一種提高胭脂蘿卜胚胎發(fā)生率的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高胭脂蘿卜胚胎發(fā)生率的方法，包括：取胭脂蘿卜花蕾，滅菌后加入B5洗滌培養(yǎng)基，制成懸浮液，過濾所得濾液經(jīng)離心得到沉淀；依次加入NLN‐13誘導(dǎo)培養(yǎng)基和活性炭混合液，得到小孢子懸浮液；分裝到無菌培養(yǎng)皿中后加入無菌青花菜花藥，Parafilm封口后熱擊處理；經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)后，得到子葉型胚狀體；接種至胚狀體分化培養(yǎng)基中直至分化，再生成芽；切取再生芽接種至生根培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)，經(jīng)煉苗和移栽，得到再生植株。該方法將易出胚的青花菜花藥與難出胚的胭脂蘿卜游離小孢子按一定比例混合培養(yǎng)，從而促進(jìn)難出胚的胭脂蘿卜胚胎發(fā)育，獲得大量再生植株，提高培養(yǎng)效率。
【專利說明】一種提高胭脂蘿卜胚胎發(fā)生率的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種促進(jìn)胭脂蘿卜小孢子胚胎發(fā)生 的培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 胭脂蘿卜（Raphanus Sativus L. Sinoruber Makino)是十字花科蘿卜屬蘿卜種下 的一個(gè)地方品種，其肉質(zhì)根營(yíng)養(yǎng)豐富，質(zhì)地更致密，適宜加工各種蘿卜干，同時(shí)肉質(zhì)根皮、心 全紅，蘿卜紅色素含量高且色素品質(zhì)和溶解性均優(yōu)于其它紅蘿卜，因此紅心蘿卜是提取天 然食用紅色素的理想原料作物，在我國(guó)西南地區(qū)已有較大的栽培面積。從胭脂蘿卜中提取 得到的蘿卜紅色素具有化學(xué)穩(wěn)定性好、貯藏穩(wěn)定性、耐熱性優(yōu)等特點(diǎn)，此外，它還具有一定 的抗氧化性，是對(duì)人體有保健功能的著色劑。
[0003] 目前，生產(chǎn)上使用的胭脂蘿卜品種種質(zhì)資源較少、性狀不齊，葉色、葉型、根型雜亂 不一；假紅心，皮色整齊，肉色以花心為主，普遍混雜白心，部分群體無典型的紅心，心皮全 紅的特色已不顯著；色素含量低，鮮產(chǎn)量不高等。亟需廣泛收集、整理國(guó)內(nèi)外胭脂蘿卜種質(zhì) 資源，利用現(xiàn)代育種技術(shù)手段進(jìn)行提純復(fù)壯，選育出具有心皮全紅顯著特性的、不同類型的 胭脂蘿卜自交系育種材料，并配制雜交種，提高資源利用效率。
[0004] 蘿卜雜種優(yōu)勢(shì)極明顯，傳統(tǒng)的多代自交分離親本自交系的方法一般需要5?6年 的時(shí)間，而游離小孢子培養(yǎng)方法可以在1?2年內(nèi)獲得單倍體植株，加倍后成為純合自交 系，因此，蘿卜小孢子培養(yǎng)技術(shù)在優(yōu)良自交系的創(chuàng)制和提高新品種選育的效率等方面具有 重要作用。游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在蘿卜遺傳研究和育種中具有很大的應(yīng)用潛力。經(jīng)過多年 努力，雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)提高蘿卜小孢子胚胎發(fā)生頻率方面的研究做了大量深入的研究， 但與其它十字花科作物相比，其胚狀體誘導(dǎo)率和再生率較低，嚴(yán)重阻礙了小孢子培養(yǎng)技術(shù) 的應(yīng)用。而在胭脂蘿卜育種中，小孢子培養(yǎng)技術(shù)沒有得到應(yīng)用。本文在前期研究的基礎(chǔ)上， 采用胭脂蘿卜游離小孢子與青花菜易出胚基因型花藥共培養(yǎng)，顯著促進(jìn)胭脂蘿卜小孢子胚 胎發(fā)育，獲得了大量再生植株，所需時(shí)間較短，操作簡(jiǎn)便。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種提高胭脂蘿卜胚胎發(fā)生的培養(yǎng)方法，采用胭脂蘿卜與易出胚的 青花菜花藥按一定數(shù)目配比共培養(yǎng)，從而促進(jìn)胭脂蘿卜小孢子出胚，提高小孢子培養(yǎng)的出 胚率。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0007] 一種提高胭脂蘿卜胚胎發(fā)生率的方法，包括以下步驟：
