一種海洋細菌可濕性粉劑的制備方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明是一種海洋細菌可濕性粉劑的制備方法，其步驟是選用海洋細菌GM-1菌株制備菌株種子液，然后介入到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中對GM-1菌株進行發(fā)酵，制備GM-1菌株發(fā)酵液；按飽和吸附量向海洋細菌GM-1的發(fā)酵液中加入載體硅藻土，使載體吸附菌體，菌體形成芽孢后，離心，沉淀烘干，即得GM-1菌株菌粉；向菌粉中加入助劑，氣流粉碎機粉碎過300目篩，即得成品海洋細菌可濕性粉劑。本發(fā)明方法采用現(xiàn)有的海洋細菌制成可濕性粉劑，其可操作性強。制得的可濕性粉劑的性質和穩(wěn)定性好，活菌數(shù)含量可以達到4.90×1010cfu/g，可濕性粉劑對水稻紋枯病有較高的防治效果。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗菌劑的制備方法，特別是一種海洋細菌活菌可濕性粉劑的制備 方法，本發(fā)明還涉及該海洋細菌活菌可濕性粉劑的用途。 一種海洋細菌可濕性粉劑的制備方法及其用途

【背景技術】
[0002] 水稻紋枯病是我國水稻三大主要病害之一，一般發(fā)病田 塊能導致減產(chǎn)159Γ 20%，嚴重的可達60% ~ 70%，甚至絕收，嚴重威脅水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。目 前尚缺乏免疫和高抗品種，紋枯病的防治主要依靠井R霉素，長期使用單一農(nóng)藥容易產(chǎn)生 抗藥性，甚至已出現(xiàn)了抗藥性，生物防治已經(jīng)成為水稻紋枯病防治研究的重點，國內(nèi)外很多 學者開展水稻紋枯病的生物防治研究，篩選出多個對紋枯病菌有較好防治效果的微生物菌 株，有的已經(jīng)用于生產(chǎn)。
[0003] 由淮海工學院海洋學院實驗室從連云港海域海泥中篩選出的海洋細菌GM-1菌株 是解淀粉芽孢桿菌，具有較強的抑菌作用，對9種植物病 原菌均有很強的抑菌作用，而且在光照和紫外線照射下，GM-1菌株的穩(wěn)定性良好，在pH值 6?8的條件下，GM-1菌株的抗菌作用穩(wěn)定，且對蛋白酶不敏感。GM-1菌株在以下公開出版 物上均有記截：《油菜菌核病菌拮抗海洋細菌GM-1菌株的種類鑒定及抑菌作用研究》（《植 物保護》2013, 39 (2) 50 - 60)、《海洋解淀粉芽孢桿菌GM-1培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化》 (作物雜志，2013. 3)、《海洋解淀粉芽孢桿菌GM-1菌株發(fā)酵液抗菌譜及穩(wěn)定性測定》(農(nóng)藥第 51卷第10期，2012年10月）。
[0004] GM-1菌株具有廣譜性和較強的穩(wěn)定性，表現(xiàn)出良好的開發(fā)應用前景。但現(xiàn)在技術 中還沒有對其具體的應用進行研發(fā)，而該研發(fā)對對于減少化學農(nóng)藥的使用，避免井R霉素 抗藥性的產(chǎn)生具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種抗菌效果好的、制 備方法簡單的海洋細菌可濕性粉劑的制備方法。
[0006] 本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供了前述海洋細菌可濕性粉劑的制備方 法制得的海洋細菌可濕性粉劑的用途。
