本發(fā)明涉及一種綿羊顆粒凍精的一體化裝置及其應用方法。

背景技術：

精液的冷凍保存在現(xiàn)代畜牧業(yè)中起著十分重要作用。凍精的使用可最大限度提高優(yōu)良種畜的利用率，同時在品種改良，瀕危動物保護上也具有極其重要意義。

從世界范圍看，綿羊精子冷凍技術研究進展緩慢，主要在冷凍程序、稀釋液配方、和授精方法幾方面存在技術問題，導致綿羊凍精的產業(yè)化應用無法推廣。由于綿羊精液冷凍具有潛在的巨大商業(yè)價值和重要的現(xiàn)實意義，因此，凍精制作工藝的改進創(chuàng)新具有研究的重要性和必要性，目前仍是動物繁殖領域內研究熱點和難點。

凍精的制作主要有兩種方法：顆粒凍精和細管凍精。雖然細管凍精是目前產業(yè)應用的主流方法，技術也相對成熟，但綿羊凍精生產遠遠落后于高度市場化、產業(yè)化的牛凍精；綿羊凍精產業(yè)化程度低，這主要由市場、技術等因素所決定，市面上并不能或很難購買到商品化綿羊細管凍精。目前，綿羊冷配仍多以自行冷凍的顆?；蚣毠軆鼍灶w粒凍精為主。與細管凍精的制作相比較，顆粒凍精方法具有操作簡單、冷凍時間短、成本低廉等優(yōu)點。但仍存在以下缺陷：1、無標準的顆粒凍精制作與儲存裝置，基本都是就地取材；凍精儲存不科學，容易造成顆粒表面脫落。2、冷凍和保存需要單獨操作，無法對顆粒一對一信息標記；3、凍精顆粒大小、形狀不規(guī)范，顆粒間凍精活力差異大，重復性差。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有制作綿羊顆粒凍精存在儲存不科學、信息標記困難、顆粒不規(guī)則和易破損的問題，而提供一種綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置及其應用方法。

本發(fā)明一種綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置，它由冷凍氟板、冷凍支架、冷凍托架和保存提漏四部分組成；

所述冷凍氟板：邊長5cm、厚度0.1cm的正方形，冷凍氟板的四角分別設置直徑0.2cm的穿孔，穿孔的中心距離邊距1cm，冷凍氟板的中央平均分布16個直徑為0.25cm的半球型冷凍槽；冷凍氟板厚度為0.1cm，底部設置高度0.1cm的底座；半球型冷凍槽與冷凍氟板邊間、半球型冷凍槽之間覆蓋單面膠紙；

冷凍支架：支架鐵芯高20cm，四根支架鐵芯分別從冷凍氟板的穿孔穿過；支架鐵芯最高點記為第0cm，在第18cm處焊接固定裝置；

冷凍托架：托架高8cm，邊長4cm，四根托架的頂端分別設置支架插槽，底端設置微型腳托；

冷凍提漏：提漏高20cm，邊長6cm，底部密封；提漏提手總長度50cm，提漏提手的底部10cm的長度用于焊接在提漏外側面中間位置，其余40cm長度高出提漏，并在提漏提手的頂端設置掛鉤。

上述綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置的應用方法，按以下步驟進行：

一、利用假陰道方法收集綿羊精液，然后用預熱至40℃的冷凍稀釋液進行2倍的稀釋；

二、冷凍：將步驟一稀釋后的綿羊精液樣品裹8-10層紗布并置于4℃冰箱中平衡2h；平衡過程中，在泡沫盒中注入6cm高度的液氮，把冷凍托架放置于泡沫盒子中央，然后把支架鐵芯插入支架插槽；

在第一塊冷凍氟板的單面膠紙上標記待冷凍精液信息，用鑷子夾著第一塊冷凍氟板穿過支架鐵芯固定于18cm處的固定裝置，此位置距離液氮面4cm，預冷3-5min后，用250μL移液器在每個半球型冷凍槽中滴入0.1mL平衡后的精液；

在第二塊冷凍氟板的單面膠紙上標記待冷凍精液信息，置于第一塊冷凍氟板上；預冷3-5min后，用250μL移液器在每個半球型冷凍槽中滴入0.1mL平衡后的精液，重復操作至放入第5塊氟板后，添加液氮，重新校對液氮面與待滴定冷凍氟板高度至4cm，重復滴入精液疊加冷凍氟板的步驟至距離支架鐵芯頂端1cm處結束，液氮熏蒸5min，然后用大鑷子把帶有冷凍氟板的冷凍支架從冷凍托架中提出，放入裝滿液氮的冷凍提漏中，提漏掛置于裝滿液氮的罐口；