[0008] 1)取胭脂蘿卜和青花菜花蕾，滅菌；
[0009] 2)將混合花蕾滅菌后的胭脂蘿卜游離小孢子與青花菜花藥置于培養(yǎng)液中，經(jīng)熱擊 后混合培養(yǎng)，誘導(dǎo)獲得子葉型胚狀體；
[0010] 3)將子葉型胚狀體接種至固體分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到再生植株；
[0011] 4)從再生植株切取再生芽，接入生根培養(yǎng)基，獲得完整植株；
[0012] 所述胭脂蘿卜小孢子出胚率差，青花菜易出胚。
[0013] 所述胭脂蘿卜和青花菜的花蕾均處于單核晚期至雙核早期。
[0014] 所述胭脂蘿卜和青花菜的花蕾與花藥的數(shù)量比為1 :5?8。
[0015] 所述胭脂蘿卜小孢子與青花菜花藥混合液采用32?33°C熱擊處理1?3天。
[0016] 所述培養(yǎng)液為NLN-13液體培養(yǎng)基和無菌活性炭混合液的混合物，其中活性炭混 合液的組成為：1L NLN液體培養(yǎng)基、2?5g瓊脂糖和lg活性炭。
[0017] 所述的 NLN 液體培養(yǎng)基，以 1L 計(jì)，組成為：KN03125mg，Ca (N03) 2 · 4H20 500mg， MgS04 · 7H20 125mg，KH2P04 125mg，H3B〇3 6. 2mg，MnS04 · H20 18. 95mg，ZnS04 · 7Η208· 6mg， Na2Mo04 · 2H20 0· 25mg，CuS04 · 5H20 0· 025mg，CoCl2 · 6H20 0· 025mg，維生素 B1 0· 5mg，維生 素 B6 0.5mg，生物素 0.05mg，葉酸 0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，F(xiàn)eS04*7H20 27.8mg，肌醇 100mg， 甘氨酸2mg，煙酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，維生素B5 5mg，絲氨酸lOOmg和 余量的無菌水。
[0018] 所述小孢子懸浮液與花藥混合熱擊后，先在25°C、黑暗條件下恒溫培養(yǎng)10?15天 至肉眼可見細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)后，移到25°C、黑暗條件下50?60rpm振蕩培養(yǎng)10?15天，得到葉 型胚狀體。
[0019] 所述固體分化培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基+蔗糖30g/L，瓊脂10?12g/L，pH 5. 9?6. 1。
[0020] 所述的 B5 液體培養(yǎng)基，以 1L 計(jì)，組成為：NaH2P04 · 2H20 169. 5mg，KN032 5 00mg， (NH4)2S04 1 34mg，MgS04 · 7H20 500mg，MnS04 · 4H20 10mg，H3B03 3mg，ZnS04 · 7H20 2mg，KI 0. 75mg，Na2Mo04 · 2H20 0. 25mg，CuS04 · 5H20 0. 025mg，CoCl2 · 6H20 0. 025mg，Na2_EDTA 37.3mg，F(xiàn)eS04*7H20 27.8mg，CaCl2.2H20 150mg，VBl 10mg，VB6 lmg，VPP lmg，肌醇 lOOmg和 余量的蒸餾水。
[0021] 所述生根培養(yǎng)基由1/2MS培養(yǎng)基1L+0. 1?(λ 2mg/L ΝΑΑ+(λ 1?(λ 2mg/L IBA、蔗 糖或白砂糖20?30g/L和瓊脂7?8g/L組成，pH 5. 8?6. 0。
