氫溴酸檳榔堿抗雌鼠生育的方法
【專利摘要】以氫溴酸檳榔堿為活性成分的抗雌鼠生育滅鼠劑，屬于生物防治【技術(shù)領(lǐng)域】。作為一種生物自然災(zāi)害，長久以來鼠害問題對人類社會的發(fā)展造成了嚴重的危害，給農(nóng)業(yè)、林業(yè)及畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失的同時，也嚴重危害著人類的健康。長久以來，人們采用各種方法進行害鼠的種群控制，包括傳統(tǒng)的物理器械法、生態(tài)防治法及化學(xué)毒餌法?？股夹g(shù)是近些年發(fā)展起來的一項新的害鼠控制技術(shù)，該技術(shù)相較于傳統(tǒng)的鼠害控制方法，具有作用時間長、控制效果明顯、環(huán)境毒副作用小等優(yōu)點，因此在害鼠種群數(shù)量控制方面有著巨大的應(yīng)用潛力。本發(fā)明涉及一種以氫溴酸檳榔堿為活性成分的雌性不育滅鼠劑用于控制鼠類的繁殖。本發(fā)明若能應(yīng)用于農(nóng)林牧業(yè)生產(chǎn)，將能有效控制害鼠種群數(shù)量，具有廣闊的經(jīng)濟效益。
【專利說明】氫溴酸檳榔堿抗雌鼠生育的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于鼠害控制的抗生育滅鼠劑，具體涉及一種以氫溴酸檳榔堿為活性成分的雌性不育劑用于控制鼠類繁殖。
【背景技術(shù)】
[0002]作為一種自然生物災(zāi)害，長久以來鼠害問題對人類社會的發(fā)展造成了嚴重的危害，給人類造成巨大的經(jīng)濟損失的同時，也嚴重危害著人類的健康。老鼠屬于嚙齒類動物，種類繁多、數(shù)量巨大、適應(yīng)性強、分布廣闊。據(jù)估計，全球目前共有鼠類2800余種，數(shù)量達到了數(shù)百億只；數(shù)據(jù)顯示，我國共有嚙齒類動物13科187種，常見的害鼠種類則約有40多種，主要種類為褐家鼠、黃毛鼠、小家鼠、中華鼢鼠、草原鼢鼠、大倉鼠、黑線姬鼠、藏倉鼠、印度地鼠等。
[0003]害鼠主要以種子、果實、草類及根莖類為食，給農(nóng)業(yè)、林業(yè)及畜牧業(yè)造成了嚴重的危害，也造成了巨大的經(jīng)濟損失。同時，害鼠還威脅著人類的健康，據(jù)統(tǒng)計，在我國與鼠類有關(guān)的人的疾病，就涉及到79種鼠。
[0004]檳榔為棕櫚科植物檳榔的干燥成熟種子，約含0.3% -0.6%的生物堿。檳榔是全世界繼煙草，酒精，咖啡后第四種能讓人成癮的物質(zhì)，廣泛地被東南亞人民咀嚼包括中國的湖南省和海南省。咀嚼檳榔不但能產(chǎn)生一種舒服感和溫暖感，還有加強人的記憶，減少孕婦懷孕時嘔吐,抗抑郁,抗艾滋病和抗 炎癥等作用。此外,檳榔還證明能改善腦內(nèi)血流量,抗動脈硬化，防止心血管疾病，改善肩周炎，腰痛病和老年性癡呆癥，促進胃腸消化吸收，抑制幽門螺旋桿菌等保健效果。但是另一方面，許多流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，咀嚼檳榔是導(dǎo)致口腔癌、咽喉癌的主要原因，同時咀嚼檳榔還會產(chǎn)生基因毒性、肝毒性和生殖毒性，引起基因突變和致畸等毒副作用。醫(yī)學(xué)專家以為咀嚼檳榔是導(dǎo)致東南亞人們口腔癌常發(fā)的主要原因，因為常嚼食檳榔會造成口腔黏膜下纖維化。據(jù)報道，全球每年發(fā)生39萬例口腔癌癥，其中發(fā)生在南亞和東南亞地區(qū)的就有22.8萬例，占58%。而調(diào)查發(fā)現(xiàn)在這些口腔癌高發(fā)的地區(qū)居民大都有咀嚼檳榔或檳榔子的習(xí)俗。馮云枝等研究發(fā)現(xiàn)檳榔提取物能通過上調(diào)細胞間粘附分子，刺激成纖維細胞增殖而導(dǎo)致口腔黏膜下纖維化。同時發(fā)現(xiàn)檳榔提取物能夠促進體外培養(yǎng)的人類口腔粘膜上皮角朊細胞分泌內(nèi)皮素水平上調(diào)而誘導(dǎo)口腔黏膜下纖維化。