本發(fā)明涉及水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種適用于厚殼貽貝的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
：厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)隸屬軟體動(dòng)物門(Mollusca)，雙殼綱(Bivalvia)，貽貝屬(Mytilus)，是我國重要的經(jīng)濟(jì)貝類之一，目前的年產(chǎn)量在15萬噸左右。近兩年商品貝的銷售價(jià)格也一路上漲，2014年比2011年翻了一番，在福州市場(chǎng)的批發(fā)價(jià)就高達(dá)每公斤14元以上。所以，厚殼貽貝在國內(nèi)的潛在市場(chǎng)正在不斷被開發(fā)，加工出口也在年年遞增，備受歐美消費(fèi)者喜愛，每年大約有2000多噸產(chǎn)品出口歐美等市場(chǎng)。更有對(duì)厚殼貽貝抗菌肽、降血壓活性肽、免疫多糖等活性藥用物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)。據(jù)發(fā)明人幾年來的跟蹤觀察，結(jié)合對(duì)其生殖周期和性腺組織學(xué)研究，厚殼貽貝在浙江海區(qū)每年有兩個(gè)繁殖期，即每年的12月中旬有一次小規(guī)模的精卵排放活動(dòng)，翌年的3月中旬又有一次大規(guī)模的排放，每次可持續(xù)半個(gè)月左右。伴隨著精卵的大量排放，海區(qū)養(yǎng)殖的成貝不僅會(huì)出現(xiàn)死亡，而且肥滿度迅速下降，會(huì)變得很瘦，出肉率降至排放前的1/4。因此，每年的12月下旬至1月中旬，以及3月下旬至4月底，是厚殼貽貝最瘦的時(shí)期，且由于排放后肉質(zhì)帶有“腥味”，大大影響了厚殼貽貝的口感品質(zhì)。因此，如果能減少其性成熟或控制其性腺成熟排放，就能有效解決這一問題。從而提高養(yǎng)殖厚殼貽貝的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，增加養(yǎng)民的收入。誘導(dǎo)厚殼貽貝三倍體技術(shù)是解決上述問題的的有效途徑。目前，三倍體技術(shù)在海洋貝類的育種上應(yīng)用十分廣泛，三倍體貝類具有不育性，生長速度快、出肉率高、可顯著縮短養(yǎng)殖周期等優(yōu)點(diǎn)。從細(xì)胞遺傳學(xué)角度來看，三倍體是非偶數(shù)染色體組，在第一次減數(shù)分裂的后期沒有聯(lián)會(huì)的同源染色體，故阻礙了生殖細(xì)胞正常的減數(shù)分裂，結(jié)果常常導(dǎo)致性腺發(fā)育的衰退或非整倍體配子的產(chǎn)生。三倍體貝類由于達(dá)不到性成熟，故其最明顯的優(yōu)勢(shì)在于其具有不育性，使其只有極少能量用于性腺發(fā)育，更多的能量用于生長。不至于因繁殖季節(jié)消耗營養(yǎng)體質(zhì)差而引起死亡,從而提高了成活率。同時(shí)，厚殼貽貝味道鮮美的成分主要是肝糖,隨著性成熟排放,體內(nèi)肝糖降低,因此味美不再，甚至?xí)霈F(xiàn)腥臊味，而三倍體厚殼貽貝由于不育,繁殖季節(jié)其體內(nèi)的肝糖不降低，一年四季便都可吃到美味可口的厚殼貽貝。這些事實(shí)已在許多貝類上得到了證實(shí)。但使用目前的貝類三倍體育種方法在厚殼貽貝上的效果并不明顯。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提出一種適用于厚殼貽貝的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)厚殼貽貝穩(wěn)定、高效的三倍體誘導(dǎo)。本發(fā)明的厚殼貽貝的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，包括如下步驟：1)厚殼貽貝親貝的選擇及促熟：選取灘涂采捕親貝，藻類強(qiáng)化培養(yǎng)，在室內(nèi)升溫促熟，達(dá)到性腺充分成熟；2)親貝處理及配子排放：將親貝陰干8-10小時(shí)后置入砂濾海水中進(jìn)行催產(chǎn)，然后將開始排放配子的親貝選出，單個(gè)置于容器中排放配子，獲得卵液和精液；3)卵液處理：將收集的卵液以90μm篩絹過濾去除組織碎片，再以30μm篩絹清洗3次后制成卵子懸浮液；4)精液處理：將收集的精液用30μm篩絹濾除組織碎片，作為精子備用；5)受精：取步驟4)制備的精子加入到上述步驟3)的卵子懸浮液中，精卵比為3:1-5:1，然后將受精卵分成處理組和對(duì)照組；6)在處理組的受精卵中加入6‐DMAP(6‐二甲基氨基嘌呤)：觀察對(duì)照組受精卵出現(xiàn)第一極體的比例達(dá)到總卵數(shù)的50％時(shí)，向處理組加入溫度為17℃的6-DMAP溶液進(jìn)行浸泡處理；其中6‐DMAP至終濃度為400μM/L；7)去除受精卵溶液中的6‐DMAP及孵化；觀察對(duì)照組中80％至90％的第一極體下方出現(xiàn)第二極體時(shí)，以30μm篩絹洗卵，砂濾海水清洗，去除6‐DMAP，然后孵化發(fā)育。