[0022] 所述的 MS 培養(yǎng)基，以 1L 計(jì)，組成為：NH4H03 1650mg，KN03 1 900mg， CaCl2 · 2H20440mg, KH2P04 170mg, MgS04 · 7H20 370mg, FeS04 · 7H20 27. 8mg, Na2EDTA 37. 3mg, H3BO36. 2mg, MnS04 · H20 16. 9mg, ZnS04 · 7H20 8. 6mg, Na2Mo04 · 2H20 0. 25mg, CuS04 · 5H20 0· 025mg，CoCl2 · 6H20 0· 025mg，KI 0· 83mg，肌醇 lOOmg,甘氛酸 2mg，煙酸 0· 5mg，維生素 B1 0· lmg，維生素B6 0· 5mg和余量的無菌水。
[0023] 本發(fā)明的有益效果為：
[0024] (1)本發(fā)明針對(duì)胭脂蘿卜小孢子培養(yǎng)難出胚的問題，提供了一種提高出胚率的簡(jiǎn) 便方法。以易出胚的青花菜花藥與胭脂蘿卜游離小孢子按一定比例混合共培養(yǎng)，以易出胚 的青花菜花藥帶動(dòng)難出胚的材料出胚，提高出胚率。本發(fā)明方法共培養(yǎng)胭脂蘿卜出胚率最 高達(dá)16. 2個(gè)/蕾，而對(duì)照蘿卜出胚率最高僅為0. 8個(gè)/蕾，解決了胭脂蘿卜小孢子培養(yǎng)胚 胎發(fā)生頻率低的問題，提高了小孢子培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用效率。
[0025] (2)最終在相同培養(yǎng)條件下，混合培養(yǎng)最后得到了 59株胭脂蘿卜小孢子再生植 株，而單獨(dú)培養(yǎng)的對(duì)照株數(shù)為1株。
[0026] (3)所采用的方法簡(jiǎn)便易行，培養(yǎng)得到的小孢子再生植株群體為胭脂蘿卜，不需要 對(duì)植株類型進(jìn)行鑒定，從而減少了工作量，提高了培養(yǎng)效率，具有可操作性。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 培養(yǎng)方法按如下步驟進(jìn)行。
[0029] (1)培養(yǎng)基配制：包括小孢子不同培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基，其組分與各組分在每升培 養(yǎng)基中所含的重量為 ：
[0030] 1)B5洗滌培養(yǎng)基：B5液體培養(yǎng)基1L+蔗糖30g/L，pH 6. 0,高溫高壓；
[0031] 所述的 B5 液體培養(yǎng)基，以 1L 計(jì)，組成為：NaH2P04 · 2H20 169. 5mg，KN032 5 00mg， (NH4)2S04 1 34mg, MgS04 · 7H20 500mg, MnS04 · 4H20 lOmg, H3B03 3mg, ZnS04 · 7H20 2mg, KI 0. 75mg, Na2Mo04 · 2H20 0. 25mg, CuS04 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg, Na2-EDTA 37.3mg，F(xiàn)eS04*7H20 27.8mg，CaCl2.2H20 150mg，VBl 10mg，VB6 lmg，VPP lmg，肌醇 lOOmg和 余量的蒸餾水。
[0032] 2)胚狀體分化培養(yǎng)基：B5培養(yǎng)基+蔗糖20g/L，瓊脂10g/L，pH 6. 0,高溫高壓滅 菌；
[0033] 3)NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基，NLN液體培養(yǎng)基1L+蔗糖130g/L，pH 6. 0,過濾滅菌；
[0034] 所述的 NLN 液體培養(yǎng)基，以 1L 計(jì)，組成為：KN03 125mg，Ca(N03)2 · 4H20 500mg， MgS04 · 7H20 125mg, KH2P04125mg, Η3Β036· 2mg, MnS04 · H20 18. 95mg, ZnS04 · 7Η208· 6mg, Na2Mo04 · 2H20 0· 25mg，CuS04 · 5H20 0· 025mg，CoCl2 · 6H20 0· 025mg，維生素 B1 0· 5mg，維生 素 B6 0.5mg，生物素 0.05mg，葉酸 0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，F(xiàn)eS04*7H20 27.8mg，肌醇 lOOmg， 甘氨酸2mg，煙酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，維生素B5 5mg，絲氨酸lOOmg和 余量的無菌水。
