白榆組培苗瓶內(nèi)復(fù)壯的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種白榆組培苗瓶內(nèi)復(fù)壯的方法，采用(1)獲取白榆組培苗單株a；(2)白榆瓶內(nèi)復(fù)壯苗的制備；將該組培苗再次轉(zhuǎn)接至正常繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24天后，得生長健壯、葉片舒展，平均株高3.5-4.0厘米，增殖比例平均1:3.8。復(fù)壯后的白榆組培苗降低了組培苗內(nèi)的激素含量，能夠繼續(xù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)20次，減少了重新獲取新組培苗的次數(shù)，更適于白榆組培苗工廠化生產(chǎn)過程中，不受季節(jié)限制、利于生態(tài)環(huán)境、能短期內(nèi)為生產(chǎn)提供大量正常健康的無菌組培苗。本發(fā)明適用于白榆組培苗瓶內(nèi)的復(fù)壯的培養(yǎng)。
【專利說明】白榆組培苗瓶內(nèi)復(fù)壯的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物培植領(lǐng)域，涉及一種植物復(fù)壯的方法，具體涉及一種白榆組培苗 瓶內(nèi)復(fù)壯的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 白榆也稱榆樹，榆科榆屬落葉喬木，分布較廣，在東北、華北、西北及西南各省區(qū)均 有栽培。白榆在中國乃至世界范圍內(nèi)有著悠久的栽植歷史，是中國北方地區(qū)五大鄉(xiāng)土樹種 之一，也是世界四大行道樹種之一。白榆適應(yīng)性強，喜光、耐旱、耐寒、耐貧瘠，不擇土壤，多 用于造林，是榆屬植物中造林最為主要的樹種。同時，白榆具有耐鹽堿能力，可在中低度鹽 堿地生長，因此可用于濱海鹽堿地的造林或四旁綠化。除造林外，白榆還是優(yōu)良的木材，耐 磨、耐腐，可用于造船、建筑、室內(nèi)裝修地板、家具。此外，白榆還具有較高的食用價值，葉片 含淀粉和蛋白質(zhì)，可做飼料，幼嫩果實（榆錢）可食用且具有藥用效果。
[0003] 植物組培技術(shù)是保持植物優(yōu)良性狀的有效手段。白榆組培工廠化過程中，隨著組 培繼代次數(shù)的增加，植株體內(nèi)激素不斷累積，進(jìn)而影響植物正常的表現(xiàn)，組培增殖比例下 降，更嚴(yán)重的是，組培生根率下降，出現(xiàn)變異的風(fēng)險增加。通常白榆組培苗繼代20次以上， 需要采取新的外植體，通過利用升汞、次氯酸等化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行消毒，以獲取新的無菌苗替代 超繼代次數(shù)的組培苗。由于常規(guī)的外植體消毒方法，使用的升汞等物質(zhì)中含重金屬，易影響 身體健康，破壞生態(tài)環(huán)境；同時該方法以外植體為基礎(chǔ)，受季節(jié)限制，不利于大規(guī)模工廠化 生產(chǎn)。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中通常獲得白榆無菌苗的方法，往往受到季節(jié)的限制，一般在母本植株 生長開始或生長旺季進(jìn)行外植體材料的采集，此時外植體材料內(nèi)源激素含量高，容易分化， 成活率高，生長速度快，相對易增殖。因此一般在春夏季節(jié)進(jìn)行外植體材料的采集。另外， 外植體材料來源少，采集外植體需選定一個優(yōu)良的母本植株，因同一個植株不同部位相對 樹齡不同，樹冠下部低齡化，所以一般采集樹冠下部枝條萌發(fā)的新芽，因此材料來源少。獲 得新芽后，新芽生長需要一定時間，從外植體采集到獲得100個無菌材料總耗時2個月。且 繼代前2個周期內(nèi)出現(xiàn)無菌苗基部有黃葉、落葉現(xiàn)象，獲得正常生長的無菌苗需3. 5個月 時間，耗時長。對于整個無菌體系建立需要在采集2個月時間內(nèi)重復(fù)進(jìn)行外植體的采集、消 毒、接種。在無菌體系建立過程中使用的升汞為有毒試劑，易對環(huán)境產(chǎn)生污染，不慎接觸可 能產(chǎn)生毒副作用。并且成本相對高，其中無菌體系建立過程中需要使用消毒劑、配制啟動培 養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基，且均不可重復(fù)使用。
[0005] 白榆組培苗的培養(yǎng)方法的步驟分為無菌苗的獲取、瓶內(nèi)擴(kuò)繁（繼代）、瓶內(nèi)復(fù)壯、 瓶內(nèi)生根，每個階段所使用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法均是不同的。并且其中所述的瓶內(nèi)復(fù)壯是 在瓶內(nèi)生根階段之前的復(fù)壯，目的是使生根階段的生根率提高。
[0006] 中國發(fā)明專利CN102726294公開了"一種白榆組培苗的瓶內(nèi)生根方法"，采用以下 步驟進(jìn)行（1)繼代苗的選??；（2)將繼代培養(yǎng)的組培苗接種到WPM生根培養(yǎng)基上；其針對的 是白榆組培苗的生根方法，應(yīng)用階段為最終的生根階段。