Sinha等研究發(fā)現(xiàn)，在懷孕小鼠妊娠的6-15天給予檳榔水提物，會導(dǎo)致胚胎骨骼發(fā)育不成熟，吸收胎和死胎增多。Yang等研究發(fā)現(xiàn)，如果婦女在懷孕期間常咀嚼檳榔會引起出生孩體重減少，男女嬰比例鑒定，嚴重時會導(dǎo)致流產(chǎn)和畸形等不良后果。胡怡秀等，研究發(fā)現(xiàn)用檳榔提取液處理雄性小鼠后，會引起小鼠精子數(shù)量，活力明顯減少，精子畸形率提高并降低雌鼠的受孕率。同時研究發(fā)現(xiàn)檳榔提取液對雄性精子指標的影響呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。Wu等用100mg/kg的檳榔提取物分別連續(xù)處理雄性大鼠，15天，30天和50天后，發(fā)現(xiàn)檳榔提取物表現(xiàn)出明顯的生殖毒性作用。檳榔提取物能導(dǎo)致精子數(shù)量減少30-57%，精子運動能力降低27-61%，畸形精子數(shù)顯著增加。機理研究表明檳榔提取物主要是通過產(chǎn)生活性氧，提高機體丙二醛和降低唾液酸方式，引起睪丸組織氧分壓升高而產(chǎn)生生殖毒性。[0005]檳榔堿是檳榔提取物中的主要成分之一，被認為是引起檳榔毒副作用的主要原因。目前，檳榔堿除從檳郎中提取外，也可人工合成，氫溴酸檳榔堿為人工合成的檳榔堿的氫溴酸鹽。趙成瑩等研究表明小鼠過量攝取檳榔堿會導(dǎo)致腸胃肺臟等組織出血，肝臟和脾臟組織變色體積增大，最終因呼吸麻痹死亡，同時發(fā)現(xiàn)氫溴酸檳榔堿對小白鼠的急性LD5tl為174.71 mg/kg。Moutasim等研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿能通過毒蕈堿型乙酰膽堿受體來調(diào)節(jié)ανβ6整合素的表達而促使口腔黏膜下纖維化引起口腔癌。Anupam等在研究檳榔堿遺傳毒性時發(fā)現(xiàn)，通過口腔給藥的方式處理小鼠會引起小鼠癌變幾率升高，使細胞停滯在Ml期，提高姐妹染色單體交換頻率升高，并發(fā)現(xiàn)檳榔堿對細胞周期變化和染色體畸變的影響呈現(xiàn)出時間依賴關(guān)系。Dasgupta等研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿處理小鼠后會抑制小鼠脾淋巴細胞的細胞循環(huán)而導(dǎo)致細胞凋亡，同時研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿能通過上調(diào)血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶和抑制肝組織中過過氧化物歧化酶，過氧化氫酶，谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶等抗氧化劑，產(chǎn)生肝毒性作用。Chang等通過不同濃度檳榔堿體外對轉(zhuǎn)基因斑馬魚的胚胎影響發(fā)現(xiàn)，檳榔堿能顯著降低胚胎的存活率，并延緩胚胎發(fā)育。機理研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿處理能明顯改變胚胎p53，p21和cyclin Dl等蛋白的表達量和空間構(gòu)象，同時增加細胞內(nèi)硫醇的損耗。Liu等也同樣發(fā)現(xiàn)檳榔堿能在體外抑制小鼠胚胎滋養(yǎng)層的自然增長，雌性小鼠在懷孕后的第5，6，7連續(xù)灌服不同劑量的檳榔堿時，會明顯減少懷孕鼠子宮中的胚胎著床數(shù)量，并表現(xiàn)出劑量的依賴性，但對其抗生育機制不清楚。Huang等研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿具有腫瘤抑制作用，能通過降低腫瘤細胞白細胞介素-6和增加腫瘤抑制因子p53的水平來阻止基底細胞癌發(fā)生作用。除此之外，檳榔堿被報道具有DNA損傷和神經(jīng)毒性等作用。
