一種快速繁殖美國(guó)紅櫨的培養(yǎng)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于植物再生領(lǐng)域，提供一種快速繁殖美國(guó)紅櫨的培養(yǎng)方法，包括步驟：1)無(wú)菌體系的建立和增殖材料的準(zhǔn)備，2)增殖培養(yǎng)：接入植物微擴(kuò)繁器中的培養(yǎng)容器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基的配方為MS+6-BA+NAA，3)生根培養(yǎng)：置換入液體生根培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+IBA0.5-1.0mg·L-1，培養(yǎng)基體積為100-150ml。本發(fā)明采用間歇浸沒(méi)式培養(yǎng)，使培養(yǎng)物不是全程浸沒(méi)在液體培養(yǎng)基中，避免了長(zhǎng)期浸沒(méi)在液體中對(duì)植物生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生的不良作用，提高了種苗的質(zhì)量。間歇浸沒(méi)式培養(yǎng)可以提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，降低美國(guó)紅櫨苗產(chǎn)生的酚類(lèi)物質(zhì)等不利因素和不利氣體的積累，使培養(yǎng)物快速生長(zhǎng)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種快速繁殖美國(guó)紅?盧的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物再生領(lǐng)域，具體涉及一種通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行木本植物再生的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 美國(guó)紅護(hù)（Cotinus coggygria 'Royal Purple'）是一種木本觀賞植物，漆樹(shù)科 (Anacardiaceae)黃護(hù)屬（Cotinus)，落葉灌木或小喬木，其樹(shù)形美觀大方，葉片紫紅色并 保持一年三季常紅，且季季有變化：初春時(shí)，樹(shù)體全部葉片為鮮嫩的酒紅色；春夏之交，葉 色紅而亮麗；至盛夏時(shí)節(jié)，樹(shù)體下部葉片開(kāi)始漸漸轉(zhuǎn)為綠色，而頂梢新生葉始終為紫紅色； 入秋后整體葉色又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹萍t色，秋霜過(guò)后，葉色更加紅艷。每年的夏季美國(guó)紅櫨在 枝條頂端開(kāi)花，花序絮狀鮮紅，如煙霧籠罩，所以又有"煙樹(shù)"之稱(chēng)。與普通黃櫨（Cotinus Coggygria Scop.)相比，美國(guó)紅護(hù)葉片較大，掛樹(shù)時(shí)間較長(zhǎng)，觀景時(shí)間更長(zhǎng)。
[0003] 美國(guó)紅櫨有較強(qiáng)的耐寒和抗旱性，對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)和pH要求不嚴(yán)，在沙土、壤土，pH酸 性、鹽堿性和中性土壤上均能生長(zhǎng)。其根系發(fā)達(dá)，萌蘗性強(qiáng)，且對(duì)病蟲(chóng)害和污染能力有較強(qiáng) 的抗性。由于它具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，優(yōu)于彩葉樹(shù)種紫葉李、紫葉小檗和紅花檣木等，是 一個(gè)極具觀賞價(jià)值的樹(shù)種。近幾年，隨著造林，森林旅游和園林綠化的發(fā)展，對(duì)美國(guó)紅櫨苗 木的需求量越來(lái)越大。
[0004] 美國(guó)紅櫨種子萌發(fā)困難，且彩葉性狀易分化變異，不能確保能保留其優(yōu)異的觀賞 性；扦插較難生根，嫁接的成活率較低等，諸方面因素限制了該種苗的生產(chǎn)和供應(yīng)。通過(guò) 植物組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖美國(guó)紅櫨，既能加快這一優(yōu)良樹(shù)種的繁殖速度，又能保持其優(yōu)良性 狀。美國(guó)紅櫨的體外繁殖目前僅采用傳統(tǒng)固體組織培養(yǎng)技術(shù)，已有的技術(shù)有，申請(qǐng)?zhí)枮?03106827. 8的"紅櫨高頻率試管植株再生與工廠化育苗方法"和申請(qǐng)?zhí)枮?00410053515. 