[0007] 中國發(fā)明專利CN102934612公開了"一種白榆組培苗的繼代培養(yǎng)方法"，采用將到 達(dá)繼代周期的白榆組培苗在超凈工作臺通過切分從生芽形式進(jìn)行擴(kuò)繁增殖，接種到繼代培 養(yǎng)基中。其針對的是白榆組培苗的繼代培養(yǎng)階段。
[0008]因此，建立一種不受季節(jié)限制、耗時短、減少人力的耗費、減少化學(xué)試劑的使用和 生產(chǎn)成本低的，能短期內(nèi)為生產(chǎn)提供大量正常健康的無菌組培苗方法具有重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，是提供一種白榆組培苗瓶內(nèi)復(fù)壯的方法，該復(fù)壯階段 是在無菌苗的獲取和瓶內(nèi)擴(kuò)繁（繼代）之間，所制得的復(fù)壯苗較現(xiàn)有技術(shù)的繼代培養(yǎng)次數(shù) 增加，在白榆組培苗工廠化生產(chǎn)過程中，不受季節(jié)限制、利于生態(tài)環(huán)境、能短期內(nèi)為生產(chǎn)提 供大量正常健康的無菌組培苗方法。
[0010] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0011] -種白榆組培苗瓶內(nèi)復(fù)壯的方法，它按照以下步驟順序進(jìn)行：
[0012] (1)獲取白榆組培苗單株a
[0013] 選取繼代周期為21-25天，生長健壯、葉色嫩綠、葉片舒展，莖30 % -50 %木質(zhì) 化，株高為2. 5-3. 5厘米的白榆組培苗，切除基部愈傷組織及基部葉片，保留頂芽且株高 1. 8-2. 5厘米的白榆組培苗單株a;
[0014] (2)白榆瓶內(nèi)復(fù)壯苗的制備
[0015] 將白榆組培苗單株a轉(zhuǎn)接至復(fù)壯培養(yǎng)基中，光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行，光照培養(yǎng)條 件為13小時光照，光照強度1500-3500勒克斯，溫度為23-27°C;暗培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)11小 時，溫度為19-23 °C，培養(yǎng)40天后，得白榆瓶內(nèi)復(fù)壯苗。
[0016] 作為本發(fā)明的一種限定，步驟（2)中所述的復(fù)壯培養(yǎng)基為體積比為30ml:60ml的 營養(yǎng)液：蛭石。
[0017] 作為本發(fā)明的另一種限定，營養(yǎng)液為MS培養(yǎng)基中硝酸銨、7水硫酸鎂、磷酸二氫 鉀、硝酸鉀四種物質(zhì)濃度變?yōu)樵瓉淼?/4-3/4,同時去除肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆 醇、甘氨酸。其中所述的原來的MS培養(yǎng)基為市售的MS培養(yǎng)基。
[0018] 由于采用了上述的技術(shù)方案，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，所取得的技術(shù)進(jìn)步在于：
[0019] 采用白榆組培苗瓶內(nèi)復(fù)壯方法，該復(fù)壯階段是在無菌苗的獲取和瓶內(nèi)擴(kuò)繁（繼 代）之間，所制得的復(fù)壯苗較現(xiàn)有技術(shù)的繼代培養(yǎng)次數(shù)增加，且可以作為無菌苗繼續(xù)進(jìn)行 復(fù)壯、繼代培養(yǎng)等下面的步驟，能夠進(jìn)行循環(huán)使用。采用（1)獲取白榆組培苗單株a;(2)白 榆瓶內(nèi)復(fù)壯苗的制備；將該組培苗再次轉(zhuǎn)接至正常繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24天后，得生長 健壯、葉片舒展，平均株高3. 5-4. 0厘米，增殖比例平均1:3. 8。復(fù)壯后的白榆組培苗降低了 組培苗內(nèi)的激素含量，能夠繼續(xù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)20次，減少了重新獲取新組培苗的次數(shù)，更 適于白榆組培苗工廠化生產(chǎn)過程中，不受季節(jié)限制、利于生態(tài)環(huán)境、能短期內(nèi)為生產(chǎn)提供大 量正常健康的無菌組培苗。
[0020] 本發(fā)明適用于白榆組培苗瓶內(nèi)的復(fù)壯的培養(yǎng)。
[0021] 本發(fā)明下面將結(jié)合具體實施例作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

【具體實施方式】
[0022] 實施例1 一種白榆組培苗瓶內(nèi)復(fù)壯的方法
[0023] 一種白榆組培苗瓶內(nèi)復(fù)壯的方法，它按照以下步驟順序進(jìn)行：
[0024] (1)獲取白榆組培苗單株a
[0025] 選取繼代周期為23天，生長健壯、葉色嫩綠、葉片舒展，莖30% -50%木質(zhì)化，株高 為2. 5厘米的白榆組培苗，切除基部愈傷組織及基部葉片，保留頂芽且株高2. 5厘米的白榆 組培苗單株a;
[0026] (2)白榆瓶內(nèi)復(fù)壯苗的制備
