本發(fā)明涉及一種小孢子材料的獲取方法，更具體地說涉及一種在冬季獲取青花菜小孢子材料的方法。

背景技術(shù)：

青花菜又名西蘭花、綠菜花、莖椰菜等，是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種中以綠色花球?yàn)楫a(chǎn)品器官的一、二生草本植物，其以主莖及側(cè)枝頂端形成的綠色花球?yàn)楫a(chǎn)品，營養(yǎng)豐富，色、香、味具佳，是國際市場十分暢銷的一種名特蔬菜。

自1982年Lichter首次報(bào)道油菜游離小孢子培養(yǎng)獲得再生植株以來，蕓薹屬作物，尤其是油菜的小孢子培養(yǎng)，無論是在出胚率、出胚量，還是胚培養(yǎng)及再生植株方面都獲得了很大的成功。相對于甘藍(lán)型油菜、結(jié)球甘藍(lán)等作物，青花菜游離小孢子的培養(yǎng)難度較大。

而且，在青花菜的正常開花季節(jié)，可以大量獲得小孢子；但當(dāng)合適的花期季節(jié)一過，進(jìn)入秋冬季后，由于外界栽培條件不允許，無法正常抽出合適做小孢子的花蕾，進(jìn)而無法在冬季獲得青花菜小孢子，為創(chuàng)制DH(雙單倍體)材料提供資源，這給青花菜小孢子培養(yǎng)育種技術(shù)帶來了更多困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)不能在冬季獲得小孢子材料的不足，本發(fā)明目的是提供一種方法，該方法能夠在冬季無法正常開花的季節(jié)，提供正常開花的小孢子材料，為創(chuàng)制DH提供資源。

本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種在冬季獲取青花菜小孢子 材料的方法，所述方法主要包括以下步驟：

a.播種：在溫室大棚中，準(zhǔn)備好穴盤，在穴盤中裝滿栽培基質(zhì)，并用水澆透，將青花菜種子淺層播種于穴盤內(nèi)；

b.催芽：將上述播種有青花菜種子的穴盤放置溫床上催芽，催芽溫度控制在白天20～25℃，夜間10～15℃；在催芽期間，根據(jù)基質(zhì)干濕情況澆水管理；

c.定植：待到長出2～3片真葉時(shí)，定植栽培于基質(zhì)營養(yǎng)杯中，并根據(jù)基質(zhì)干濕情況，定期澆灌營養(yǎng)液MB1，控制環(huán)境溫度和濕度，從而達(dá)到滿足其營養(yǎng)生長所需條件；

d.低溫春化：待到真葉長出14～16片營養(yǎng)生長結(jié)束后，控制環(huán)境溫度在8～15℃，低溫春化誘導(dǎo)其進(jìn)入生殖生長，春化作用20天左右，期間并配合澆灌營養(yǎng)液MB2；

e.栽培：待到花球形成后，根據(jù)基質(zhì)干濕情況，配合澆灌營養(yǎng)液MB3繼續(xù)栽培；控制大棚內(nèi)的環(huán)境溫度為20～25℃，獲得正?；ɡ?；

f.提取小孢子：選取長度合適的花蕾，將花蕾經(jīng)過消毒、抽提花粉，即可在冬季獲得青花菜的小孢子材料。

所述培養(yǎng)液MB1的具體組成如下：以一立方米水計(jì)，其中含有硝酸鉀1.6kg、硝酸銨1.4kg、氯化鈣0.5kg、硫酸鎂0.37kg、磷酸二氫鈉2.15kg、肌醇50g、硫酸亞鐵28g、乙二胺四乙酸二鈉40g、硫酸錳22g、硫酸鋅9g、硼酸鈉6g、碘化鉀1g、甘氨酸2g、鉬酸鈉0.25g、硫酸銅0.5g、氯化鈷0.5g。

所述培養(yǎng)液MB2的具體組成如下：以一立方米水計(jì)，其中含有氯化鉀1.05kg、硝酸銨1.5kg、氯化鈣0.5kg、硫酸鎂0.37kg、磷酸二氫鈉2.5kg、肌醇30g、硫酸亞鐵28g、乙二胺四乙酸二鈉40g、硫酸錳22g、硫酸鋅9g、硼酸鈉10g、碘化鉀1g、甘氨酸2g、鉬酸鈉0.35g、硫酸銅0.5g、氯化鈷0.5g。