三、解凍：在液氮中提出冷凍提漏，上提冷凍支架，然后用鑷子捏取凍精顆粒，在空氣中停留20s，平行的浸入40℃解凍液中10s，搖動至融化，完成解凍；

其中步驟一中冷凍稀釋液由94mL基礎稀釋液和6mL甘油組成；基礎稀釋液按體積比80:20由基礎液和卵黃組成，所述基礎液由3.2g葡萄糖、3.2g檸檬酸鈉、10IU青霉素和10IU鏈霉素溶于100mL超純水制成；

步驟三中解凍液按體積比80:20由基礎液和卵黃組成，所述基礎液由3.2g葡萄糖、3.2g檸檬酸鈉、10IU青霉素和10IU鏈霉素溶于100mL超純水制成。

本發(fā)明與傳統(tǒng)凍精顆粒冷凍裝置和方法相比，優(yōu)點如下：

1、本發(fā)明集冷凍與保存一體化，凍精制作步驟簡化、規(guī)范，精液信息詳細。顆粒凍精制作的傳統(tǒng)方法通常是在鋁飯盒蓋子上滴定精液，普遍存在劑型規(guī)格不標準的缺陷，需要重新收集后存放于紗布袋，再放入液氮，無法標記。本發(fā)明在精子冷凍完成后，無需重新收集，直接放入液氮，并且在冷凍氟板標記精液詳細信息。凍精顆粒大小、形態(tài)規(guī)則。

2、顆粒凍精制作的傳統(tǒng)方法，在冷凍后將顆粒收集在紗布袋中，由于儲存和運輸過程中，顆粒間碰撞和摩擦，表面脫落嚴重，剝落的細微顆粒和碎片，懸浮在液氮中，極易造成品種混雜的現(xiàn)象。本發(fā)明完全克服這一缺點，顆粒間無直接接觸。

3、本發(fā)明凍精顆粒容量大，裝置所采用材料均為普通金屬，成本低廉。按上述冷凍裝置規(guī)格，冷凍精液體積：144mL＝16(孔/氟板)×0.1(mL精液/孔)×90(片氟板/18cm)，每套冷凍支架可冷凍精液公羊只數：72只＝144mL÷2(冷凍前稀釋2倍)÷1mL(平均射精量1mL/只)。

4、本發(fā)明顯著降低冷凍保護劑毒性影響。目前，無論是細管凍精還是顆粒凍精，均采用6％-8％的甘油作為冷凍保護劑冷凍。本發(fā)明在冷凍前，采用0.1mL 6％甘油濃度的冷凍液稀釋，解凍時采用0.2mL無甘油解凍液再次稀釋，甘油終濃度為1.5％，有效降低了甘油的毒性危害。

5、由于市面液氮罐口徑大小不一，本裝置型號可根據液氮罐口徑靈活定制；另外，本發(fā)明結構簡單，操作方便，基層技術人員可迅速完全掌握，無需專門培訓。

6、社會效益及經濟效益：

本發(fā)明主要應用于綿羊精液的超低溫冷凍保存。隨著養(yǎng)羊產業(yè)的快速發(fā)展，綿羊凍精在迅速擴群、雜交改良上的應用越來越重要，因此本發(fā)明具有廣闊的市場前景。目前國內外尚無與此相同的裝置。

目前全國從事綿羊生產的公司和機構，普遍存在擴繁速度緩慢，品種改良困難的問題，綿羊凍精無法推廣應用是關鍵原因。近年來，綿羊精液冷凍方面的研究也沒有得到足夠的重視，通過改進冷凍方案和冷凍裝置提高凍精品質勢在必行。因此本發(fā)明具有可觀的經濟效益、良好的社會效益和潛在的應用價值。

本發(fā)明對改善綿羊凍精品質、推動凍精產業(yè)化應用具有重要意義，可顯著提高優(yōu)良公畜的利用率、減少飼養(yǎng)量，尤其是在中小規(guī)模羊場、養(yǎng)殖散戶以及放牧模式下具有更大利用空間，具有廣闊的市場應用前景。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置中冷凍氟板的示意圖，其中1表示穿孔，2表示半球型冷凍槽，3表示底座，4表示單面膠紙；

圖2是本發(fā)明中綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置中冷凍氟板、冷凍支架與冷凍托架的示意圖，其中5表示支架鐵芯，6表示托架，7表示支架插槽，8表示微型腳托；

圖3是本發(fā)明中綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置中冷凍提漏的示意圖，其中9表示提漏，10表示提漏提手，11表示掛鉤。

具體實施方式

本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。

具體實施方式一：結合圖1、2和3所示，本實施方式一種綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置，它由冷凍氟板、冷凍支架、冷凍托架和保存提漏四部分組成；