[0007] 本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種海洋 細菌可濕性粉劑的制備方法，其特點是，其步驟如下： (1) 海洋細菌GM-1菌株種子液的制備：將活化的海洋細菌GM-1菌株斜面菌種用2ml 無菌水清洗下，配制成濃度為l〇9cfu/ml的菌懸液，接入到裝有50miro培養(yǎng)基的250ml三 角瓶中，28°C、180r/min搖床培養(yǎng)24h，即得種子液，調(diào)整濃度為為10 9個細胞/mL作為種子 液； (2) 發(fā)酵：用50L發(fā)酵罐對海洋細菌GM-1菌株進行發(fā)酵，制備海洋細菌GM-1菌株發(fā)酵 液；發(fā)酵條件：裝液量30L，接種量7%，種子液菌齡24h、濃度10 9cfu/ml，溫度28°C，攪拌速 度200r/min，通氣量3L/min，發(fā)酵時間36h ;生物量達2. 40 X 101(lcfu/mL ;得GM-1菌株發(fā)酵 液； (3)成品粉劑制備：按飽和吸附量向發(fā)酵好的GM-1菌株發(fā)酵液中加入載體硅藻土，每 間隔lh攪拌一次，使載體充分吸附菌體，48h后GM-1菌體形成芽孢后，離心，沉淀置于60°C 電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干，即制得海洋細菌GM-1菌粉；最后將菌粉與穩(wěn)定劑硬脂酸鈣、 分散劑聚乙烯醇、濕潤劑十二烷基苯磺酸鈉按重量比75 :15 :6 :4進行混合，氣流粉碎機粉 碎，過300目篩，制備得到海洋細菌GM-1菌株可濕性粉劑。
[0008] 本發(fā)明中所述的海洋細菌GM-1菌株在《油菜菌核病菌拮抗海洋細菌GM-1菌株的 種類鑒定及抑菌作用研究》（《植物保護》2013,39 (2)50 - 60)中已經(jīng)公開，該菌株是為公 知公用的材料，如公眾需要，淮海工學院海洋學院實驗室可以對外提供。
[0009] 本發(fā)明所述的制備方法所制得的可濕性粉劑對植物病原真菌的毒力測定方法，其 步驟如下：將制備得到的GM-1菌株可濕性粉劑加入到裝有70mL PDA培養(yǎng)基的250ml的 三角瓶中，混合均勻，制成濃度不同的含藥平板，每個三角瓶為一個濃度，平均倒入3個培 養(yǎng)皿中，為3個重復；打取直徑為5mm的供試水稻紋枯病菌，核 盤菌(5W<9roii/?io 黃瓜枯萎病菌〇工_75/7(〇--)，菠菜早疫病菌 4種植物病原真菌菌苔，放入不同的含藥平板中央，28°C下培養(yǎng)5d ; 以不加粉劑為對照，用十字交叉法測量菌落直徑，計算不同濃度的GM-1菌株可濕性粉劑粉 劑對不同病原真菌的抑制率，查詢抑制率幾率值，以粉劑濃度的對數(shù)為橫坐標，抑制率的機 率值為縱坐標，建立GM-1可濕性粉劑對4種植物病原真菌的毒力回歸方程，計算的EC 5(I和 ec90。
[0010] 本發(fā)明所述的制備方法制得的海洋細菌可濕性粉劑作為防治水稻紋枯病的用途。
[0011] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明制備方法采用現(xiàn)有的海洋細菌制成可濕性粉劑，其可操 作性強，制得的可濕性粉劑的性質和穩(wěn)定性好，粉劑中活菌數(shù)量達到4. 90X 101° cfu/g，可 以作為防治水稻紋枯病的農(nóng)藥。

【具體實施方式】
