細柱五加的離體快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種細柱五加快速繁殖方法，進行規(guī)?；a(chǎn)和繁殖以滿足市場需要細柱五加組織培養(yǎng)步驟包括：A.外殖體消毒，B.無菌苗獲得，C.腋芽生長培養(yǎng)，D.叢生芽誘導(dǎo)，E.生根培養(yǎng)，F(xiàn)?煉苗與移栽。采用植物組織培養(yǎng)的方法繁殖細柱五加，不僅不受外界條件的影響，四季皆可進行，節(jié)約苗木占地，降低生產(chǎn)成本，而且可以保存母體的全部優(yōu)良性狀，遺傳性狀穩(wěn)定。這種方法可在短時間內(nèi)形成大量的優(yōu)良試管苗，進行規(guī)模化、工廠化生產(chǎn)，為觀賞園藝、制藥等產(chǎn)業(yè)提供大量的原材料。
【專利說明】【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及細柱五加快速繁殖方法，屬于植物的人工繁殖和栽培方法【技術(shù)領(lǐng)域】。 細柱五加的離體快速繁殖方法 【背景技術(shù)】
[0002] 五加始載于本草學(xué)著作《神農(nóng)本草經(jīng)》，稱之為"五加皮"，列為上品。"氣味辛，溫。 主心腹疝氣腹痛，益氣療甓，小兒不能行，疽瘡陰蝕。"此后在《名醫(yī)別錄》、《東華真人煮石 經(jīng)》等歷代醫(yī)藥著作中均有五加的記載和描述。但是由于古代文獻對五加原植物的描述不 甚詳細，而且五加屬植物形態(tài)較為相似，經(jīng)前人考證，五加皮來源于五加科（Araliaceae) 五加屬（Acanthopanax Miq.)植物。
[0003] 經(jīng)中國藥典確定細柱五加 （Acanthopanax gracilistylus W. W. Smith)的干燥根 皮是中國藥典中"五加皮"的唯一正品來源。五加皮為一味名貴滋補強壯藥，具祛風(fēng)濕，補 肝腎，強筋骨的特異功效，目前國內(nèi)外均未見大面積人工種植報道，市場供應(yīng)主要以采集野 生資源為主，由于自然繁殖困難和采挖根皮的嚴重破壞，五加皮在國內(nèi)中醫(yī)藥市場上已脫 銷幾十年之久，即使在細柱五加的主產(chǎn)地華東、華中等地藥材市場，五加皮也嚴重供不應(yīng)求 長期脫銷。
[0004] 由于細柱五加種子萌發(fā)率低，在生產(chǎn)應(yīng)用中都是通過扦插育苗進行繁殖的。但是， 長期的扦插繁殖是導(dǎo)致植物活力的減弱和帶病毒的重要原因，并嚴重影響五加對逆境的抵 抗能力及質(zhì)量，且制約了五加的育種進程。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種細柱五加快速繁殖方法，進行規(guī)模化生產(chǎn)以及以細柱 五加組培為基礎(chǔ)的其他學(xué)科的研究工作的需要。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下，該種細柱五加快速繁殖方法的主要特點是：
[0007] A外殖體消毒：選取腋芽飽滿且尚未萌發(fā)的嫩枝，摘去葉片，然后將枝條剪為約 2cm的小段，每段帶一對腋芽，采用多方式消毒漂洗后，用無菌水沖洗4?6遍，最后用無菌 濾紙吸干表面水分；
[0008] B腋芽誘導(dǎo)：將消毒好的細柱五加莖段切成1. 0-1. 5cm的帶芽節(jié)段，接種到以下培 養(yǎng)基中：WPM基本培養(yǎng)基，蔗糖20?40g/L，植物生長激素0. 2?2. Omg/L，適當pH值下進 行光照培養(yǎng)；
[〇〇〇9] C腋芽培養(yǎng)：將腋芽萌發(fā)后培養(yǎng)20天左右的無菌苗莖尖用剪刀剪下，接種到以下 培養(yǎng)基中：WPM基本培養(yǎng)基，蔗糖20?40g/L，植物生長激素0. 2?2. Omg/L，適當pH值下 進行光照培養(yǎng)；
[0010] D叢生芽誘導(dǎo)：將生長至8cm左右的芽苗切下，分成帶有一對腋芽的小段：WPM基 本培養(yǎng)基，植物生長激素0. 5?1. Omg/L，進行光照培養(yǎng)30?40天；
