽滿(mǎn)，單果種子數(shù)較多，在有限的子房空間里彼此較擁擠，以致假種皮較薄，因此假種皮里可能含有的抑制物較少且有利于種子內(nèi)萌發(fā)抑制物的滲出；人工授粉的種子水分低于自然授粉的，說(shuō)明人工授粉的種子種胚比重較高，發(fā)育可能更加成熟。上述因素可能是導(dǎo)致人工授粉的云南重樓及其多芽品系的種子發(fā)芽率和出苗率顯著高于自然授粉的原因。云南重樓與其多芽品系的種子萌發(fā)和出苗結(jié)果并無(wú)顯著差異，二者的種子各參數(shù)亦無(wú)明顯差別，這說(shuō)明二者間除外觀形態(tài)有差異外，可能并不存在內(nèi)在的特征差異。
結(jié)合上述研究結(jié)果和生產(chǎn)成本，本發(fā)明最佳方法如下：采用人工授粉的成熟種子，去外種皮，用100mg/L GA3溶液浸泡24h，先于4℃下培養(yǎng)60d，轉(zhuǎn)入18℃～20℃培養(yǎng)至發(fā)芽；發(fā)芽種子播種于苗床，覆蓋一層0.5cm厚的腐葉土，遮陽(yáng)度75％，田間管理至出苗即可。