[0012] 以下進一步對本發(fā)明的技術方案進行描述，以使本領域技術人員進一步的理解本 發(fā)明，而不構成對本發(fā)明權利的限制。
[0013] 實施例1，一種海洋細菌可濕性粉劑的制備方法，其步驟如下： (1) 海洋細菌GM-1菌株種子液的制備：將活化的海洋細菌GM-1菌株斜面菌種用2ml 無菌水清洗下，配制成濃度為l〇9cfu/ml的菌懸液，接入到裝有50miro培養(yǎng)基的250ml三 角瓶中，28°C、180r/min搖床培養(yǎng)24h，即得種子液，調(diào)整濃度為為10 9個細胞/mL作為種子 液； (2) 發(fā)酵：用50L發(fā)酵罐對海洋細菌GM-1菌株進行發(fā)酵，制備海洋細菌GM-1菌株發(fā)酵 液；發(fā)酵條件：裝液量30L，接種量7%，種子液菌齡24h、濃度10 9cfu/ml，溫度28°C，攪拌速 度200r/min，通氣量3L/min，發(fā)酵時間36h ;生物量達2. 40 X 101(lcfu/mL ;得GM-1菌株發(fā)酵 液； (3) 成品粉劑制備：按飽和吸附量向發(fā)酵好的GM-1菌株發(fā)酵液中加入載體硅藻土，每 間隔lh攪拌一次，使載體充分吸附菌體，48h后GM-1菌體形成芽孢后，離心，沉淀置于60°C 電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干，即制得海洋細菌GM-1菌粉；最后將菌粉與穩(wěn)定劑硬脂酸鈣、 分散劑聚乙烯醇、濕潤劑十二烷基苯磺酸鈉按重量比75 :15 :6 :4進行混合，氣流粉碎機粉 碎，過300目篩，制備得到海洋細菌GM-1菌株可濕性粉劑。
[0014] 實施例2,海洋細菌活菌粉劑的制備方法篩選及應用實驗： 1材料與方法 1. 1菌種 海洋解淀粉芽孢桿菌GM-1菌株由本實驗室分離自連 云港海域。
[0015] 水稻紋枯病菌 ，核盤菌）（5W<9roii/?io 應） 黃瓜枯萎病菌菠菜早疫病菌 C^ieraaria 5·〇7<3/7Υ<3) 1. 2助劑 (1) 載體：膨潤土、阜土、高嶺土、碳酸氫I丐、活性白土、娃藻土、凹凸棒土； (2) 穩(wěn)定劑：熒光素鈉、硬脂酸鋅、腐植酸、黃原膠、海藻酸鈉、硬脂酸鈣； (3) 濕潤劑：脂肪醇聚氧乙烯醚25、蔗糖脂肪酸酯、吐溫80、乙氧基化烷基硫酸鈉、十二 烷基苯磺酸鈉、木質素磺酸鈉； (4) 分散劑：聚乙烯醇、羧甲基纖維素納； (5) 展著劑：柱層層析硅膠、薄層層析硅膠。
[0016] 1. 3培養(yǎng)基 (1)海洋細菌GM-1菌株的活化及培養(yǎng)用培養(yǎng)基（PDA):200g 土豆，20g瓊脂粉，20g實驗 葡萄糖，lOOOmL水，自然pH。
[0017] (2)海洋細菌GM-1菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基（PD):200g 土豆，20g實驗葡萄糖，水lOOOmL 水，自然pH。
[0018] 1. 3海洋細菌GM-1菌株種子液的制備 將活化的海洋細菌GM-1菌株斜面菌種用2ml無菌水清洗下，配制成濃度為109cfu/ml 的菌懸液，接入到裝有50miro培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，28°C、180r/min搖床培養(yǎng)24h，即 得種子液，調(diào)整濃度為為1〇 9個細胞/mL作為種子液。