所述培養(yǎng)液MB3的具體組成如下：以一立方米水計(jì)，其中含有氯化鉀1kg、硝酸銨1.15kg、氯化鈣0.5kg、硫酸鎂0.37kg、磷酸二氫鈉2.9kg、肌醇10g、硫酸亞鐵28g、乙二胺四乙酸二鈉40g、硫酸錳22g、硫酸鋅9g、硼酸鈉12g、碘化鉀1g、甘氨酸2g、鉬酸鈉0.5g、硫酸銅0.5g、氯化鈷0.5g。

上述小孢子的提取方法具體包括以下內(nèi)容：

(1)選蕾：選取生長良好長度為2.5～3.5mm的主花序花蕾，或者是選取長度為3.5～4mm的側(cè)枝花蕾；

(2)消毒：將上述選取好的花蕾用酒精消毒30～40S，然后用次氯酸鈉消毒10min，最后用無菌水清洗3次，每次5min；

(3)抽提花粉：將滅過菌的花蕾放置于離心管中，加入1～2mL B5培養(yǎng)液，用玻璃棒研磨使花粉散出，研磨至糊狀，在管中加入半吸管B5培養(yǎng)液，倒入過濾器過濾，將濾液盛入10mL的離心管中；加入B5培養(yǎng)液沖洗過濾器中的花粉，沖2～3次后，合并濾液，在10mL離心管中將花粉懸浮液稀釋；

將花粉懸浮液800轉(zhuǎn)/min下離心處理5min；將離心管中的上層清液除去，再加液體B5培養(yǎng)液，并將沉淀的花粉用吸管沖散，再次懸浮離心，除去上清液；

將沉淀的花粉用NLN-13培養(yǎng)液稀釋，稀釋后的懸浮液分裝入6cm培養(yǎng)皿，一般每皿加入懸浮液5mL左右，每mL含花蕾大約1.5～2個，用封口膜封口，便可得到所需的小孢子材料；該小孢子材料在培養(yǎng)皿內(nèi)可繼續(xù)培養(yǎng)成胚狀體。

進(jìn)一步地，所述消毒步驟中采用的酒精的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為75％，所述消毒步驟中采用的次氯酸鈉的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2％。

本發(fā)明的有益效果是：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過無土栽培技術(shù)在冬季的溫室大棚內(nèi)栽培出適合做小孢子材料的花蕾，選取合適的花蕾提取小孢子材 料，解決了冬季無法正常獲得青花菜小孢子的技術(shù)難題。

附圖說明

圖1為本發(fā)明青花菜種子播種階段的示意圖。

圖2為本發(fā)明青花菜種子催芽階段的示意圖。

圖3為本發(fā)明定植階段的示意圖。

圖4為本發(fā)明低溫春化階段的示意圖。

圖5為本發(fā)明花球形成階段的示意圖。

圖6為本發(fā)明中獲得的正?；ㄇ虻氖疽鈭D。

圖7為本發(fā)明中小孢子形態(tài)倒置顯微鏡下放大40倍后的示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解下述具體實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

一種在冬季獲取青花菜小孢子材料的方法，所述方法主要包括以下步驟：

a.播種：在溫室大棚中，準(zhǔn)備好穴盤，在穴盤中裝滿栽培基質(zhì)，并用水澆透，將青花菜種子淺層播種于穴盤內(nèi)，如圖1所示；

b.催芽：將上述播種有青花菜種子的穴盤放置溫床上催芽，催芽溫度控制在白天20～25℃，夜間10～15℃；在催芽期間，根據(jù)基質(zhì)干濕情況澆水管理如圖2所示；

c.定植：待到長出2～3片真葉時(shí)，定植栽培于基質(zhì)營養(yǎng)杯中，并根據(jù)基質(zhì) 干濕情況，定期澆灌營養(yǎng)液MB1，控制環(huán)境溫度和濕度，從而達(dá)到滿足其營養(yǎng)生長所需條件，如圖3所示；

d.低溫春化：待到真葉長出14～16片營養(yǎng)生長結(jié)束后，控制環(huán)境溫度在8～15℃，低溫春化誘導(dǎo)其進(jìn)入生殖生長，春化作用20天左右，期間并配合澆灌營養(yǎng)液MB2，如圖4所示；

e.栽培：待到花球形成后，根據(jù)基質(zhì)干濕情況，配合澆灌營養(yǎng)液MB3繼續(xù)栽培；控制大棚內(nèi)的環(huán)境溫度為20～25℃，獲得正?；ɡ伲鐖D5所示；

f.提取小孢子：選取長度合適的花蕾(如圖6所示)，將花蕾經(jīng)過消毒、抽提花粉，即可在冬季獲得青花菜的小孢子材料，小孢子在顯微鏡下的形態(tài)如圖7所示。

