本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種去除植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體內(nèi)生菌的方法。

背景技術(shù)：

楊樹(shù)屬于楊柳科(Salicacae)楊屬(Populus L.)植物，為多年生木本喬木。楊樹(shù)不僅是重要的造林綠化樹(shù)種和工業(yè)用材樹(shù)種，而且還是多年生林木基因工程的模式樹(shù)種。因此，獲得大量無(wú)菌的外植體是進(jìn)行楊樹(shù)組織快繁和基因工程研究的前提和基礎(chǔ)。

在常規(guī)的植物組織培養(yǎng)中，外植體的消毒方法一般是先用自來(lái)水沖洗去除表面泥土，用酒精消毒30秒到1分鐘，再用10％次氯酸鈉或0.1％的生汞消毒幾分鐘到十幾分鐘，無(wú)菌水沖洗后進(jìn)行接種。

內(nèi)生菌是指那些分布于健康植物體內(nèi)，對(duì)植物組織沒(méi)有引起明顯病害癥狀的菌類(lèi)，如腐生菌、潛伏性病原菌、菌根菌及固氮菌等等。楊樹(shù)為多年生植物，樹(shù)體內(nèi)部常寄生有各種細(xì)菌及真菌。內(nèi)生菌由于受到植物體的保護(hù)，因此常規(guī)的消毒滅菌方法難以去除。截止到目前為止，對(duì)于植物外植體內(nèi)生菌消毒滅菌的方式報(bào)道極少，常規(guī)的方式由于僅能殺滅表面病菌，而內(nèi)生菌往往在培養(yǎng)后造成培養(yǎng)物的再次污染。因此，開(kāi)發(fā)高效安全的內(nèi)生菌消毒滅菌方法是楊樹(shù)組織培養(yǎng)的關(guān)鍵一環(huán)，亟待開(kāi)發(fā)一種針對(duì)楊樹(shù)的去除外植體內(nèi)生菌的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，為改善常規(guī)消毒滅菌方式無(wú)法去除楊樹(shù)等外植體內(nèi)生菌的不足，提供了一種新的去除植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體內(nèi)生菌的方法，該方法能夠有效清除楊樹(shù)等外植體表面及內(nèi)部的細(xì)菌及真菌，使外植體保持充足的活力。

為此，本發(fā)明提供了一種去除植物組織培養(yǎng)時(shí)外植體內(nèi)生菌的方法，其包括以下步驟：

1、扦插土壤的消毒處理：采用50％的多菌靈對(duì)扦插土壤進(jìn)行消毒處理。

2、扦插枝條的消毒處理：采用含有200mg/L兩性霉素B和100mg/L硫酸鏈霉素的無(wú)菌水溶液對(duì)扦插枝條進(jìn)行消毒處理，處理后，對(duì)扦插枝條進(jìn)行頂端封臘處理。

3、外植體的選擇和消毒預(yù)處理：采用含有100mg/L兩性霉素B和50mg/L硫酸鏈霉素的無(wú)菌水溶液對(duì)半木質(zhì)化的新發(fā)枝條進(jìn)行預(yù)處理。

4、外植體的酒精滅菌處理。

5、外植體的次氯酸鈉滅菌處理。

6外植體的培養(yǎng)。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，扦插土壤的消毒處理為用50％的多菌靈，以30-40g/m³的用量與扦插土壤拌勻，裝入塑料袋，密閉，5天后打開(kāi)，陽(yáng)光下晾曬2-3天。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，扦插枝條的消毒處理為將冬眠的穗條清洗后，剪成15cm長(zhǎng)度，放入含有200mg/L兩性霉素B和100mg/L硫酸鏈霉素的無(wú)菌水溶液中，處理24小時(shí)后，進(jìn)行頂端封臘處理，處理后扦插到營(yíng)養(yǎng)缽中，移入溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，外植體的選擇和消毒預(yù)處理為剪取半木質(zhì)化的新發(fā)枝條，插入含有100mg/L兩性霉素B和50mg/L硫酸鏈霉素?zé)o菌水溶液中，處理12小時(shí)后，剪去葉片，采用1％的洗潔精溶液清洗，流水沖洗后，瀝干水分，放入超凈工作臺(tái)。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，外植體的酒精滅菌處理為剪取5cm左右的莖段，采用75％的酒精滅菌30秒，無(wú)菌水沖洗3次。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，外植體的次氯酸鈉滅菌為采取添加0.1％吐溫20的10％次氯酸鈉消毒8-10分鐘，用無(wú)菌水沖洗外植體3次，滅菌濾紙吸干。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，在對(duì)外植體進(jìn)行培養(yǎng)之前，還包括在無(wú)菌條件下將外植體材料上與消毒劑接觸過(guò)的界面進(jìn)行切除的步驟。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，外植體的培養(yǎng)是將消毒滅菌后的外植體接種在MS啟動(dòng)培養(yǎng)基中。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，外植體培養(yǎng)的環(huán)境條件為光周期16h/8h、光照強(qiáng)度2500Lux、溫度27℃/21℃。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，外植體為楊樹(shù)的外植體，優(yōu)選為美洲黑楊的外植體。