[0035] 4)生根培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，pH 5. 8,高溫高壓滅菌；
[0036] 所述的]\^培養(yǎng)基，以比計(jì)，組成為：順4!103165011^，謂0 3190011^，03(：12.2!12044011^， KH 2P〇4 170mg, MgS04 · 7H20 370mg, FeS04 · 7H20 27. 8mg, Na2EDTA 37. 3mg, H3B03 6. 2mg, MnS04 · H20 16. 9mg，ZnS04 · 7H20 8. 6mg，Na2Mo04 · 2H20 0. 25mg，CuS04 · 5H20 0. 025mg， C〇C12.6H20 (X 025mg，KI (X83mg，肌醇 lOOmg，甘氨酸 2mg，煙酸(X5mg，維生素 B1 O.lmg，維 生素B6 0. 5mg和余量的無菌水。
[0037] (2)胭脂蘿卜小孢子與青花菜花藥共培養(yǎng)促進(jìn)胚胎發(fā)生的培養(yǎng)方法：
[0038] 1)花蕾選?。喝‰僦}卜花瓣和花藥長(zhǎng)度比為1. 1、青花菜為1. 1、單核晚期至雙 核早期、健康、無病蟲害的花蕾，作為小孢子培養(yǎng)的供體；
[0039] 2)花蕾的滅菌：用lg升汞+1L無菌水配制成滅菌液；把胭脂蘿卜和青花菜混合花 蕾放入無菌培養(yǎng)皿中，加入滅菌液，放到搖床上搖動(dòng)進(jìn)行表面消毒10分鐘，再在超凈工作 臺(tái)上用無菌水蕩洗3次后，備用；
[0040] 3)在超凈工作臺(tái)上將12個(gè)無菌花蕾置于無菌燒杯中，加入10ml B5洗滌培養(yǎng)基， 用平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液；該懸浮液用45 μ m孔徑的無菌濾網(wǎng)過濾到50ml離心管 中，蓋緊，600rpm/min離心3min，離心后倒掉上清液，往沉淀中加入10ml B5洗漆培養(yǎng)基，按 上述方法再離心2次，棄上清液；加入NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基40ml，再加入由NLN-13液體培養(yǎng) 基+瓊脂糖5g/L+lg/L活性炭配制、高溫滅菌而成的活性炭混合液10滴，得到小孢子的濃 度為1 X 105個(gè)/mL的小孢子混合懸浮液；
[0041] 4)將該小孢子懸浮液分裝到60mm塑料無菌培養(yǎng)皿中，每60mm培養(yǎng)皿加4ml小孢 子混合懸浮液和5個(gè)青花菜無菌花藥，加蓋后用parafilm膜封口，后置于32. 5°C恒溫生化 培養(yǎng)箱里、黑暗條件下熱激處理2天；然后取出置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中、黑暗條件下繼續(xù)培 養(yǎng)；至肉眼可見胚狀體時(shí)，置于25°C搖床上、黑暗條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)20天，得到子葉型胚狀體 并發(fā)育成熟；
[0042] 5)將子葉型胚狀體接種至胚狀體分化培養(yǎng)基中，在每天16小時(shí)光照、25°C下培養(yǎng) 3周至形成胚狀體；按照一定大小把胚狀體切成3塊大小差不多的塊，接種到胚狀體分化培 養(yǎng)基中在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，直至分化、再生成芽；
[0043] 6)切取生長(zhǎng)健康的再生芽接種至生根培養(yǎng)基上，在每天16小時(shí)光照、25°C下進(jìn)行 生根培養(yǎng)；3周后將根生長(zhǎng)健壯的苗進(jìn)行煉苗3天；移栽時(shí)用清水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基， 后把植株植于蔬菜育苗專用基質(zhì)穴盤，塑料膜罩住保濕，在溫室中培養(yǎng)10天后移栽，得到 再生植株；