4 的"紅櫨的組培快繁方法"。但傳統(tǒng)固體培養(yǎng)法費(fèi)時(shí)費(fèi)工，生產(chǎn)成本高，不能適應(yīng)工廠化生 產(chǎn)的需求。在植物離體培養(yǎng)過(guò)程中，外植體褐化是影響擴(kuò)繁結(jié)果的重要因素。褐化現(xiàn)象主 要是由于PP〇(P〇lyphenol oxidase，多酚氧化酶）作用于天然底物酚類(lèi)物質(zhì)，其被氧化產(chǎn) 生醌類(lèi)物質(zhì)，這類(lèi)物質(zhì)聚合后呈棕褐或黑褐色，積累在培養(yǎng)物底部或擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，毒害 培養(yǎng)的外植體材料，導(dǎo)致材料褐化，生長(zhǎng)停頓，直至死亡（姚洪軍等，1999)。許多木本植物 組織中含有較多的酚類(lèi)化合物，褐化現(xiàn)象較為嚴(yán)重。通常漆樹(shù)科黃櫨屬植物含酚類(lèi)物質(zhì)多。 本研究中的試驗(yàn)材料C. coggygria也是如此，在培養(yǎng)物的切口處通常產(chǎn)生大量酚類(lèi)物質(zhì)， 其氧化后形成褐色醌類(lèi)物質(zhì)并逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基中或包裹在愈傷或分化了的組織的表面。 這些褐色物質(zhì)一般會(huì)抑制酶的活性，影響細(xì)胞代謝而阻礙新生組織的生長(zhǎng)和分化。采用固 體培養(yǎng)，C. coggygria的離體培養(yǎng)物分泌的褐色物質(zhì)易在切口處積累，并包裹在愈傷或分化 了的組織的表面，延遲了不定芽的生成，特別是阻礙了基部切口處根的發(fā)生，延長(zhǎng)了擴(kuò)繁周 期。
[0005] 利用自動(dòng)化、機(jī)械化方法進(jìn)行植物體外再生來(lái)提高效率和降低生產(chǎn)成本已成為當(dāng) 前的研究熱點(diǎn)。采用液體培養(yǎng)易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制，但培養(yǎng)物長(zhǎng)期浸潤(rùn)在液體中易出現(xiàn)超 度含水（hyperhydricity，又被稱(chēng)為玻璃化）現(xiàn)象，使用受限。間歇浸沒(méi)式液體培養(yǎng)不僅能 為培養(yǎng)的植物器官或幼小植物提供一個(gè)良好的生長(zhǎng)環(huán)境，還能減少培養(yǎng)時(shí)的人力投入，提 高種苗生產(chǎn)過(guò)程中的自動(dòng)化程度。已有的技術(shù)有申請(qǐng)?zhí)枮?01110111047. 1的"半夏屬植物 的組培快繁方法"、申請(qǐng)?zhí)枮?00910114406. 1的"利用間歇浸沒(méi)式生物反應(yīng)器進(jìn)行甘蔗組 織培養(yǎng)快繁"及我們發(fā)明團(tuán)隊(duì)申請(qǐng)?zhí)枮?01310175520. 1的"一種草莓微擴(kuò)繁的液體培養(yǎng)方 法"。上述專(zhuān)利所公開(kāi)的技術(shù)內(nèi)容并未涉及美國(guó)紅櫨的間歇浸沒(méi)式微擴(kuò)繁技術(shù)。利用間歇 浸沒(méi)式組織培養(yǎng)技術(shù)建立高效的美國(guó)紅櫨體外再生體系，為實(shí)現(xiàn)該樹(shù)種種苗工廠化生產(chǎn)奠 定基礎(chǔ)，有利于該樹(shù)種在中國(guó)園林及生態(tài)環(huán)境建設(shè)中的應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 針對(duì)本領(lǐng)域存在的不足之處，本發(fā)明提出了一種美國(guó)紅櫨微擴(kuò)繁的液體培養(yǎng)方 法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案為：
[0008] -種快速繁殖美國(guó)紅櫨的培養(yǎng)方法，包括步驟：
[0009] 1)無(wú)菌體系的建立和增殖材料的準(zhǔn)備
[0010] 采集美國(guó)紅櫨當(dāng)年生帶節(jié)的幼嫩莖段，清洗后切割成2. 0-3. 0cm長(zhǎng)，帶1-2個(gè) 節(jié)的莖段；滅菌處理后接種在添加了 2. 0g· Γ1聚乙烯吡咯烷酮PVP的MS基本培養(yǎng)基 (Murashige and Skoog，1962)上；經(jīng)過(guò)10d左右的培養(yǎng)觀察，把無(wú)菌且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的莖 段轉(zhuǎn)接入MS+6-BA0. lmg · P+NAAO. 4mg · Γ1培養(yǎng)基中，進(jìn)行腋芽的誘導(dǎo)，待腋芽萌發(fā)生長(zhǎng) 至1. 5-2. 2cm，將其剪下接入增殖培養(yǎng)基MS+6-BA0. 8mg · P+NAAO. 4mg · Γ1中誘導(dǎo)產(chǎn)生不 定芽，以備后續(xù)間歇浸沒(méi)式培養(yǎng)使用；