所述培養(yǎng)液MB1的具體組成如下：以一立方米水計(jì)，其中含有硝酸鉀1.6kg、硝酸銨1.4kg、氯化鈣0.5kg、硫酸鎂0.37kg、磷酸二氫鈉2.15kg、肌醇50g、硫酸亞鐵28g、乙二胺四乙酸二鈉40g、硫酸錳22g、硫酸鋅9g、硼酸鈉6g、碘化鉀1g、甘氨酸2g、鉬酸鈉0.25g、硫酸銅0.5g、氯化鈷0.5g。

所述培養(yǎng)液MB2的具體組成如下：以一立方米水計(jì)，其中含有氯化鉀1.05kg、硝酸銨1.5kg、氯化鈣0.5kg、硫酸鎂0.37kg、磷酸二氫鈉2.5kg、肌醇30g、硫酸亞鐵28g、乙二胺四乙酸二鈉40g、硫酸錳22g、硫酸鋅9g、硼酸鈉10g、碘化鉀1g、甘氨酸2g、鉬酸鈉0.35g、硫酸銅0.5g、氯化鈷0.5g。

所述培養(yǎng)液MB3的具體組成如下：以一立方米水計(jì)，其中含有氯化鉀1kg、硝酸銨1.15kg、氯化鈣0.5kg、硫酸鎂0.37kg、磷酸二氫鈉2.9kg、肌醇10g、硫酸亞鐵28g、乙二胺四乙酸二鈉40g、硫酸錳22g、硫酸鋅9g、硼酸鈉12g、碘化鉀1g、甘氨酸2g、鉬酸鈉0.5g、硫酸銅0.5g、氯化鈷0.5g。

上述小孢子的提取方法具體包括以下內(nèi)容：

(1)選蕾：選取生長良好長度為2.5～3.5mm的主花序花蕾，或者是選取長度為3.5～4mm的側(cè)枝花蕾；

(2)消毒：將上述選取好的花蕾用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為75％的酒精消毒30～40S，然后用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2％的次氯酸鈉消毒10min，最后用無菌水清洗3次，每次5min；

(3)抽提花粉：將滅過菌的花蕾放置于離心管中，加入1～2mL B5培養(yǎng)液，用玻璃棒研磨使花粉散出，研磨至糊狀，在管中加入半吸管B5培養(yǎng)液，倒入過濾器過濾，將濾液盛入10mL的離心管中；加入B5培養(yǎng)液沖洗過濾器中的花粉，沖2～3次后，合并濾液，在10mL離心管中將花粉懸浮液稀釋；

將花粉懸浮液800轉(zhuǎn)/min下離心處理5min；將離心管中的上層清液除去，再加液體B5培養(yǎng)液，并將沉淀的花粉用吸管沖散，再次懸浮離心，除去上清液；

將沉淀的花粉用NLN-13培養(yǎng)液稀釋，稀釋后的懸浮液分裝入6cm培養(yǎng)皿，一般每皿加入懸浮液5mL左右，每mL含花蕾大約1.5～2個，用封口膜封口，便可得到所需的小孢子材料；

將封口的培養(yǎng)皿在25℃的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，大概10天左右開始查看是否有可見的顆粒狀胚的形成，如果沒有則繼續(xù)培養(yǎng)，如果有可見的胚出現(xiàn)，則移至50rpm、25℃恒溫?fù)u床上繼續(xù)進(jìn)行暗培養(yǎng)。

以上實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明，而并非對本發(fā)明的限制，有關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以做出各種變化和變型，因此所有等同的技術(shù)方案也屬于本發(fā)明的范疇，本發(fā)明的專利保護(hù)范圍應(yīng)由權(quán)利要求限定。