[0044] (3)除了步驟1)中僅取胭脂蘿卜生長(zhǎng)健康、無病蟲害的花序作為小孢子培養(yǎng)的供 體植株之外，其它操作同"（2)胭脂蘿卜小孢子與青花菜花藥共培養(yǎng)促進(jìn)胚胎發(fā)生的培養(yǎng) 方法"，作為對(duì)照。
[0045] 結(jié)果：混合培養(yǎng)蘿卜出胚率為13. 5個(gè)/蕾，而對(duì)照蘿卜出胚率僅為1. 1個(gè)/蕾。 最終，混合培養(yǎng)得到57株紫花菜小孢子再生植株，而對(duì)照獲得1株。
[0046] 實(shí)施例2
[0047] 除了步驟（1)中：1)B5洗滌培養(yǎng)基：B5液體培養(yǎng)基1L+蔗糖30g/L，pH6.0,高溫高 壓；2)NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基：NLN-13液體培養(yǎng)基1L+蔗糖130g/L，pH 6. 1，過濾滅菌；3)胚狀 體分化培養(yǎng)基：B5培養(yǎng)基+蔗糖20g/L，瓊脂llg/L，pH 6. 0,高溫高壓滅菌；4)生根培養(yǎng)基： MS培養(yǎng)基+白糖20g/L，瓊脂7g/L，pH 5. 9,高溫高濕滅菌；
[0048] (2)胭脂蘿卜小孢子與青花菜花藥共培養(yǎng)促進(jìn)胚胎發(fā)生的培養(yǎng)方法：
[0049] 1)花蕾選?。喝‰僦}卜花瓣和花藥長(zhǎng)度比為1. 0、青花菜為1. 0、單核晚期至雙 核早期、健康、無病蟲害的花蕾，作為小孢子培養(yǎng)的供體；
[0050] 2)花蕾的滅菌：用lg升汞+1L無菌水配制成的滅菌液；把胭脂蘿卜和青花菜混合 花蕾放入無菌培養(yǎng)皿中，加入滅菌液，放到搖床上搖動(dòng)進(jìn)行表面消毒12分鐘，再在超凈工 作臺(tái)上用無菌水蕩洗4次后，備用；
[0051] 3)在超凈工作臺(tái)上將13個(gè)無菌胭脂蘿卜花蕾置于無菌燒杯中，加入10ml B5洗滌 培養(yǎng)基，用平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液；該懸浮液用45 μ m無菌濾網(wǎng)過濾到50ml離心管 中，蓋緊，900rpm/min離心5min，離心后倒掉上清液，往沉淀中加入10ml B5誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按 上述方法再離心1次，棄上清液；加入NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基40ml，再加入由NLN-13液體培養(yǎng) 基+瓊脂糖2g/L+lg/L活性炭配制、高溫滅菌而成的活性炭混合液10滴，得到小孢子的濃 度為0. 8X 105個(gè)/mL的小孢子懸浮液；
[0052] 4)將該小孢子懸浮液分裝到90mm玻璃無菌培養(yǎng)皿中，每90mm培養(yǎng)皿加10ml小孢 子混合懸浮液和8個(gè)青花菜花藥，加蓋后用parafilm膜封口，后置于33°C恒溫生化培養(yǎng)箱 里、黑暗條件下熱激處理3天；后取出置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)；至肉 眼可見胚狀體時(shí)，置于25°C搖床上、黑暗條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)25天，得到子葉型胚狀體并發(fā)育 成熟；
[0053] 5)將子葉型胚狀體接種至胚狀體分化培養(yǎng)基中，在每天16小時(shí)光照、25°C下培養(yǎng) 2周至形成胚狀體；把胚狀體直接接種到胚狀體分化培養(yǎng)基中在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，直 至分化、再生成芽；