[0011] E生根培養(yǎng)：選取健壯的試管苗，經(jīng)過修剪后，在含植物生長激素400?500mg/L 浸泡10-15min后接種到如下培養(yǎng)基中：1/2WPM或WPM基本培養(yǎng)基，蔗糖20?40g/L，進行 光照培養(yǎng)50?60天。
[0012] F煉苗移栽：將組培瓶蓋打開，并添加一定量蒸餾水進行有菌條件馴化一段時間； 用鑷子將組培苗從瓶中取出，移栽到已經(jīng)滅菌的栽培基質(zhì)中，進行遮陰馴化3周，期間不定 期的噴施1/2WPM營養(yǎng)液。
[0013] 所述的細柱五加快速繁殖方法的延伸技術(shù)方案包括：步驟A中的多方式消毒漂洗 為：用0. 1 %的安利洗滌液在搖床上震蕩洗滌15?20min，流水沖洗30?60min后，再在超 凈工作臺上用75%的酒精漂洗30s，無菌水清洗4遍后，用含0. 1 %升汞滅菌50?60min。
[0014] 所述的細柱五加快速繁殖方法的延伸技術(shù)方案包括：步驟B、C、D、E中細柱五 加快速繁殖所述的培養(yǎng)基中涉及的植物生長激素，包括6-卞基腺嘌呤出-BA)、吲哚丁酸 (IBA)、萘乙酸（NAA)、赤霉素（GA 3)、反玉米素（ZT)、3-吲哚乙酸（IAA)、多效唑其中一種或 幾種。
[0015] 所述的細柱五加快速繁殖方法的延伸技術(shù)方案包括：步驟B、C、D、E中細柱五加快 速繁殖所述的培養(yǎng)條件為：光照周期10?16h/d，光照強度1000?3000LUX，培養(yǎng)溫度22? 26。。。
[0016] 所述的細柱五加快速繁殖方法的延伸技術(shù)方案包括：步驟B、C中所涉及到的pH值 范圍為5. 7?7. 0。
[0017] 所述的細柱五加快速繁殖方法的延伸技術(shù)方案包括：步驟F中添加蒸餾水5? l〇ml，進行有菌馴化2-3天。
[0018] 所述的細柱五加快速繁殖方法的延伸技術(shù)方案包括：步驟B、C中所涉及到的植物 生長激素包括吲哚丁酸（IBA) 1. 0?2. 0mg/L，6-卞基腺嘌呤（6-BA)0. 5?5. Omg/L，萘乙酸 (ΝΑΑ)0· 1 ?0· 2mg/L。
[0019] 所述的細柱五加快速繁殖方法的延伸技術(shù)方案包括：步驟D中所涉及到的植物生 長激素包括反玉米素（ΖΤ)0. 5?1. Omg/L，吲哚丁酸（IBA)O. 1?0. 5mg/L。
[0020] 所述的細柱五加快速繁殖方法的延伸技術(shù)方案包括：步驟E中所涉及到的植物生 長激素包括萘乙酸（ΝΑΑ)0· 1?0· 2mg/L，多效唑5. 0?10. Omg/L。
[0021] 采用植物組織培養(yǎng)的方法繁殖細柱五加，不僅可以擺脫外界條件的影響，四季都 能進行生產(chǎn)，而且可以節(jié)約育苗占地，降低生產(chǎn)成本。植物組織培養(yǎng)技術(shù)是利用細胞的全能 性，采取植物體上的細胞團塊組織，通過人為條件的控制，使這些組織形成千百萬植株，并 且保存了母體的全部優(yōu)良性狀，且遺傳性狀穩(wěn)定。這種方法保留了細柱五加的植株活性，可 在短期內(nèi)形成大量優(yōu)良試管苗，縮短生長周期，適宜規(guī)?；?、工廠化生產(chǎn)。
[0022] 以下便結(jié)合實施例并附圖，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步的詳述。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1是取材用的細柱五加植株圖；
[0024] 圖2是誘導(dǎo)2-3周后萌發(fā)的腋芽圖（培養(yǎng)條件：WPM+IBA2. 0mg/L+6-BA0. 5mg/ L+NAAO. 2mg/L+ 食用糖 30g/L，16h/d 光照培養(yǎng)）；
[0025] 圖3是在最佳生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)腋芽苗圖（培養(yǎng)條件:WPM+IBA2. Omg/ L+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 2mg/L+ 食用糖 30g/L，16h/d 光照培養(yǎng)）；