[0011] 2)增殖培養(yǎng)
[0012] 以步驟1)中得到的美國(guó)紅櫨不定芽為材料（長(zhǎng)度彡2.0cm，保留2-3片葉 片），接入植物微擴(kuò)繁器中的培養(yǎng)容器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。使用的液體培養(yǎng)基的配方為： MS+6-BA(0. 6-0. 8)mg .I^+NAAO)· 2-0. 4)mg 增殖培養(yǎng)階段的浸沒(méi)頻率為 8-12 次/24h、 浸沒(méi)時(shí)間為5-10min/次；
[0013] 3)生根培養(yǎng)
[0014] 增殖培養(yǎng)結(jié)束后，將液體增殖培養(yǎng)基排出，置換入液體生根培養(yǎng)基。使用的生根培 養(yǎng)基配方為：1/2MS+IBA(0. 5-1. 0)mg ·ΙΛ生根階段浸沒(méi)頻率為6-10次/24h、5-10min/次；
[0015] 步驟1)中的清洗是用洗滌劑水刷洗外植體表面附著的污物，在自來(lái)水下沖洗 30-60min〇
[0016] 其中，所述步驟1)中的滅菌處理，用70-80%酒精浸泡20-408，再用0.1%!^(：1 2 滅菌5_8min，無(wú)菌水漂洗3-5次。
[0017] 優(yōu)選地，所述步驟1)中的MS基本培養(yǎng)基、MS+6-BA0. lmg · P+NAAO. 4mg · Γ1培養(yǎng) 基、增殖培養(yǎng)基MS+6-BA0. 8mg · P+NAAO. 4mg · L-1中均加有1中培養(yǎng)基均含有30g · L-1蔗 糖和5. 5g · Γ1瓊脂。pH
[0018] 優(yōu)選地，所述步驟2)中，按照培養(yǎng)容器的容積每1.2L，接種不定芽10-15株。注入 液體培養(yǎng)基體積為100_150ml。
[0019] 優(yōu)選地，所述步驟2)中，增殖培養(yǎng)周期為28-30d。
[0020] 優(yōu)選地，所述步驟3)中，按照培養(yǎng)容器的容積每1. 2L加入培養(yǎng)基100_150ml ;生 根階段的周期為18-20d。
[0021] 其中，所述步驟2)和步驟3)中的液體培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中均含有20-30g · Γ1 蔗糖。所述步驟2)和步驟3)使用的培養(yǎng)基不含瓊脂，pH為6. 0。
[0022] 其中，培養(yǎng)過(guò)程中，控制溫度為（25±1)°C，光照強(qiáng)度為35_50μπι〇1 ·πΓ2 ·-，光照 時(shí)間為16h · (Γ1，濕度為60%。
[0023] 培養(yǎng)過(guò)程中固、液的培養(yǎng)基pH都為6. 0。配制培養(yǎng)基時(shí)，激素加完后測(cè)量其pH值， 如果較低，可用lmol · LlaOH溶液調(diào)節(jié)。
[0024] 進(jìn)一步地，本發(fā)明可采用間歇浸潤(rùn)式植物微擴(kuò)繁器（專(zhuān)利名稱(chēng)為"一種可自動(dòng)換 液的間歇浸潤(rùn)式植物微擴(kuò)繁器"，專(zhuān)利號(hào)：201220470675.9)進(jìn)行材料的微擴(kuò)繁實(shí)驗(yàn)。該植 物微擴(kuò)繁器主要由若干組并聯(lián)連接的植物生長(zhǎng)器單元、電控制的液泵、真空泵及多個(gè)電磁 閥組成。每一組所述植物生長(zhǎng)器單元均包括一植物培養(yǎng)瓶、一液體瓶、一截止閥、兩個(gè)濾菌 器及若干三通管。利用液泵和真空泵實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液對(duì)植物材料的間歇浸沒(méi)及培養(yǎng)液的自動(dòng)更 換。