所述步驟1)中親貝為4-5齡厚殼貽貝，殼長大于80mm。所述步驟2)中砂濾海水的溫度為13-17℃，鹽度為千分之20-30。所述步驟6)加入的6‐DMAP溶液具體配制方法為：將6‐DMAP溶于蒸餾水中，配制成400μM/L的溶液，然后加入到受精卵溶液中，至體積比1:1000。作為一種優(yōu)選，步驟6)是對(duì)照組受精卵出現(xiàn)第一極體的比例達(dá)到總卵數(shù)的50％時(shí)，將處理組的受精卵移入海水中，5min內(nèi)將海水溫度從17℃升溫到25℃，然后在移入濃度為400μM/L、溫度為30℃的6-DMAP溶液中進(jìn)行浸泡處理。本發(fā)明首次公開了一種適用于厚殼貽貝的三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法，該方法穩(wěn)定、高效、操作簡單。本發(fā)明較傳統(tǒng)的海水雙殼類三倍體化學(xué)誘導(dǎo)方法有如下特點(diǎn)：1、順應(yīng)厚殼貽貝的繁殖生物學(xué)特性，可操作性強(qiáng)，容易掌握，能夠清楚地觀察到厚殼貽貝排精排卵的全過程以便較為準(zhǔn)確地獲得同步性較高的受精卵。2、本發(fā)明采用單一個(gè)體催產(chǎn)的方法，及時(shí)將排精或排卵的厚殼貽貝個(gè)體隔離，便于人工選擇質(zhì)量較好的精子和卵子，這樣做可以提高受精卵發(fā)育的同步性和三倍體的誘導(dǎo)率。3、采用6-DMAP作為誘導(dǎo)劑，費(fèi)用低、毒性小，且誘導(dǎo)率可以達(dá)到65-75％。4、處理時(shí)機(jī)不同：以往的化學(xué)誘導(dǎo)方法一般規(guī)定在受精后特定時(shí)間加入誘導(dǎo)劑，本發(fā)明以顯微鏡下觀察為基礎(chǔ)，在卵子出現(xiàn)第一極體的比例達(dá)50％時(shí)加入6-DMAP，有效降低非整倍體胚胎的出現(xiàn)幾率；誘導(dǎo)劑持續(xù)處理的時(shí)間以對(duì)照組中出現(xiàn)第二極體的受精卵比例達(dá)到80％作為去除6-DMAP的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，處理時(shí)間以受精卵發(fā)育進(jìn)度作為生物學(xué)指標(biāo)，使第二極體被有效抑制在合子內(nèi)，有效降低二倍體胚胎的出現(xiàn)幾率。5、采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，省時(shí)省力，并且能夠在早期就快速準(zhǔn)確地確定誘導(dǎo)率。6、獲得結(jié)果不同：以往在其他雙殼類的三倍體誘導(dǎo)率在50-70％間變化，而本發(fā)明三倍體誘導(dǎo)率在65-75％之間。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例11)2015年四月初，在嵊泗某基地，選取當(dāng)?shù)夭刹兜?-5齡厚殼貽貝作為親貝，對(duì)親貝進(jìn)行培育：挑選貝體完整，殼鼓體肥，殼面光潔，生長正常的厚殼貽貝原種，體長8-15cm，雌雄比5：1，于11℃-15℃蓄養(yǎng)20天，經(jīng)過藻類培養(yǎng)，性腺充分成熟；2)將親貝陰干8-10小時(shí)后，置于17℃的砂濾海水催產(chǎn)。將開始排放配子的親貝選出，淡水反復(fù)沖洗后，單個(gè)置于2000ml塑料盆內(nèi)排放配子，約30min后，配子基本排放完畢，獲得卵液34盆，精液8盆；3)鏡檢每盆卵液，選擇質(zhì)量好的卵子進(jìn)行合并并置于20L的塑料盆中；4)鏡檢上述步驟(2)獲得的精液，選取活力良好的一盆，用30μm篩絹濾除組織碎片，作為備用精子；5)取適量精子，加入卵子懸浮液中，及時(shí)攪動(dòng)卵液使卵子同步受精，鏡檢每個(gè)卵子周圍附上2-5個(gè)精子。受精后的卵子分成2組，即處理組和對(duì)照組，處理組體積10000mL，對(duì)照組體積1000mL；6)厚殼貽貝卵受精20min后，將受精卵迅速移入濃度為200-700μM/L、溫度為17℃的6-DMAP溶液中浸泡處理，浸泡18min后，當(dāng)大部分受精卵出現(xiàn)第二極體時(shí)，迅速移入17℃孵化水體中正常孵化。