[0026] 圖4是叢生芽誘導(dǎo)圖（培養(yǎng)條件：WPM+ZTlmg/L+IBAO. 5mg/L+食用糖30g/L，16h/ d光照培養(yǎng)）；
[0027] 圖5是組培苗在步驟E中處理后的生根情況圖（培養(yǎng)條件：1/2WPM+NAA0. 2mg/L+ 多效唑10. 0mg/L+食用糖15g/L，16h/d光照培養(yǎng)）；
[0028] 圖6是經(jīng)煉苗馴化的移栽組培苗圖。 【具體實施方式】
[0029] 下面結(jié)合細柱五加快速繁殖的實例說明本發(fā)明的【具體實施方式】。
[0030] 實施例1腋芽的誘導(dǎo)和培養(yǎng)
[0031] 1、取細柱五加的幼嫩莖段，用0. 1 %的安利洗滌液在搖床上震蕩洗滌15?20min， 流水沖洗60min后，再在超凈工作臺上用75%的酒精漂洗30s，無菌水清洗4遍后，用含 0. 1% HgCl2消毒50?60min (在升萊中加入幾滴吐溫80)，無菌水沖洗4?6次，最后用無 菌濾紙吸干種子表面水分。
[0032] 2、將消毒好的細柱五加莖段直接接種到腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中：WPM基本培養(yǎng)基中添 力口，蔗糖（食用糖）30g/L，適當pH值；培養(yǎng)溫度25°C，光照強度3000LUX，光照時間16h，進 行光照培養(yǎng)。
[0033] 3、將腋芽萌發(fā)后培養(yǎng)20天無菌苗莖尖用剪刀剪下，接種到本發(fā)明的腋芽生長 培養(yǎng)基中，具體配方為在WPM基本培養(yǎng)基中添加植物激素 IBA2. Omg/L、BAO. 5mg/L和 NAAO. 2mg/L，鹿糖30g/L，進行光照培養(yǎng)。
[0034] 實施例2叢生芽的誘導(dǎo)和試管苗的生根、移栽
[0035] 1、培養(yǎng)30天后，待芽苗生長至6_8cm，將芽苗重新接種到本發(fā)明的叢生芽誘導(dǎo)培 養(yǎng)基中，進行增殖培養(yǎng)。叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加植物生長 激素 ZTlmg/L和IBAO. 5mg/L，蔗糖（食用糖）30g/L，進行增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)30天以上，誘導(dǎo) 率達到98%，大部分芽苗可誘導(dǎo)出叢生芽數(shù)達到3?5條。
[0036] 2、選取生長健壯的試管苗，將其浸泡在已經(jīng)滅過菌的含NAAO. 2mg/L和多效唑 10. Omg/L的溶液中l(wèi)Omin，然后接種到1/2WPM基本培養(yǎng)基上，蔗糖（食用糖）15g/L，進行生 根誘導(dǎo)。培養(yǎng)40天后，生根率達86 %，平均根數(shù)目達18. 5根。
[0037] 3、將細柱五加組培苗生根培養(yǎng)1. 5?2個月后開始進行煉苗移栽，首先將組培瓶 移入光照培養(yǎng)箱，進行變溫變光馴化5?7天，再將組培瓶蓋打開，并添加10ml蒸餾水，進 行有菌條件馴化2?3天。然后將組培苗移栽到已經(jīng)滅菌的栽培基質(zhì)（泥潭：珍珠巖： 園土=1 : 1 : 5)中，放置無加溫加光的溫室中，進行遮陰馴化3周，期間不定期的噴施 1/2硏^營養(yǎng)液，移栽后成活率達78%。
[0038] 實施例3腋芽的誘導(dǎo)和培養(yǎng)培養(yǎng)基的選擇
[0039] 將消毒好的莖段接種于6種培養(yǎng)基上，每瓶接種1?2株，培養(yǎng)基組成見表1。每 隔l〇d繼代并統(tǒng)計外植體生長情況。培養(yǎng)條件為溫度25°C，光照強度3000LUX，光照時間 16h。
[0040] 表1腋芽的誘導(dǎo)和培養(yǎng)培養(yǎng)基組成
[0041]
【權(quán)利要求】