[0025] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0026] 1.本發(fā)明采用的間歇浸沒(méi)式培養(yǎng)方式，使培養(yǎng)物不是全程浸沒(méi)在液體培養(yǎng)基中， 其在間斷液體浸沒(méi)時(shí)可與氣體接觸，避免了長(zhǎng)期浸沒(méi)在液體中對(duì)植物生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生的不 良作用；其次，間歇浸沒(méi)式培養(yǎng)可以提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，降低不利氣體在培養(yǎng)環(huán)境 中的積累；同時(shí)由于液體培養(yǎng)基的流動(dòng)性和更換簡(jiǎn)易，也降低了美國(guó)紅櫨產(chǎn)生的酚類(lèi)物質(zhì) 等不利因素在培養(yǎng)苗基部的褐化和積累，從而能使其快速生長(zhǎng)，既增加了微擴(kuò)繁產(chǎn)量，又提 高了種苗的質(zhì)量；且光合和呼吸代謝增強(qiáng)，提高了擴(kuò)繁苗的適應(yīng)性，可縮短甚至省去煉苗的 時(shí)間。
[0027] 2.液體培養(yǎng)基的使用，使培養(yǎng)物更有效的吸收養(yǎng)分和激素。相比固體培養(yǎng)，不僅節(jié) 約了耗材（比如少加蔗糖），而且只需添加低濃度的激素水平就能達(dá)到很好的植株再生效 果。適宜的低濃度激素配比既能使苗大量擴(kuò)繁，又能維持苗的優(yōu)良性狀，更適于美國(guó)紅櫨組 培擴(kuò)繁的實(shí)際大規(guī)模生產(chǎn)。
[0028] 3.從實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備到把苗接入培養(yǎng)瓶比傳統(tǒng)組培方式節(jié)省了 5-6個(gè)小時(shí)，而且只需一 次接種，之后就只需定時(shí)更換培養(yǎng)液即可，不再需要轉(zhuǎn)接工作，從而節(jié)省了大量勞動(dòng)力，降 低了生產(chǎn)成本。
[0029] 本發(fā)明利用自制的間歇浸沒(méi)式裝置進(jìn)行美國(guó)紅櫨無(wú)菌苗的微擴(kuò)繁培養(yǎng)，此培養(yǎng)體 系自動(dòng)化程度高，能夠?qū)崿F(xiàn)液體培養(yǎng)基的自動(dòng)注入和排出，無(wú)需人工操作；另外培養(yǎng)單元 兩端都分別有一個(gè)〇. 2 μ m的過(guò)濾器，減少了污染率，且由于各培養(yǎng)單元采用的是并聯(lián)的方 式，使培養(yǎng)時(shí)的染菌現(xiàn)象終止簡(jiǎn)易，防止交叉污染。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1為間歇浸沒(méi)式培養(yǎng)產(chǎn)生的美國(guó)紅櫨增殖芽，基部不積累褐色物質(zhì)。
[0031] 圖2為間歇浸沒(méi)式培養(yǎng)產(chǎn)生的美國(guó)紅櫨生根苗，基部不積累褐色物質(zhì)。
[0032] 圖3為實(shí)施例3間歇浸沒(méi)式培養(yǎng)中美國(guó)紅櫨芽照片。
[0033] 圖4為對(duì)比例中固體增殖培養(yǎng)的美國(guó)紅櫨增殖芽（容器測(cè)視角度的照片），基部產(chǎn) 生褐化物質(zhì)。
[0034] 圖5為對(duì)比例中固體生根培養(yǎng)的美國(guó)紅櫨苗（容器仰視角度的照片），基部產(chǎn)生褐 化物質(zhì)。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0036] 實(shí)施例中使用的美國(guó)紅櫨，為北京林業(yè)大學(xué)苗圃?xún)?nèi)種植（在北京林業(yè)大學(xué)苗圃?xún)?nèi) 生長(zhǎng)十年的植株）。
[0037] 實(shí)施例中采用的培養(yǎng)裝置為本實(shí)驗(yàn)室自制的可自動(dòng)換液的間歇浸潤(rùn)式植 物微擴(kuò)繁器（專(zhuān)利名稱(chēng)為"一種可自動(dòng)換液的間歇浸潤(rùn)式植物微擴(kuò)繁器"，專(zhuān)利號(hào)： 201220470675.9)進(jìn)行材料的微擴(kuò)繁實(shí)驗(yàn)。該植物微擴(kuò)繁器主要由若干組并聯(lián)連接的植物 生長(zhǎng)器單元、電控制的液泵、真空泵及多個(gè)電磁閥組成。每一組所述植物生長(zhǎng)器單元均包括 一植物培養(yǎng)瓶（紅護(hù)苗接種在植物培養(yǎng)瓶中，該瓶體積1. 2L)、一液體瓶、一截止閥、兩個(gè)濾 菌器及若干三通管。該擴(kuò)繁器的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)出量、浸潤(rùn)時(shí)間和間歇時(shí)間由自動(dòng)控制系統(tǒng)進(jìn)行 控制，利用液泵和真空泵實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液對(duì)植物材料的間歇浸沒(méi)及培養(yǎng)液的自動(dòng)更換。植物培 養(yǎng)瓶、液體瓶和真空泵的氣體進(jìn)口導(dǎo)管上設(shè)置有濾膜孔徑〇. 2 μ m的濾菌器。