[0027] 將白榆組培苗單株a轉(zhuǎn)接至復(fù)壯培養(yǎng)基中，光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行，光照培養(yǎng)條 件為13小時光照，光照強度3000勒克斯，溫度為25°C ;暗培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)11小時，溫度 為20 °C，培養(yǎng)40天后，得白榆瓶內(nèi)復(fù)壯苗；其中，復(fù)壯培養(yǎng)基為體積比為30ml: 60ml的營養(yǎng) 液：輕石。營養(yǎng)液為MS培養(yǎng)基中硝酸銨、7水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硝酸鉀四種物質(zhì)濃度變 為原來的1/4,同時去除肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、甘氨酸。
[0028] 將瓶內(nèi)復(fù)壯苗轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)所得到的復(fù)壯后的白榆組培苗a 與通過外植體消毒獲得的無菌苗b在相同的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，比較培養(yǎng)結(jié)果：
[0029] (1)復(fù)壯后的白榆組培苗a的制備
[0030] 將上述瓶內(nèi)復(fù)壯苗轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的pH為5. 8,培養(yǎng)22天，得復(fù) 壯后的白榆組培苗a。所使用的繼代培養(yǎng)基為以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還添加有 BA 0.3mg/L、KT 0.2mg/L、糖 30g/L 和瓊脂 6.5g/L。改良 MS 培養(yǎng)基為包括 KN032022mg/L、 NH4N031600mg/L、MgS0 4 ? 7H20 740mg/L 和 KH2P04312mg/L。
[0031] (2)通過外植體消毒獲得的無菌苗b的制備
[0032] 通過外植體消毒獲得無菌苗b的方法為：選定的母本植株枝條萌發(fā)的新芽長 2-3cm時開始采集，新芽采集后立即帶回實驗室進(jìn)行消毒、接種處理，步驟如下：外植體 采集一自來水沖洗兩遍一洗衣粉水沖洗瓶內(nèi)順時針晃動重新2分鐘一流水沖洗30分鐘 -75%酒精消毒20秒一無菌水沖洗兩次一0. 04%升汞100毫升+ -滴吐溫20消毒搖床 晃動15分鐘一超凈工作臺內(nèi)無菌水沖洗六次一用無菌紗布或無菌吸水紙吸除外植體材料 上的水一外植體材料進(jìn)行修剪一接種至培養(yǎng)基中一培養(yǎng)室培養(yǎng)，光照培養(yǎng)條件為13小時 光照，光照強度為3000勒克斯，溫度為25°C，最終獲得無菌苗b。
[0033] 將通過外植體消毒方法獲得的無菌苗b與本實施例所培養(yǎng)出的復(fù)壯后的白榆組 培苗a生長情況作對比，如下表所示：
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種白榆組培苗瓶內(nèi)復(fù)壯的方法，其特征在于它按照以下步驟順序進(jìn)行： (1) 獲取白榆組培苗單株a 選取繼代周期為21-25天，生長健壯、葉色嫩綠、葉片舒展，莖30% -50%木質(zhì)化，株高 為2. 5-3. 5厘米的白榆組培苗，切除基部愈傷組織及基部葉片，保留頂芽且株高1. 8-2. 5厘 米的白榆組培苗單株a; (2) 白榆瓶內(nèi)復(fù)壯苗的制備 將白榆組培苗單株a轉(zhuǎn)接至復(fù)壯培養(yǎng)基中，光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行，光照培養(yǎng)條件為 13小時光照，光照強度1500-3500勒克斯，溫度為23-27°C ;暗培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)11小時， 溫度為19_23°C，培養(yǎng)40天后，得白榆瓶內(nèi)復(fù)壯苗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白榆組培苗瓶內(nèi)復(fù)壯的方法，其特征在于：步驟（2)中所述 的復(fù)壯培養(yǎng)基為體積比為30ml :60ml的營養(yǎng)液：輕石。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的白榆組培苗瓶內(nèi)復(fù)壯的方法，其特征在于：營養(yǎng)液為MS培養(yǎng) 基中硝酸銨、7水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硝酸鉀四種物質(zhì)濃度變?yōu)樵瓉淼?/4-3/4,同時去除 肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、甘氨酸。
【文檔編號】A01H4/00GK104429958SQ201410705512
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】林大為, 王蘇洋, 劉伯燕, 劉戈, 張承妹, 董舉文, 陳銘, 高暢, 郝治軍, 蘇涌 申請人:上海杉一植物科技有限公司