7)幼蟲倍性檢測(cè)：對(duì)于獲得的初孵D形幼蟲，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性檢測(cè)，結(jié)果見表1。表1不同濃度6-DMAP溶液處理受精卵對(duì)三倍體幼蟲的影響處理濃度(400μM/L)D形幼蟲成活率(％)三倍體誘導(dǎo)率(％)20084.233.830081.535.440060.765.250055.868.960051.672.870042.581.6實(shí)施例2考慮到實(shí)例1中400μM/L的6-DMAP能得到較為理想的D形幼蟲成活率和三倍體誘導(dǎo)率，因此接下來的實(shí)驗(yàn)將6-DMAP的濃度統(tǒng)一為400μM/L。1)親貝培育：挑選貝體完整，殼鼓體肥，殼面光潔，生長正常的厚殼貽貝原種，體長16-18cm，貝齡5齡，雌雄比4∶1，于13℃-15℃蓄養(yǎng)30天；2)將親貝陰干8-10小時(shí)后，置于17℃的砂濾海水催產(chǎn)。將開始排放配子的親貝選出，淡水反復(fù)沖洗后，單個(gè)置于500ml燒杯中排放配子，約30min后，配子基本排放完畢，獲得卵液18杯，精液5杯；3)鏡檢每杯卵液，選擇質(zhì)量好的卵子進(jìn)行合并置于10L的塑料盆中；4)鏡檢上述步驟2)獲得的精液，選取活力良好的一杯，用30μm篩絹濾除組織碎片，作為備用精子；5)取適量精子，加入卵子懸浮液中，及時(shí)攪動(dòng)卵液使卵子同步受精，鏡檢每個(gè)卵子周圍附上2-4個(gè)精子。受精后的卵子分成2組，即處理組和對(duì)照組，處理組體積2000mL，對(duì)照組體積500mL；6)厚殼貽貝卵受精30min后，將受精卵迅速移入濃度為400μM/L、溫度為17℃的6-DMAP溶液中浸泡處理，浸泡20min后，當(dāng)大部分受精卵出現(xiàn)第二極體時(shí)，迅速移入17℃孵化水體中正常孵化。7)幼蟲倍性檢測(cè)：對(duì)于獲得的初孵D形幼蟲，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性檢測(cè)，D形幼蟲成活率為61.8％，三倍體誘導(dǎo)率為68.4％。實(shí)施例3申請(qǐng)人在研究中發(fā)現(xiàn)，再進(jìn)行三倍體誘導(dǎo)前，將受精卵先放入溫度升高的海水中，然后再用升高溫度的6-DMAP溶液處理；這樣的步驟即能保證高的三倍體誘導(dǎo)率，又能明顯提高誘導(dǎo)的三倍體的存活率。1)親貝培育：挑選貝體完整，殼鼓體肥，殼面光潔，生長正常的厚殼貽貝原種，體長12-14cm，貝齡3齡，雌雄比6∶1，于13℃-15℃蓄養(yǎng)60天；2)將親貝陰干8-10小時(shí)后，置于17℃的砂濾海水催產(chǎn)。將開始排放配子的親貝選出，淡水反復(fù)沖洗后，單個(gè)置于1000ml燒杯中排放配子，約30min后，配子基本排放完畢，獲得卵液26杯，精液7杯；3)鏡檢每杯卵液，選擇質(zhì)量好的卵子進(jìn)行合并并置于50L的塑料盆中；4)鏡檢上述步驟2)獲得的精液，選取活力良好的兩杯，用30μm篩絹濾除組織碎片，作為備用精子；5)取適量精子，加入卵子懸浮液中，及時(shí)攪動(dòng)卵液使卵子同步受精，鏡檢每個(gè)卵子周圍附上2-4個(gè)精子。受精后的卵子分成2組，即處理組和對(duì)照組，處理組體積10000mL，對(duì)照組體積2000mL；6)厚殼貽貝卵受精20min后，將受精卵移入海水中，5min內(nèi)將海水溫度從17℃升溫到25℃，然后在移入濃度為400μM/L、溫度為30℃的6-DMAP溶液中進(jìn)行浸泡處理，浸泡20min后，當(dāng)大部分受精卵出現(xiàn)第二極體時(shí)，迅速移入17℃孵化水體中正常孵化。7)幼蟲倍性檢測(cè)：對(duì)于獲得的初孵D形幼蟲，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行倍性檢測(cè)，D形幼蟲成活率為69.7％，三倍體誘導(dǎo)率為70.6％。與實(shí)施例2相比，本實(shí)施例將6-DMAP溶液處理的溫度提高，從而再保持誘導(dǎo)率的情況下，有效的提高了存活率；重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明提高6-DMAP溶液處理的溫度對(duì)于誘導(dǎo)三倍體存活具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義(p＜0.05)。當(dāng)前第1頁1 2 3