[0038] 增殖倍數(shù)和生根率的計(jì)算：
[0039] 增殖倍數(shù)=增殖的不定芽數(shù)/接種的芽數(shù) （1)
[0040] 生根率=(生根的株數(shù)/接種的總株數(shù)）X 100% (2)
[0041] 實(shí)施例1
[0042] 1)無(wú)菌體系的建立和增殖材料的準(zhǔn)備
[0043] 采集美國(guó)紅櫨當(dāng)年生帶節(jié)的幼嫩莖段，用洗滌劑水刷洗外植體表面附著的污物， 在自來(lái)水下沖洗30min。切割成2. 0-3. 0cm長(zhǎng)，帶1-2個(gè)節(jié)的莖段；在超凈工作臺(tái)上用75% 酒精浸泡30s，再用0. 1% HgCl2滅菌6min，無(wú)菌水漂洗4次。接種在添加了 聚乙 稀批略燒麗 PVP 的 MS 基本培養(yǎng)基（Murashige and Skoog, 1962)+30g · L 1 鹿糖 +5. 5g · L 1 瓊脂（pH為6. 0)上；經(jīng)過(guò)lOd左右的培養(yǎng)觀察，把無(wú)菌且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的莖段轉(zhuǎn)接入MS+6 -ΒΑ0. lmg .Ι^+ΝΑΛΟ· 4mg ·Ι^+3(^噸―1蔗糖+5. 5g噸―1瓊脂的培養(yǎng)基（pH為6. 0)中，進(jìn)行腋 芽的誘導(dǎo)，待腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)至2. 0cm，將其剪下接入組成為MS+6-BA0. 8mg ?Ι^+ΝΑΛΟ. 4mg噸一1 +30g 蔗糖+5. 5g 瓊脂的增殖培養(yǎng)基（pH為6. 0)中誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，以備后續(xù)間歇 浸沒(méi)式培養(yǎng)使用；
[0044] 2)增殖培養(yǎng)
[0045] 以步驟1)中得到的美國(guó)紅櫨不定芽為材料（長(zhǎng)度彡2. 0cm，保留2-3片葉片），接 入植物微擴(kuò)繁器中的培養(yǎng)容器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。使用的液體培養(yǎng)基的配方為：MS+6-BA0. 8mg *L_ kNAAO. 4mg ?L-hOg噸―1蔗糖，pH為6. 0。增殖培養(yǎng)階段的浸沒(méi)頻率為12次/24h、浸沒(méi)時(shí)間 為5min/次，培養(yǎng)容器的容積1. 2L，接種不定芽10株。注入液體培養(yǎng)基體積為100-150ml。
[0046] 增殖培養(yǎng)28d后，增殖倍數(shù)達(dá)到7,85 %的增殖芽高度> 2. 0cm，增殖階段基本完 成，可進(jìn)行下一步的生根培養(yǎng)。
[0047] 增殖培養(yǎng)階段，美國(guó)紅櫨芽基部產(chǎn)生的褐色物質(zhì)隨著液體培養(yǎng)基的流動(dòng)而不積累 在芽基部（圖1，間歇浸沒(méi)式培養(yǎng)的美國(guó)紅櫨芽，基部不積累褐色物質(zhì)）。
[0048] 3)生根培養(yǎng)
[0049] 增殖培養(yǎng)結(jié)束后，將液體增殖培養(yǎng)基排出，置換入液體生根培養(yǎng)基。使用的生根培 養(yǎng)基配方為：1/2MS+IBAL Omg · L-WOg · L-1蔗糖，pH為6. 0,培養(yǎng)基體積為150ml。生根階 段，浸沒(méi)頻率為8次/24h、lOmin/次，培養(yǎng)容器的容積1. 2L加入培養(yǎng)基100-150ml。
[0050] 以上培養(yǎng)過(guò)程中，控制溫度為（25±1) °C，光照強(qiáng)度為40 μ mol ·πΓ2 光照時(shí)間 為16h · cf1，濕度為60%。
[0051] 生根培養(yǎng)18d后，生根率達(dá)95%，生根率高于固體培養(yǎng)20%。
[0052] 生根培養(yǎng)階段，因上部芽基部沒(méi)有褐色物質(zhì)的積累，芽一般不需要進(jìn)行處理。而對(duì) 比固體培養(yǎng)中，增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的芽基部形成大量褐色物質(zhì)，若不剪掉直接接入生根培養(yǎng)基， 則美國(guó)紅櫨芽不生根。
[0053] 整個(gè)擴(kuò)繁周期所用時(shí)間為46d，所用時(shí)間比固體培養(yǎng)至少節(jié)省14d。
[0054] 實(shí)施例2