1. 細柱五加的離體快速繁殖方法，其特征在于： A外殖體消毒：選取腋芽飽滿且尚未萌發(fā)的嫩枝，摘去葉片，然后將枝條剪為約2cm的 小段，每段帶一對腋芽，采用多方式消毒漂洗后，用無菌水沖洗4?6遍，最后用無菌濾紙吸 干表面水分； B腋芽誘導(dǎo)：將消毒好的細柱五加莖段切成1. 0-1. 5cm的帶芽節(jié)段，接種到以下培養(yǎng)基 中：WPM基本培養(yǎng)基，蔗糖20?40g/L，植物生長激素0. 2?2. Omg/L，適當pH值下進行光 照培養(yǎng)； C腋芽培養(yǎng)：將腋芽萌發(fā)后培養(yǎng)20天左右的無菌苗莖尖用剪刀剪下，接種到以下培養(yǎng) 基中：WPM基本培養(yǎng)基，蔗糖20?40g/L，植物生長激素0. 2?2. Omg/L，適當pH值下進行 光照培養(yǎng)； D叢生芽誘導(dǎo)：將生長至8cm左右的芽苗切下，分成帶有一對腋芽的小段：WPM基本培 養(yǎng)基，植物生長激素0. 5?1. Omg/L，進行光照培養(yǎng)30?40天； E生根培養(yǎng)：選取健壯的試管苗，經(jīng)過修剪后，在含植物生長激素400?500mg/L浸泡 10-15min后接種到如下培養(yǎng)基中：1/2WPM或WPM基本培養(yǎng)基，蔗糖20?40g/L，進行光照 培養(yǎng)50?60天。 F煉苗移栽：將組培瓶蓋打開，并添加一定量蒸餾水進行有菌條件馴化一段時間；用鑷 子將組培苗從瓶中取出，移栽到已經(jīng)滅菌的栽培基質(zhì)中，進行遮陰馴化3周，期間不定期的 噴施1/2WPM營養(yǎng)液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述細柱五加的快速繁殖方法，其特征在于步驟A中的多方式消毒 漂洗為：用〇. 1 %的安利洗滌液在搖床上震蕩洗滌15?20min，流水沖洗30?60min后， 再在超凈工作臺上用75%的酒精漂洗30s，無菌水清洗4遍后，用含0. 1%升汞滅菌50? 60min〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細柱五加的快速繁殖方法，其特征在于步驟B、C、D、E中細柱 五加快速繁殖所述的培養(yǎng)基中涉及的植物生長激素，包括6-卞基腺嘌呤出-BA)、吲哚丁酸 (IBA)、萘乙酸（NAA)、赤霉素（GA 3)、反玉米素（ZT)、3-吲哚乙酸（IAA)、多效唑其中一種或 幾種。
4. 如權(quán)利要求1所述細柱五加的快速繁殖方法，其特征在于步驟B、C、D、Ε中細柱五 加快速繁殖所述的培養(yǎng)條件為：光照周期10?16h/d，光照強度1000?3000Lu X，培養(yǎng)溫度 22 ?26。。。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細柱五加的快速繁殖方法，其特征在于步驟B、C中所涉及到 的pH值范圍為5. 7?7.0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細柱五加的快速繁殖方法，其特征在于步驟F中添加蒸餾水 5?10ml，進行有菌馴化2-3天。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細柱五加的快速繁殖方法，其特征在于步驟B、C中所涉及到 的植物生長激素包括吲哚丁酸（IBA) 1. 0?2. Omg/L，6-卞基腺嘌呤（6-BA) 0. 1?0. 5mg/L， 蔡乙酸（ΝΑΑ)0· 1 ?0· 2mg/L ;
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細柱五加的快速繁殖方法，其特征在于步驟D中所涉及到的 植物生長激素包括反玉米素（ΖΤ)0. 5?1. Omg/L，吲哚丁酸（IBA)O. 1?0. 5mg/L。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細柱五加的快速繁殖方法，其特征在于步驟E中所涉及到的
【文檔編號】A01H4/00GK104082147SQ201410341385
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】鄭生智, 韋敏, 呂曄 申請人:江蘇省中國科學(xué)院植物研究所