所述冷凍氟板：邊長5cm、厚度0.1cm的正方形，冷凍氟板的四角分別設置直徑0.2cm的穿孔1，穿孔1的中心距離邊距1cm，冷凍氟板的中央平均分布16個直徑為0.25cm的半球型冷凍槽2；冷凍氟板厚度為0.1cm，底部設置高度0.1cm的底座3；半球型冷凍槽2與冷凍氟板邊間、半球型冷凍槽2之間覆蓋單面膠紙4；

冷凍支架：支架鐵芯5高20cm，四根支架鐵芯5分別從冷凍氟板的穿孔1穿過；支架鐵芯5最高點記為第0cm，在第18cm處焊接固定裝置；

冷凍托架：托架6高8cm，邊長4cm，四根托架6的頂端分別設置支架插槽7，底端設置微型腳托8；

冷凍提漏：提漏9高20cm，邊長6cm，底部密封；提漏提手10總長度50cm，提漏提手10的底部10cm的長度用于焊接在提漏9外側面中間位置，其余40cm長度高出提漏9，并在提漏提手10的頂端設置掛鉤11。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是，所述半球型冷凍槽2用于滴定待冷凍的精液。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是，所述冷凍氟板的底座3用于是防止冷凍過程中相鄰的兩塊冷凍氟板大面積接觸而產生粘連。其它與具體實施方式一或二相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一至三之一不同的是，所述單面膠紙4用于記錄精液信息。其它與具體實施方式一至三之一相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一至四之一不同的是，所述掛鉤11用于固定在液氮罐口。其它與具體實施方式一至四之一相同。

具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是，所述固定裝置用于固定安裝冷凍氟板，冷凍氟板可依次疊加安裝。其它與具體實施方式一至五之一相同。

具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式一至六之一不同的是，所述支架插槽7用于支架鐵芯5的插拔。其它與具體實施方式一至六之一相同。

具體實施方式八：本實施方式綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置的應用方法，按以下步驟進行：

一、利用假陰道方法收集綿羊精液，然后用預熱至40℃的冷凍稀釋液進行2倍的稀釋；

二、冷凍：將步驟一稀釋后的綿羊精液樣品裹8-10層紗布并置于4℃冰箱中平衡2h；平衡過程中，在泡沫盒中注入6cm高度的液氮，把冷凍托架放置于泡沫盒子中央，然后把支架鐵芯5插入支架插槽7；

在第一塊冷凍氟板的單面膠紙4上標記待冷凍精液信息，用鑷子夾著第一塊冷凍氟板穿過支架鐵芯5固定于18cm處的固定裝置，此位置距離液氮面4cm，預冷3-5min后，用250μL移液器在每個半球型冷凍槽2中滴入0.1mL平衡后的精液；

在第二塊冷凍氟板的單面膠紙4上標記待冷凍精液信息，置于第一塊冷凍氟板上；預冷3-5min后，用250μL移液器在每個半球型冷凍槽2中滴入0.1mL平衡后的精液，重復操作至放入第5塊氟板后，添加液氮，重新校對液氮面與待滴定冷凍氟板高度至4cm，重復滴入精液疊加冷凍氟板的步驟至距離支架鐵芯5頂端1cm處結束，液氮熏蒸5min，然后用大鑷子把帶有冷凍氟板的冷凍支架從冷凍托架中提出，放入裝滿液氮的冷凍提漏中，提漏掛置于裝滿液氮的罐口；

三、解凍：在液氮中提出冷凍提漏，上提冷凍支架，然后用鑷子捏取凍精顆粒，在空氣中停留20s，平行的浸入40℃解凍液中10s，搖動至融化，完成解凍；

其中步驟一中冷凍稀釋液由94mL基礎稀釋液和6mL甘油組成；基礎稀釋液按體積比80:20由基礎液和卵黃組成，所述基礎液由3.2g葡萄糖、3.2g檸檬酸鈉、10IU青霉素和10IU鏈霉素溶于100mL超純水制成；

步驟三中解凍液按體積比80:20由基礎液和卵黃組成，所述基礎液由3.2g葡萄糖、3.2g檸檬酸鈉、10IU青霉素和10IU鏈霉素溶于100mL超純水制成。

本實施方式步驟二中預冷3-5min后冷凍氟板的溫度達到-120℃—-130℃。

本實施方式中上提冷凍支架必須保證冷凍提漏中裝滿液氮。

本實施方式中平行的浸入是指凍精顆粒的上、下表面與解凍液面平行。

本實施方式中解凍完成后將冷凍氟板從冷凍支架取出，去除單面膠紙，清洗消毒，備于下次使用。

具體實施方式九：本實施方式與具體實施方式八不同的是，步驟二中每一塊使用的冷凍氟板的單面膠紙4上均要標記待冷凍精液信息；標記待冷凍精液信息為公羊品種、公羊耳標號和冷凍日期。其它步驟及參數與具體實施方式八相同。