由上述描述可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用50％的多菌靈對(duì)扦插土壤進(jìn)行消毒處理，采用含有200mg/L兩性霉素B和100mg/L硫酸鏈霉素的無(wú)菌水溶液對(duì)扦插枝條進(jìn)行消毒處理，以及采用含有100mg/L兩性霉素B和50mg/L硫酸鏈霉素的無(wú)菌水溶液對(duì)半木質(zhì)化的新發(fā)枝條進(jìn)行預(yù)處理，從而能夠有效清除楊樹(shù)等外植體表面及內(nèi)部的細(xì)菌及真菌，使外植體保持充足的活力。

附圖說(shuō)明

圖1：經(jīng)本發(fā)明方法處理的美洲黑楊莖段外植體的生長(zhǎng)狀況。

圖2：采用常規(guī)消毒方法處理的美洲黑楊莖段外植體的生長(zhǎng)狀況。

A：培養(yǎng)35天后產(chǎn)生內(nèi)生細(xì)菌污染；

B：培養(yǎng)35天后產(chǎn)生內(nèi)生真菌污染。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，旨在用于說(shuō)明本發(fā)明而非限定本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1：美洲黑楊外植體的培養(yǎng)

1、扦插土壤的消毒處理

將草炭土、珍珠巖和河沙按6:2:2的比例充分混合用作扦插土壤，施入50％多菌靈(30-40g/m³)，充分拌勻，裝入塑料袋，密閉5天后打開(kāi)，陽(yáng)光下晾曬2-3天后，裝入直徑6cm的培養(yǎng)缽中。

2、扦插枝條的消毒處理

將冬眠的美洲黑楊穗條剪成15cm長(zhǎng)度，自來(lái)水沖洗，并用軟毛刷清除表面污垢。之后，將穗條全部浸入抗生素消毒混合液(200mg/L兩性霉素B和100mg/L硫酸鏈霉素?zé)o菌水溶液)中，處理24小時(shí)。用無(wú)菌濾紙吸干穗條表面水分，并將穗條頂端0.5cm浸入融化的石蠟中，進(jìn)行頂端封臘處理。處理后的穗條扦插到上述營(yíng)養(yǎng)缽中，放置于控溫自動(dòng)化日光溫室中，溫度25-28℃，期間進(jìn)行日常的肥水管理和病蟲(chóng)害防治。

3、外植體的選擇和消毒預(yù)處理

扦插30天后，選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害、腋芽飽滿的美洲黑楊半木質(zhì)化新發(fā)枝條，進(jìn)行抗生素消毒預(yù)處理。方法是將半木質(zhì)化新發(fā)枝條底端插入含有100mg/L兩性霉素B和50mg/L硫酸鏈霉素?zé)o菌水溶液中處理12小時(shí)。

新發(fā)枝條抗生素消毒預(yù)處理后，用醫(yī)用手術(shù)剪去除幼嫩的尖端及葉片，保留2mm的葉柄，用1％的洗潔精溶液清洗，并用流動(dòng)的自來(lái)水充分沖洗，之后用濾紙吸干外植體表面水分，放入超凈臺(tái)中。

4、外植體的酒精滅菌處理

在無(wú)菌條件下，用高溫消毒后的醫(yī)用手術(shù)剪刀將外植體剪成2-3cm的莖段，確保每個(gè)莖段有1-2個(gè)飽滿的腋芽。將莖段放入大滅菌后的玻璃培養(yǎng)皿中，倒入75％的酒精，輕輕晃動(dòng)，約30秒后，迅速取出。

5、外植體的次氯酸鈉滅菌處理

將上述莖段移入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，倒入30-50ml添加0.1％吐溫20的10％次氯酸鈉，消毒8-10分鐘，期間輕輕晃動(dòng)2-3次。

將上述莖段移入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌水沖洗外植體3次，用滅菌的濾紙吸干外植體表面的水分。

6、外植體的培養(yǎng)

將上述處理的莖段置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用滅菌過(guò)的醫(yī)用手術(shù)剪刀，將與消毒劑接觸過(guò)的莖段兩端界面切除1-1.5mm，之后接種在MS啟動(dòng)培養(yǎng)基中。

將培養(yǎng)瓶移入組織培養(yǎng)箱，設(shè)置培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為光周期16h/8h，光照強(qiáng)度2500Lux，培養(yǎng)溫度為27℃/21℃。

7、外植體培養(yǎng)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

培養(yǎng)5-10天后，統(tǒng)計(jì)美洲黑楊外植體表面污染情況；培養(yǎng)30-40天后，統(tǒng)計(jì)外植體內(nèi)生菌污染、成活及生長(zhǎng)狀況。不同消毒方法的結(jié)果比對(duì)具體如表1所示。

不同處理方式下，美洲黑楊莖段外植體生長(zhǎng)及染菌情況如附圖2所示。

表1不同消毒方法結(jié)果對(duì)比

注：1：常規(guī)消毒方法；2：本發(fā)明的消毒方法。