本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因棉花技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高成活率的轉(zhuǎn)基因棉花再生株移栽法。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)的棉花農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化研究使用下胚軸為外植體，其轉(zhuǎn)化和再生經(jīng)歷體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑，再生植株的高頻轉(zhuǎn)化再生體系等。受轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)、成胚率低、易出現(xiàn)畸形胚、體細(xì)胞胚植株再生比例低和缺乏莖的伸長(zhǎng)等多因素的限制，獲得轉(zhuǎn)基因再生株的整個(gè)過程相對(duì)較長(zhǎng)。一般從農(nóng)桿菌共培養(yǎng)開始，到獲得完整再生幼苗需8～12個(gè)月。在此基礎(chǔ)上，通過分子檢測(cè)證實(shí)目的基因已經(jīng)成功導(dǎo)入受體的轉(zhuǎn)基因再生苗就更為珍貴。盡管如此，轉(zhuǎn)基因再生苗只有移栽成活才能真正實(shí)現(xiàn)進(jìn)入常規(guī)遺傳育種應(yīng)用。因此，提高轉(zhuǎn)基因再生株的移植成活率一直是棉花轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域非常重要的研究環(huán)節(jié)。目前，轉(zhuǎn)基因棉花再生株的移植主要采用常規(guī)移栽法和嫁接法。

李燕娥等(2010)報(bào)道了轉(zhuǎn)基因棉花再生株的常規(guī)移栽法，其主要程序包括：轉(zhuǎn)基因再生株生根苗打開瓶蓋→培養(yǎng)間煉苗1-2天→洗去再生株根部培養(yǎng)基→栽入裝有滅菌的土壤或砂土中→一次性澆透水→放入濕度70％、溫度27℃～29℃培養(yǎng)箱中先整株蓋株培養(yǎng)8～10天，然后移去蓋株的容器，再在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天左右→移入溫室或網(wǎng)室中至棉花吐絮成熟(李燕娥,上官小霞,吳霞等.一種轉(zhuǎn)基因棉花再生株移植法.專利公告號(hào)CN 101773039A)。

陳天子等(2013)也報(bào)道了轉(zhuǎn)基因棉花再生幼苗簡(jiǎn)易移栽方法。其主要程序包括：將有健壯根系的再生幼苗，直接移栽到商品化的有機(jī)栽培基質(zhì)，移栽后保濕14d左右再緩慢透氣7d左右、溫度控制在25～30℃相對(duì)穩(wěn)定的溫度范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)基因棉花再生幼苗移栽成活(陳天子，秦郁，張保龍.轉(zhuǎn)基因棉花再生幼苗簡(jiǎn)易移栽方法.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013,41(11):87-89)。

王清連等(1999)報(bào)道的轉(zhuǎn)基因棉花再生株嫁接法，其主要程序包括：在溫室或網(wǎng)室把轉(zhuǎn)基因棉花再生株嫁接在盆缽內(nèi)種植的(棉花)砧木上，然后用塑料薄膜(或特殊容器)包裹整株棉花苗，7天后逐步放風(fēng)，最后取掉包裹的塑料薄膜或容器(王清連,張寶紅,劉方。一種適用于再生植株和轉(zhuǎn)基因移栽的新方法。河南職技師院學(xué)報(bào)，1999，27(3):27～29)。