[0055] 1)無(wú)菌體系的建立和增殖材料的準(zhǔn)備
[0056] 采集美國(guó)紅櫨當(dāng)年生帶節(jié)的幼嫩莖段，用洗滌劑水刷洗外植體表面附著的污物， 在自來(lái)水下沖洗40min。切割成2. 0-3. Ocm長(zhǎng)，帶1-2個(gè)節(jié)的莖段；在超凈工作臺(tái)上用75% 酒精浸泡30s，再用0. 1% HgCl2滅菌6min，無(wú)菌水漂洗4次。接種在添加了 聚乙 稀批略燒麗 PVP 的 MS 基本培養(yǎng)基（Murashige and Skoog, 1962)+30g · L 1 鹿糖 +5. 5g · L 1 瓊脂（pH為6. 0)上；經(jīng)過(guò)lOd的培養(yǎng)觀察，把無(wú)菌且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的莖段轉(zhuǎn)接入MS+6-BA0 ? lmg .I^+NAAO· 4mg .L-WOg .L-1蔗糖+5. 5g .L-1瓊脂的培養(yǎng)基（pH為6. 0)中，進(jìn)行腋芽的 誘導(dǎo)，待腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)至2. 0cm，將其剪下接入組成為MS+6-BA0. 8mg ?P+NAAO. 4mg ·Ι^+3(^ ?Γ1蔗糖+5. 5g噸4瓊脂的增殖培養(yǎng)基（pH為6. 0)中誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，以備后續(xù)間歇浸沒(méi) 式培養(yǎng)使用；
[0057] 2)增殖培養(yǎng)
[0058] 以步驟1)中得到的美國(guó)紅櫨不定芽為材料（長(zhǎng)度彡2. 0cm，保留2-3片葉片），接 入植物微擴(kuò)繁器中的培養(yǎng)容器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。使用的液體培養(yǎng)基的配方為：MS+6-BA0.6mg*L h+NAAO. 2mg ?rkOg 蔗糖，pH為6. 0。增殖培養(yǎng)階段的浸沒(méi)頻率為8次/24h、浸沒(méi)時(shí)間 為7min/次，培養(yǎng)容器的容積1. 2L，接種不定芽15株。注入液體培養(yǎng)基體積為150ml。
[0059] 增殖培養(yǎng)40d后，統(tǒng)計(jì)得增殖倍數(shù)為5,增殖芽平均高度為4. 7cm，大于相同條件固 體培養(yǎng)中增殖倍數(shù)（4)，遠(yuǎn)大于相同條件固體培養(yǎng)中的增殖芽高度（2. 7cm)。
[0060] 3)生根培養(yǎng)
[0061] 增殖培養(yǎng)結(jié)束后，將液體增殖培養(yǎng)基排出，置換入液體生根培養(yǎng)基。使用的生根培 養(yǎng)基配方為：1/2MS+IBA0. 5mg · L-kOg · L-1蔗糖，pH為6. 0,培養(yǎng)基體積為150ml。生根階 段，浸沒(méi)頻率為6次/24h、lOmin/次，培養(yǎng)容器的容積1. 2L加入培養(yǎng)基150ml。
[0062] 以上培養(yǎng)過(guò)程中，控制溫度為（25± 1) °C，光照強(qiáng)度為40 μ mol ·πΓ2 · s'光照時(shí)間 為16h · cf1，濕度為60%。
[0063] 生根培養(yǎng)21d后，統(tǒng)計(jì)得生根率達(dá)90%，平均根數(shù)（3)與固體培養(yǎng)的結(jié)果相似，平 均根長(zhǎng)為4. 5cm，大于相同條件固體培養(yǎng)中的根長(zhǎng)（3. 3cm)。
[0064] 生根培養(yǎng)階段，根直接從莖段底部發(fā)出，基部不積累褐色物質(zhì)（圖2,間歇浸沒(méi)式 培養(yǎng)產(chǎn)生的美國(guó)紅櫨生根苗）。
[0065] 實(shí)施例3
[0066] 1)無(wú)菌體系的建立和增殖材料的準(zhǔn)備
[0067] 采集美國(guó)紅櫨當(dāng)年生帶節(jié)的幼嫩莖段，用洗滌劑水刷洗外植體表面附著的污物， 在自來(lái)水下沖洗30min。切割成2. 0-3. 0cm長(zhǎng)，帶1-2個(gè)節(jié)的莖段；在超凈工作臺(tái)上用75% 酒精浸泡30s，再用0. 1% HgCl2滅菌6min，無(wú)菌水漂洗4次。接種在添加了 聚乙 稀批略燒麗 PVP 的 MS 基本培養(yǎng)基（Murashige and Skoog, 1962)+30g · L 1 鹿糖 +5. 5g · L 1 瓊脂（pH為6. 0)上；經(jīng)過(guò)lOd左右的培養(yǎng)觀察，把無(wú)菌且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的莖段轉(zhuǎn)接入MS+6 -ΒΑ0. lmg .