[0019] 1. 4不同助劑與海洋細菌GM-1菌株生物相容性測定 250ml的三角瓶中加入50ml的含4%助劑的培養(yǎng)基，接種海洋細菌GM-1菌株的種子 液2ml，28°C，160r/m的搖床中培養(yǎng)24h，采用平板菌落計數(shù)法測定發(fā)酵液中的活菌數(shù)，以 不添加助劑的為對照，比較不同助劑對GM-1菌株生長的影響，篩選與海洋細菌GM-1菌株生 物相容性好的助劑。
[0020] 1. 5載體對海洋細菌GM-1菌株吸附量的測定 選取生物相容性好的載體各2g分別放入到100ml的燒杯中，緩慢向填充劑中滴加海洋 細菌GM-1菌株的發(fā)酵液，用玻璃棒攪拌至填充劑粉末開始聚成團狀而不分散時停止添加， 記錄滴加到填充劑中的海洋細菌GM-1發(fā)酵液的量，測定不同載體對海洋細菌GM-1的飽和 吸附量。每種載體做3個重復。
[0021] 1.6載體配比的篩選 將海洋細菌GM-1的新鮮干粉與載體分別按1:5, 1:20, 1:40的比例混合，分別在5d， 10d，15d時取每種試樣0. lg溶于9ml的無菌水中制成菌懸液，梯度稀釋，用平板菌落計數(shù)法 測定加入不同配比載體的菌懸液中海洋細菌GM-1的菌落數(shù)。
[0022] 1.7不同助劑對制劑性質的影響 將不同的助劑按不同比例與海洋細菌GM-1菌株菌粉充分混合均勻，過300目篩，制得 不同的制劑。分別準確稱量每種制劑各2g，將其緩慢勻速加入到盛有50ml水的100ml量筒 中，記下其完全溶入水中的時間，即濕潤時間；用玻璃棒輕輕攪拌，靜置50s，觀察其懸浮效 果，測定其懸浮率。
[0023] 1.8穩(wěn)定劑配比的篩選 將與海洋細菌GM-1生物相容性較好的穩(wěn)定劑與海洋細菌GM-1菌株的菌粉分別按1: 5、 1:10、1:20的質量比混合，經(jīng)粉碎機粉碎混勻，過300目篩，置于室溫（25 °C )條件下貯存， 分別在5(1、10(1、15(1，取不同配比的樣品，采用平板菌落計數(shù)法測定不質量同配比的制劑中 海洋細菌GM-1的活菌數(shù)，以不加穩(wěn)定劑為對照，每個配比重復3次。
[0024] 1.9濕潤劑與分散劑配比及用量的篩選 根據(jù)試驗所用濕潤劑、分散劑對制劑性質影響的測定結果，分別選出最佳的濕潤劑、 分散劑。再將最佳的濕潤劑、分散劑按不同的比例（9 : 1、8 : 2、7 : 3、6 : 4、5 : 5、 4 : 6、3 : 7、2 : 8、1 : 9)混合，經(jīng)粉碎機粉碎混勻，過300目篩，測定其濕潤時間和懸浮 率，確定最佳的濕潤劑和分散劑質量配比。再將最佳質量配比的濕潤劑和分散劑按2%、4%、 6%......16%、18%的不同用量添加到菌粉中，測定其濕潤時間和懸浮率，綜合分析確 定濕潤劑和分散劑的用量。
[0025] 1. 10海洋細菌U-9菌株粉劑的制備工藝及其貯藏穩(wěn)定性測定 用50L發(fā)酵罐對海洋細菌GM-1菌株進行發(fā)酵，制備海洋細菌GM-1菌株發(fā)酵液。發(fā)酵 條件：裝液量30L，接種量7% (菌齡24h、濃度109cfu/ml)、溫度28°C、攪拌速度200r/min、 通氣量3L/min、發(fā)酵時間36h。生物量達2. 40X 10lclcfu/mL。
[0026] 按飽和吸附量向發(fā)酵好的海洋細菌GM-1菌株發(fā)酵液中加入吸附量最佳及穩(wěn)定性 好的載體，每間隔lh攪拌一次，使硅藻土充分吸附海洋細菌GM-1菌體，使載體充分吸附菌 體，48h后海洋細菌GM-1菌體形成芽孢后，離心，沉淀置于60°C電熱恒溫鼓風干燥箱中烘 干，即制得海洋細菌GM-1菌粉。
[0027] 將菌粉與穩(wěn)定劑、濕潤劑按篩選出的種類和比例進行混合，氣流粉碎機粉碎，過 300目篩，制備得到海洋細菌GM-1菌株可濕性粉劑。