由于經(jīng)過組織培養(yǎng)再生體系獲得的轉(zhuǎn)基因棉花再生株長(zhǎng)勢(shì)較弱，根系不發(fā)達(dá)。利用前人報(bào)道的常規(guī)移栽法獲得的轉(zhuǎn)基因再生株成活率一般50％～80％，跨度較大，程序也較繁瑣；而轉(zhuǎn)基因棉花再生株嫁接法對(duì)于操作人員的技術(shù)要求較高，工作量較大。要求轉(zhuǎn)基因再生苗和砧木的長(zhǎng)勢(shì)大小要協(xié)調(diào)，符合嫁接要求，在時(shí)間上不好控制。同時(shí)，嫁接苗與砧木在包裹的環(huán)境中極易發(fā)生腐爛，特別在夏季高溫季節(jié)腐爛更為突出。為有效避免上述弊端，簡(jiǎn)化操作程序，提高棉花再生植株和轉(zhuǎn)基因苗的移栽成活率，我們發(fā)明了一種高成活率的轉(zhuǎn)基因棉花再生株移栽法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高成活率的轉(zhuǎn)基因棉花再生株移栽法，它能有效解決背景技術(shù)中所存在的問題，簡(jiǎn)便易操作，大大提高了棉花再生植株和轉(zhuǎn)基因苗的移栽成活率。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種高成活率的轉(zhuǎn)基因棉花再生株移栽法，將轉(zhuǎn)基因棉花再生株生根苗從培養(yǎng)基中取出，洗凈再生株根部的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至新的栽培容器中，向栽培容器中加水至浸沒再生株根部進(jìn)行水培煉苗，經(jīng)水培煉苗，生長(zhǎng)健壯的轉(zhuǎn)基因植株移栽到基質(zhì)或土壤中，培養(yǎng)至棉花吐絮成熟。

上述高成活率的轉(zhuǎn)基因棉花再生株移栽法，包括以下步驟：

(1)將轉(zhuǎn)基因棉花再生株生根苗從培養(yǎng)基中取出，洗凈再生株根部的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至新的栽培容器中，向栽培容器中加水至浸沒再生株根部進(jìn)行水培煉苗；

(2)將轉(zhuǎn)基因棉花再生株在濕度60％～70％、溫度為27℃～29℃、光照為白天/晚上16h/8h，12000～15000Lx的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；每隔2～3天更換一次栽培容器中的水，直至轉(zhuǎn)基因再生株植株健壯，生長(zhǎng)出更多根系；

(3)經(jīng)水培煉苗后的轉(zhuǎn)基因再生株移栽到基質(zhì)或土壤中，培養(yǎng)至棉花吐絮成熟。

上述的高成活率的轉(zhuǎn)基因棉花再生株移栽法，根據(jù)再生株的根系及幼苗生長(zhǎng)情況確定水培煉苗的天數(shù)，一般水培煉苗7～15天。

上述的高成活率的轉(zhuǎn)基因棉花再生株移栽法，所述的水為自來水。

上述的高成活率的轉(zhuǎn)基因棉花再生株移栽法，所述的栽培容器為三角瓶。

本發(fā)明高成活率的轉(zhuǎn)基因棉花再生株移栽法的詳細(xì)步驟為：

待轉(zhuǎn)基因棉花再生株生根苗在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至三角瓶瓶蓋，將再生株根部的培養(yǎng)基洗凈，移栽到一個(gè)空三角瓶中，裝入適量的自來水浸沒再生株根部。在濕度60％～70％、溫度27℃～29℃、光照(白天/晚上：16h/8h,12000～15000Lx)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2～3天更換一次三角瓶中的自來水，直至轉(zhuǎn)基因再生株植株健壯，生長(zhǎng)出更多根系。根據(jù)再生株的根系及幼苗生長(zhǎng)情況決定具體培養(yǎng)天數(shù)，一般培養(yǎng)7～15天。經(jīng)水培煉苗后的轉(zhuǎn)基因再生株移栽到基質(zhì)或土壤中，在正常條件的溫室或網(wǎng)室中成活，直到棉花吐絮成熟。

選擇轉(zhuǎn)基因棉花再生株生根苗，歷經(jīng)上述培養(yǎng)基培養(yǎng)——根部培養(yǎng)基洗凈——水培煉苗——基質(zhì)/土壤移栽等步驟后，繼續(xù)在溫室中培養(yǎng)15天，統(tǒng)計(jì)移栽成活率。每次移栽50株，共設(shè)計(jì)6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，每批次移栽成活率均非常高，6次重復(fù)的平均成活率達(dá)98.67％(表1)。該方法簡(jiǎn)便易操作，可高效、安全地用于轉(zhuǎn)基因再生株的移栽，確保轉(zhuǎn)基因再生株的正常生長(zhǎng)發(fā)育。

表1轉(zhuǎn)基因棉花再生株移栽成活率評(píng)價(jià)