Ι^+ΝΑΛΟ· 4mg ·Ι^+3(^噸―1蔗糖+5. 5g噸―1瓊脂的培養(yǎng)基（pH為6. 0)中，進(jìn)行腋 芽的誘導(dǎo)，待腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)至2. 0cm，將其剪下接入組成為MS+6-BA0. 8mg ?Ι^+ΝΑΛΟ. 4mg噸一1 +30g 蔗糖+5. 5g 瓊脂的增殖培養(yǎng)基（pH為6. 0)中誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，以備后續(xù)間歇 浸沒(méi)式培養(yǎng)使用；
[0068] 2)增殖培養(yǎng)
[0069] 以步驟1)中得到的美國(guó)紅櫨不定芽為材料（長(zhǎng)度彡2. 0cm，保留2-3片葉片），接 入植物微擴(kuò)繁器中的培養(yǎng)容器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。使用的液體培養(yǎng)基的配方為：MS+6-BA0. 8mg *L_ kNAAO. 4mg ?L-kOg噸―1蔗糖，pH為6. 0。增殖培養(yǎng)階段的浸沒(méi)頻率為24次/24h、浸沒(méi)時(shí)間 為15min/次，培養(yǎng)容器的容積1. 2L，接種不定芽15株。注入液體培養(yǎng)基體積為150ml。增 殖培養(yǎng)周期28d。
[0070] 增殖培養(yǎng)階段，由于浸沒(méi)頻率和浸沒(méi)時(shí)間過(guò)高，導(dǎo)致美國(guó)紅櫨芽出現(xiàn)嚴(yán)重的褐化 和超度含水現(xiàn)象（圖3)，降低了增殖倍數(shù)3)，且增殖芽質(zhì)量較低。
[0071] (3)生根培養(yǎng)
[0072] 增殖培養(yǎng)結(jié)束后，將液體增殖培養(yǎng)基排出，置換入液體生根培養(yǎng)基。使用的生根培 養(yǎng)基配方為：1/2MS+IBA0. 5mg · L-kOg · L-1蔗糖，pH為6. 0,培養(yǎng)基體積為150ml。生根階 段，浸沒(méi)頻率為24次/24h、15min/次，培養(yǎng)容器的容積1. 2L加入培養(yǎng)基100-150ml。由于 增殖階段芽褐化現(xiàn)象和超度含水現(xiàn)象的發(fā)生，導(dǎo)致不定芽質(zhì)量較低，影響了其生根率（生 根率為49% )。
[0073] 以上培養(yǎng)過(guò)程中，控制溫度為（25±1) °C，光照強(qiáng)度為40μπι〇1 ·πΓ2 ^1，光照時(shí)間 為16h · cf1，濕度為60%。
[0074] 對(duì)比例固體培養(yǎng)
[0075] 步驟1)同實(shí)施例1。
[0076] 2)增殖培養(yǎng)
[0077] 以步驟1)中得到的美國(guó)紅櫨不定芽為材料（長(zhǎng)度彡2. 0cm，保留2-3片葉片），接 入玻璃瓶中（容積為150ml)進(jìn)行培養(yǎng)。使用的固體培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA0. emg^P+NAA 0· 2mg · L-WOg · L-1蔗糖+5. 5g · L-1的瓊脂，pH為6· 0。增殖培養(yǎng)周期40d。
[0078] 增殖培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基中的芽基部切口處積累褐色物質(zhì)。
[0079] 3)生根培養(yǎng)
[0080] 增殖培養(yǎng)結(jié)束后，將不定芽（長(zhǎng)度> 2. 0cm)切下轉(zhuǎn)入固體生根培養(yǎng)基，固體生根 培養(yǎng)基配方為 1/2MS+IBA0. 5mg · I^+SOg · L-1 蔗糖 +5. 5g · L-1 瓊脂。
[0081] 其他培養(yǎng)條件同實(shí)施例1。
[0082] 增殖倍數(shù)為4。生根率為67%。基部褐色物質(zhì)積累率為95%。增殖培養(yǎng)中褐色 物質(zhì)的積累影響增殖芽的質(zhì)量和后續(xù)的生根培養(yǎng)；生根培養(yǎng)中褐色物質(zhì)的積累阻礙根的發(fā) 生，是導(dǎo)致生根率低下的重要原因（圖4和圖5)。