[0028] 制備得到的海洋細菌GM-1菌株可濕性粉劑密封，28°C條件下保存，每隔30d取樣 1次，采用平板菌落計數(shù)方法，測定可濕性粉劑中的GM-1菌株的菌落數(shù)，連續(xù)測定6次。
[0029] 1. 11海洋細菌GM-1菌株可濕性粉劑對幾種植物病原真菌的毒力測定 將制備得到的不同質量的GM-1菌株可濕性粉劑加入到裝有70mL PDA培養(yǎng)基的250ml 的三角瓶中，混合均勻，制成濃度不同的含藥平板，每個三角瓶為一個濃度，平均倒入3個 培養(yǎng)皿中，為3個重復。打取直徑為5mm的供試、水稻紋枯病菌、黃瓜枯萎病菌、核盤菌菠菜 早疫病菌4種植物病原真菌菌苔，放入不同的含藥平板中央，28°C下培養(yǎng)5d。以不加粉劑 為對照，用十字交叉法測量菌落直徑，計算不同濃度的GM-1菌株可濕性粉劑粉劑對不同病 原真菌的抑制率，查詢抑制率幾率值，以粉劑濃度的對數(shù)為橫坐標，抑制率的機率值為縱坐 標，建立GM-1可濕性粉劑對4種植物病原真菌的毒力回歸方程，計算的EC 5(i和EC9(i。
[0030] 1. 12海洋細菌GM-1菌株可濕性粉劑對水稻紋枯病的防治作用 1. 12. 1盆栽防病試驗 盆栽試驗土壤稻紋枯病菌接種物的制備與接種：將保藏的稻紋枯病菌接種到PDA培養(yǎng) 基平板上，28°C恒溫培養(yǎng)5d，進行活化，取活化5d直徑9_的稻紋枯病菌菌苔5個，接種到 滅菌的裝有40g麥粒與60ml水的500ml三角瓶中，28°C恒溫培養(yǎng)5d。取出擴繁后的稻紋枯 病菌培養(yǎng)物，攪拌均勻后按土壤質量的3%添加到土壤中混勻，裝入到營養(yǎng)缽中，每個營養(yǎng) 缽裝土 200g。
[0031] 在口徑為20cm，高17cm的花盆中裝入無菌菜園土至盆高的2/3,病原菌培養(yǎng)物20g 均勻混于土壤中，每盆移栽水稻幼苗10株，常規(guī)管理，拔節(jié)孕穗期噴施GM-1菌株可濕性粉 劑（750g/hm2)，共處理5盆，重復3次。以不用藥為對照。觀察記錄發(fā)病情況，計算防病效 果。水稻紋枯病病級劃分標準參照檀根甲等人的劃分標準 [17]。
[0032] 田間防治效果試驗 試驗設在東?？h安峰鎮(zhèn)，選擇水稻紋枯病常發(fā)病田，前茬作物為小麥，分別于分蘗盛期 和孕穗期噴施GM-1菌株孢子粉制劑（750g/hm2)，小區(qū)面積150m2,以清水為空白對照（CK1)， 以20%井崗霉素可濕性粉劑為藥劑對照（CK2)，重復4次。隨機排列，噴藥后以株為單位每 小區(qū)對"Z"字形取樣，每點調(diào)查相連5株，共25株，記錄總株數(shù)、病株數(shù)和病級數(shù)，計算防 治效果和保產(chǎn)率。
[0033] 水稻紋枯病分級標準：0級，全株無??；1級，第3片葉以下各葉鞘或葉片發(fā)?。ㄗ?頂葉算起，下同);2級，第2葉以下各葉鞘或葉片發(fā)?。?級頂葉葉鞘或葉片發(fā)?。?級，全株 發(fā)病，提早枯死。
[0034] 病情指數(shù)計算公式： 病情指數(shù)（1〇〇%)=【Σ (各級病株數(shù)X相對級數(shù)值V(調(diào)查總葉數(shù)X最高級數(shù) 值）】X100， 防治效果（100%)=【（CK病情指數(shù)一試驗后處理病情指數(shù)）八CK病情指數(shù)）】X 100。