[0054] 6)切取生長(zhǎng)健康的再生芽接種至生根培養(yǎng)基上，在每天16小時(shí)光照、25°C下進(jìn)行 生根培養(yǎng)；3周后將根生長(zhǎng)健壯的苗進(jìn)行煉苗5天；移栽時(shí)用清水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基， 后把植株植于蔬菜育苗基質(zhì)穴盤，塑料膜罩住保濕，在溫室中培養(yǎng)8天后移栽，得到再生植 株；
[0055] 其余操作同時(shí)實(shí)施例1。
[0056] 結(jié)果：共培養(yǎng)蘿卜出胚率為14.5個(gè)/蕾，而對(duì)照蘿卜出胚率僅為1.2個(gè)/蕾。最 終，混合培養(yǎng)得到59株蘿卜小孢子再生植株，而對(duì)照獲得2株。
[0057] 實(shí)施例3
[0058] 除了步驟⑴中：1)B5洗滌培養(yǎng)基：B5液體培養(yǎng)基1L+蔗糖30g/L，pH6.0,高溫高 壓；2)NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基：NLN-13液體培養(yǎng)基1L+蔗糖130g/L，pH 6. 1，過濾滅菌；3)胚狀 體分化培養(yǎng)基：B5培養(yǎng)基+蔗糖20g/L，瓊脂llg/L，pH 6. 0,高溫高壓滅菌；4)生根培養(yǎng)基： MS培養(yǎng)基+白糖20g/L，瓊脂7g/L，pH 5. 9,高溫高濕滅菌；
[0059] (2)胭脂蘿卜小孢子與青花菜花藥共培養(yǎng)促進(jìn)胚胎發(fā)生的培養(yǎng)方法：
[0060] 1)花蕾選?。喝‰僦}卜花瓣和花藥長(zhǎng)度比為0. 9、青花菜為0. 9、單核晚期至雙 核早期、健康、無病蟲害的花蕾，作為小孢子培養(yǎng)的供體；
[0061] 2)花蕾的滅菌：用lg升汞+1L無菌水配制成的滅菌液；把胭脂蘿卜和青花菜混合 花蕾放入無菌培養(yǎng)皿中，加入滅菌液，放到搖床上搖動(dòng)進(jìn)行表面消毒11分鐘，再在超凈工 作臺(tái)上用無菌水蕩洗5次后，備用；
[0062] 3)在超凈工作臺(tái)上將11個(gè)無菌胭脂蘿卜花蕾置于無菌燒杯中，加入10ml B5誘導(dǎo) 培養(yǎng)基，用平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液；該懸浮液用45 μ m無菌濾網(wǎng)過濾到50ml離心管 中，蓋緊，700rpm/min離心5min，離心后倒掉上清液，往沉淀中加入10ml B5誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按 上述方法再離心2次，棄上清液；加入NLN-13誘導(dǎo)培養(yǎng)基40ml，再加入由NLN-13液體培養(yǎng) 基+瓊脂糖3. 5g/L+lg/L活性炭配制、高溫滅菌而成的活性炭混合液10滴，得到小孢子的 濃度為1. 2 X 105個(gè)/mL的小孢子混合懸浮液；
[0063] 4)將該小孢子懸浮液分裝到60mm玻璃無菌培養(yǎng)皿中，每60mm培養(yǎng)皿加4ml小孢 子混合懸浮液和6個(gè)無菌青花菜花藥，加蓋后用parafilm膜封口，后置于33°C恒溫生化培養(yǎng) 箱里、黑暗條件下熱激處理2天；后取出置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)；至 肉眼可見胚狀體時(shí)，置于25°C搖床上、黑暗條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)22天，得到子葉期胚狀體并發(fā) 育成熟；
[0064] 5)將子葉期胚狀體接種至胚狀體分化培養(yǎng)基中，在每天16小時(shí)光照、25°C下培養(yǎng) 2. 5周至形成胚狀體；把胚狀體切成2塊大小差不多的塊接種到胚狀體分化培養(yǎng)基中在相 同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，直至分化、再生成芽；
[0065] 6)切取生長(zhǎng)健康的再生芽接種至生根培養(yǎng)基上，在每天16小時(shí)光照、25°C下進(jìn)行 生根培養(yǎng)；3周后煉苗4天；移栽時(shí)用清水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，然后把植株植于育苗專 用基質(zhì)穴盤，塑料膜罩住保濕，在溫室中培養(yǎng)9天后移栽，得到再生植株；