[0083] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明和【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作出一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種快速繁殖美國(guó)紅櫨的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括步驟： 1) 無(wú)菌體系的建立和增殖材料的準(zhǔn)備 采集美國(guó)紅櫨當(dāng)年生帶節(jié)的幼嫩莖段，清洗后切割成2. 0-3. Ocm長(zhǎng)，帶1-2個(gè)節(jié)的莖 段；滅菌處理后接種在添加了 2. 0g 聚乙烯吡咯烷酮PVP的MS基本培養(yǎng)基上；經(jīng)過(guò)10d 左右的培養(yǎng)觀察，把無(wú)菌且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的莖段轉(zhuǎn)接入MS+6-BA0. lmg · P+NAAO. 4mg · Γ1 培養(yǎng)基中，進(jìn)行腋芽的誘導(dǎo)，待腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)至1. 5-2. 2cm，將其剪下接入增殖培養(yǎng)基 MS+6-BA0. 8mg · P+NAAO. 4mg · L-1中誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，以備后續(xù)間歇浸沒(méi)式培養(yǎng)使用； 2) 增殖培養(yǎng) 以步驟1)中得到的美國(guó)紅櫨不定芽為材料，接入植物微擴(kuò)繁器中的培養(yǎng)容器內(nèi)進(jìn)行 培養(yǎng)；使用的液體培養(yǎng)基的配方為：MS+6-BA(0. 6-0. 8)mg · I^+NAAO). 2-0. 4)mg · Γ1，增殖 培養(yǎng)階段的浸沒(méi)頻率為8-12次/24h、浸沒(méi)時(shí)間為5-10min/次； 3) 生根培養(yǎng) 增殖培養(yǎng)結(jié)束后，將液體增殖培養(yǎng)基排出，置換入液體生根培養(yǎng)基；使用的生根培養(yǎng)基 配方為：1/2MS+IBA(0. 5-1. 0)mg · L-1，生根階段浸沒(méi)頻率為 6-10 次/24h、5-10min/ 次。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟1)中的滅菌處理，用 70-80%酒精浸泡20-40s，再用0. 1% HgCl2滅菌5-8min，無(wú)菌水漂洗3-5次。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟1)中的MS基本培養(yǎng)基、 MS+6-BA0. lmg · L i+NAAO. 4mg · L 1 培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基 MS+6-BA0. 8mg · L i+NAAO. 4mg · L 1 中均加有30g · Γ1蔗糖和5. 5g · Γ1瓊脂。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟2)中，按照培養(yǎng)容器的容積 每1. 2L，接種不定芽10-15株，注入液體培養(yǎng)基體積為100-150ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟2)中，增殖培養(yǎng)周期為 28-30d。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟3)中，按照培養(yǎng)容器的容積 每1. 2L加入培養(yǎng)基100-150ml。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟3)中，生根階段的周期為 18-20d。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟2)和步驟3)中的液體培養(yǎng) 基和生根培養(yǎng)基中均含有20-30g · Γ1蔗糖。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，培養(yǎng)過(guò)程中，控制溫度為 (25± 1) °C，光照強(qiáng)度為35-50 μ mol · m_2 · s-1，光照時(shí)間為16h · (Γ1，濕度為60%。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104115748SQ201410317592
【公開(kāi)日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月4日
【發(fā)明者】鄭彩霞, 石琨, 于鎮(zhèn)榕 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)