本發(fā)明旨在提高轉(zhuǎn)基因棉花再生株的移栽苗成活率。在轉(zhuǎn)基因棉花再生株生根苗從培養(yǎng)基到基質(zhì)/土壤的移栽過程中，增加自來水煉苗環(huán)節(jié)，能夠增強(qiáng)移栽苗的長(zhǎng)勢(shì)及根系密集程度，培養(yǎng)健壯苗。避免了再生株直接從培養(yǎng)基移栽到基質(zhì)/土壤中，容易使根部和莖部腐爛的難題。利用本發(fā)明的方法，其移栽苗成活率達(dá)到98％以上，且操作方法簡(jiǎn)單易行。

采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有以下有益效果：

1)將培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因棉花再生株首先洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到裝自來水的三角瓶中培養(yǎng)1-2周，避免攜帶培養(yǎng)基帶來的污染，使再生株的根系發(fā)達(dá)，植株長(zhǎng)勢(shì)增強(qiáng)；

2)水培移栽法可使再生株從培養(yǎng)基生長(zhǎng)條件向自然生長(zhǎng)條件過渡間有一個(gè)緩沖階段，為更好的適應(yīng)自然環(huán)境奠定基礎(chǔ)；

3)解決了再生株直接從培養(yǎng)基移栽到基質(zhì)/土壤中，容易使根部和莖部腐爛，不易成活的難題。

4)轉(zhuǎn)基因再生株移栽用的基質(zhì)/土壤無需滅菌，無需地膜或燒杯等大量容器保濕，操作方法簡(jiǎn)便易行。

5)為珍貴的轉(zhuǎn)基因棉花再生苗提供了一種高成活率的移栽法。利用本發(fā)明的方法，其移栽苗成活率達(dá)到98％以上。

附圖說明

圖1剛從培養(yǎng)基中移栽到裝有自來水的三角瓶中的轉(zhuǎn)基因棉花再生株

圖2經(jīng)水培煉苗15天后的轉(zhuǎn)基因棉花幼苗生長(zhǎng)發(fā)育表現(xiàn)

圖3轉(zhuǎn)基因棉花再生株水培煉苗后移栽至基質(zhì)或土壤中生長(zhǎng)一周的生長(zhǎng)發(fā)育表現(xiàn)

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(1)待轉(zhuǎn)基因棉花再生株生根苗在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至三角瓶瓶蓋，將再生株根部的培養(yǎng)基洗凈，移栽到一個(gè)空三角瓶中，裝入適量的(浸沒再生株根部)自來水(如圖1為剛從培養(yǎng)基中移栽到自來水瓶中的轉(zhuǎn)基因棉花再生株)進(jìn)行水培煉苗。

(2)在濕度60％～70％、溫度27℃～29℃、光照(白天/晚上：16h/8h,12000～15000Lx)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2～3天更換一次三角瓶中的自來水，培養(yǎng)15天，直至轉(zhuǎn)基因再生株植株健壯，生長(zhǎng)出更多根系(圖2為經(jīng)水培煉苗15天后的轉(zhuǎn)基因棉花幼苗)。

(3)水培煉苗后的轉(zhuǎn)基因再生株移栽到基質(zhì)或土壤中，在正常條件的溫室或網(wǎng)室中成活，移栽一周后，生長(zhǎng)健壯的轉(zhuǎn)基因棉花幼苗(圖3為移栽一周后，生長(zhǎng)健壯的轉(zhuǎn)基因棉花幼苗)。進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育，直到棉花吐絮成熟。

本發(fā)明在轉(zhuǎn)基因棉花再生株生根苗從培養(yǎng)基到基質(zhì)/土壤的移栽過程中，增加自來水煉苗環(huán)節(jié)，能夠增強(qiáng)移栽苗的長(zhǎng)勢(shì)及根系密集程度，培養(yǎng)健壯苗。避免了再生株直接從培養(yǎng)基移栽到基質(zhì)/土壤中，容易使根部和莖部腐爛的難題。利用本發(fā)明的方法，其移栽苗成活率達(dá)到98％以上，且操作方法簡(jiǎn)單易行。