[0035] 2結果與分析 2. 1載體的篩選 2. 1. 1載體與海洋細菌Lf9菌株生物相容性測定 不同載體與海洋細菌GM-1都有較好的生物相容性，添加載體的發(fā)酵液平板菌落計數(shù) 均大于空白對照組，尤其是添加硅藻土的發(fā)酵液活菌含量最高，為6. 80 X 108cfu/g，約是對 照組的7倍，其次是皂土，發(fā)酵液含菌量為4. 53 X 101(lCfu/ml。
[0036] 說明硅藻土和皂土與海洋細菌GM-1菌株的生物相容性較好，其中硅藻土的生物 相容性最好。結果見表1。
[0037] 表1添加不同載體的海洋細菌GM-1發(fā)酵24h的菌落數(shù)

【權利要求】
1. 一種海洋細菌可濕性粉劑的制備方法，其特征在于，其步驟如下： (1) 海洋細菌GM-1菌株種子液的制備：將活化的海洋細菌GM-1菌株斜面菌種用2ml無 菌水清洗下，配制成濃度為l〇9cfu/ml的菌懸液，接入到裝有50miro培養(yǎng)基的250ml三角 瓶中，28°C、180r/min搖床培養(yǎng)24h，即得種子液，調(diào)整濃度為10 9個細胞/mL作為種子液； (2) 發(fā)酵：用50L發(fā)酵罐對海洋細菌GM-1菌株進行發(fā)酵，制備海洋細菌GM-1菌株發(fā)酵 液；發(fā)酵條件：裝液量為30L，接種量7%，種子液菌齡24h、濃度10 9cfu/ml，溫度28°C，攪拌 速度200r/min，通氣量3L/min，發(fā)酵時間36h ;生物量達2. 40 X 101(lcfu/mL ;得GM-1菌株發(fā) 酵液； (3) 成品粉劑制備：按飽和吸附量向發(fā)酵好的GM-1菌株發(fā)酵液中加入載體硅藻土，每 間隔lh攪拌一次，使載體充分吸附菌體，48h后GM-1菌體形成芽孢后，離心，沉淀置于60°C 電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干，即制得海洋細菌GM-1菌粉；最后將菌粉與穩(wěn)定劑硬脂酸鈣、 分散劑聚乙烯醇、濕潤劑十二烷基苯磺酸鈉按重量比75 :15 :6 :4進行混合，氣流粉碎機粉 碎，過300目篩，制備得到海洋細菌GM-1菌株可濕性粉劑。
2. 權利要求1所述的制備方法所制得的可濕性粉劑對植物病原真菌的毒力測定方法， 其特征在于，其步驟如下：將制備得到的GM-1菌株可濕性粉劑加入到裝有70mL PDA培養(yǎng) 基的250ml的三角瓶中，混合均勻，制成濃度不同的含藥平板，每個三角瓶為一個濃度，平 均倒入3個培養(yǎng)皿中，為3個重復；打取直徑為5mm的供試水稻紋枯病菌 solanii), iSclerotinio sclerotiorum),^^}^^'^^ iFusarium oxysporum), 菜早疫病菌)4種植物病原真菌菌苔，放入不同的含藥平板中央，28 °C 下培養(yǎng)5d ;以不加粉劑為對照，用十字交叉法測量菌落直徑，計算不同濃度的GM-1菌株可 濕性粉劑粉劑對不同病原真菌的抑制率，查詢抑制率幾率值，以粉劑濃度的對數(shù)為橫坐標， 抑制率的機率值為縱坐標，建立GM-1可濕性粉劑對4種植物病原真菌的毒力回歸方程，計 算的EC 5Q和EC9。。
3. 權利要求1或2所述的制備方法制得的海洋細菌可濕性粉劑作為防治水稻紋枯病農(nóng) 藥的用途。
【文檔編號】A01P3/00GK104145997SQ201410408371
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月19日 優(yōu)先權日:2014年8月19日
【發(fā)明者】暴增海, 馬桂珍, 王淑芳, 周向紅 申請人:淮海工學院