具體實施方式十：本實施方式與具體實施方式八或九不同的是，步驟三解凍液中精子的終濃度為原精稀釋6倍。其它步驟及參數與具體實施方式八或九相同。

采用以下實施例驗證本發(fā)明的有益效果：

實施例：

結合圖1、2和3所示，本實施方式一種綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置，它由冷凍氟板、冷凍支架、冷凍托架和保存提漏四部分組成；

所述冷凍氟板：邊長5cm、厚度0.1cm的正方形，冷凍氟板的四角分別設置直徑0.2cm的穿孔1，穿孔1的中心距離邊距1cm，冷凍氟板的中央平均分布16個直徑為0.25cm的半球型冷凍槽2；冷凍氟板厚度為0.1cm，底部設置高度0.1cm的底座3；半球型冷凍槽2與冷凍氟板邊間、半球型冷凍槽2之間覆蓋單面膠紙4；

冷凍支架：支架鐵芯5高20cm，四根支架鐵芯5分別從冷凍氟板的穿孔1穿過；支架鐵芯5最高點記為第0cm，在第18cm處焊接固定裝置；

冷凍托架：托架6高8cm，邊長4cm，四根托架6的頂端分別設置支架插槽7，底端設置微型腳托8；

冷凍提漏：提漏9高20cm，邊長6cm，底部密封；提漏提手10總長度50cm，提漏提手10的底部10cm的長度用于焊接在提漏9外側面中間位置，其余40cm長度高出提漏9，并在提漏提手10的頂端設置掛鉤11。

綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置的應用方法，按以下步驟進行：

一、利用假陰道方法收集綿羊精液，然后用預熱至40℃的冷凍稀釋液進行2倍的稀釋；

二、冷凍：將步驟一稀釋后的綿羊精液樣品裹8層紗布并置于4℃冰箱中平衡2h；平衡過程中，在泡沫盒中注入6cm高度的液氮，把冷凍托架放置于泡沫盒子中央，然后把支架鐵芯5插入支架插槽7；

在第一塊冷凍氟板的單面膠紙4上標記待冷凍精液信息，用鑷子夾著第一塊冷凍氟板穿過支架鐵芯5固定于18cm處的固定裝置，此位置距離液氮面4cm，預冷3min后，用250μL移液器在每個半球型冷凍槽2中滴入0.1mL平衡后的精液；

在第二塊冷凍氟板的單面膠紙4上標記待冷凍精液信息，置于第一塊冷凍氟板上；預冷3-5min后，用250μL移液器在每個半球型冷凍槽2中滴入0.1mL平衡后的精液，重復操作至放入第5塊氟板后，添加液氮，重新校對液氮面與待滴定冷凍氟板高度至4cm，重復滴入精液疊加冷凍氟板的步驟至距離支架鐵芯5頂端1cm處結束，液氮熏蒸5min，然后用大鑷子把帶有冷凍氟板的冷凍支架從冷凍托架中提出，放入裝滿液氮的冷凍提漏中，提漏掛置于裝滿液氮的罐口；

三、解凍：在液氮中提出冷凍提漏，上提冷凍支架，然后用鑷子捏取凍精顆粒，在空氣中停留20s，平行的浸入40℃解凍液中10s，搖動至融化，完成解凍；

其中步驟一中冷凍稀釋液由94mL基礎稀釋液和6mL甘油組成；基礎稀釋液按體積比80:20由基礎液和卵黃組成，所述基礎液由3.2g葡萄糖、3.2g檸檬酸鈉、10IU青霉素和10IU鏈霉素溶于100mL超純水制成；

步驟三中解凍液按體積比80:20由基礎液和卵黃組成，所述基礎液由3.2g葡萄糖、3.2g檸檬酸鈉、10IU青霉素和10IU鏈霉素溶于100mL超純水制成。

本實施例步驟二中預冷3min后冷凍氟板的溫度達到-120℃。

本實施例中上提冷凍支架必須保證冷凍提漏中裝滿液氮。

本實施例中平行的浸入是指凍精顆粒的上、下表面與解凍液面平行。

本實施例中解凍完成后將冷凍氟板從冷凍支架取出，去除單面膠紙，清洗消毒，備于下次使用。

本實施例中集冷凍與保存一體化，凍精制作步驟簡化、規(guī)范，精液信息詳細。凍精顆粒大小、形態(tài)規(guī)則。顆粒間無直接接觸，不會造成品種混雜的現(xiàn)象。