[0066] 其余操作同實(shí)施例1。
[0067] 結(jié)果：共培養(yǎng)胭脂蘿卜出胚率為10. 6個(gè)/蕾，而對(duì)照出胚率僅為0. 7個(gè)/蕾。最 終，混合培養(yǎng)得到60株蘿卜小孢子再生植株，而對(duì)照獲得3株。
【權(quán)利要求】
1. 一種提高胭脂蘿卜胚胎發(fā)生率的方法，包括以下步驟： 1) 取胭脂蘿卜和青花菜的花蕾，滅菌； 2) 將混合花蕾滅菌后的胭脂蘿卜游離小孢子與青花菜花藥置于培養(yǎng)液中，經(jīng)熱擊后混 合培養(yǎng)，誘導(dǎo)獲得子葉型胚狀體； 3) 將子葉型胚狀體接種至固體分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到再生植株； 4) 從再生植株切取再生芽，接入生根培養(yǎng)基，獲得完整植株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高胭脂蘿卜胚胎發(fā)生率的方法，其特征在于，所述胭脂 蘿卜小孢子出胚率差，青花菜易出胚。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種提高胭脂蘿卜胚胎發(fā)生率的方法，其特征在于，所述胭 脂蘿卜和青花菜的花蕾均處于單核晚期至雙核早期。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述一種提高胭脂蘿卜胚胎發(fā)生率的方法，其特征在于，所述胭脂 蘿卜花蕾與青花菜花藥的數(shù)量比為1 :5?8。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或4所述一種提高胭脂蘿卜胚胎發(fā)生率的方法，其特征在于，月因 脂蘿卜小孢子與青花菜花藥混合液采用32?33°C熱擊處理1?3天。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種提高胭脂蘿卜胚胎發(fā)生率的方法，其特征在于，步驟 2)中所述培養(yǎng)液為NLN-13液體培養(yǎng)基和無菌活性炭混合液的混合物，其中活性炭混合液 的組成為：1L NLN液體培養(yǎng)基、2?5g瓊脂糖和lg活性炭。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述一種提高胭脂蘿卜胚胎發(fā)生率的方法，其特征在于，所述小孢 子懸浮液與花藥混合熱擊后，先在25°C、黑暗條件下恒溫培養(yǎng)10?15天至肉眼可見細(xì)胞團(tuán) 出現(xiàn)后，移到25°C、黑暗條件下50?60rpm振蕩培養(yǎng)10?15天，得到子葉型胚狀體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或4或6所述一種提高胭脂蘿卜胚胎發(fā)生率的方法，其特征在 于，步驟3)中所述固體分化培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基+蔗糖30g/L，瓊脂10?12g/L，pH 5. 9? 6. 1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述一種提高胭脂蘿卜胚胎發(fā)生率的方法，其特征在于，所述生根 培養(yǎng)基由1/2MS培養(yǎng)基1L+0. 1?0. 2mg/L ΝΑΑ+0. 1?0. 2mg/L IBA、蔗糖或白砂糖20? 30g/L和瓊脂7?8g/L組成，pH 5. 8?6. 0。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104186309SQ201410371104
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月30日
【發(fā)明者】張振超, 毛忠良, 潘躍平, 吳國(guó)平, 王建華, 戴忠良, 秦文斌, 姚悅梅, 潘永飛, 肖燕, 孫春青, 馬志虎, 孫國(guó)勝 申請(qǐng)人:鎮(zhèn)江瑞繁農(nóng)藝有限公司