[0006]本發(fā)明全部使用人工合成的氫溴酸檳榔堿進行實驗研究，通過給懷孕小鼠腹腔注射不同劑量的氫溴酸檳榔堿，發(fā)現(xiàn)氫溴酸檳榔堿處理能減少懷孕小鼠子宮中著床胚胎的數(shù)量，并呈現(xiàn)出劑量依賴性，為氫溴酸檳榔堿開發(fā)成新型植物源抗生育劑而奠定理論基礎(chǔ)。進一步通過灌胃給藥的實例 操作，建立起氫溴酸檳榔堿抗雌鼠生育的抗生育方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種雌性不育滅鼠劑氫溴酸檳榔堿，通過阻斷鼠類繁殖途徑達到滅殺和控制鼠類的雌性不育滅鼠劑。
[0008]本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)。
[0009]本發(fā)明提供一種雌性不育滅鼠劑，其特征是采用不育劑氫溴酸檳榔堿作為活性成分用于對鼠類的殺滅。
[0010]1、實驗方法
1.1動物實驗和組織準備
小鼠試養(yǎng)一周后，每兩只雌性小鼠與一只雄性小鼠合籠后過夜，第二天早上檢查是否有陰道栓，有陰栓者即定為懷孕后的第一天(D1)。按照以下步驟進行動物實驗，首先是將懷孕后的小鼠分為四個小組，分別為對照組，5 mg/kg/day氫溴酸檳榔堿處理組，10mg/kg/day氫溴酸檳榔堿處理組，和20mg/kg/day氫溴酸檳榔堿處理組，每組各12只。從懷孕的第一天到脫頸處死的這一天，藥物處理組分別通過腹腔注射的方式給予5，10和20 mg/kg體重劑量的氫溴酸檳榔堿，氫溴酸檳榔堿溶于生理鹽水中。每天的劑量同樣分成兩半，分別于早上9點和下午6點以腹腔注射的方法給藥。對照組按同樣的方式腹腔注射等體積的生理鹽水。到了第5天早上，所有的實驗動物，脫頸處死后，將子宮解剖出來，并統(tǒng)計各子宮中的胚胎著床數(shù)和稱量子宮重量。其次是將18只20 mg/kg/day氫溴酸檳榔堿處理的懷孕小鼠和18只對照懷孕小鼠分別于懷孕后的第4，5，6天處死。解剖的子宮，一半固定在4%的多聚甲醒中用來做H&E染色觀察和免疫組化分析,一半保存在-80°C中用來做western blotting分析。
[0011]1.2子宮組織形態(tài)觀察和免疫組化分析。
[0012]1.2.1樣品處理
將解剖出的子宮組織于4%多聚甲醛中固定約3-5 h后；將固定好的組織依次放入60%，70%,80 %，95 %和100 %酒精中各lh，進行梯度脫水；二甲苯處理10 min后，石蠟浸潰約2h，進行包埋；將包好的蠟塊冰敷后進行切片每片約3-5 μ m。
[0013]1.2.2掃描電鏡觀察
將第5天的懷孕小鼠子宮在室溫下用2.5%戊二醛固定1 h，0.1 M PBS沖洗3次，每次15 min，置于1%四氧化鋨中室溫放置I h。接著樣品分別于50 %、7 0%、8 0%、90 %、95 %乙醇脫水，每次15 mi η。最后放入乙酸異戍酯中15 min,臨界點干燥,真空鍍膜。處理好的標本用掃描電鏡(JSM-5900LV，JE0L)觀察。
[0014]1.2.3 HE 染色
將妊娠第一天(Dl)的36只小鼠隨機分為6組，每組6只，3組作為對照組，另外3組為600 mg/kg/day的氫溴酸檳榔堿灌胃處理的實驗組，連續(xù)灌胃至第四天(D4)時，處死一組對照組與一組實驗組小鼠，取出子宮切成適當(dāng)長度的片段后置于4%的多聚甲醛固定液中保存；同法，第五天(D5)與第六天(D6)各處死一組對照組與實驗組小鼠，子宮于4%的多聚甲醛固定液中保存?zhèn)溆谩?br> [0015]HE染色操作步驟如下:
(1)將處理組樣品包埋于石蠟之中，切片(厚度4μπι至10 μ m)常規(guī)脫蠟至水；
(2)將切片用蘇木精染色5min后，用水沖洗干凈；
(3)運用乙醇進行分色處理數(shù)秒鐘，之后用水沖洗2min ；
(4)伊紅染色Imin，之后用95%的乙醇分色處理；
(5)運用無水乙醇處理兩次,每次約20min ；
(6)運用二甲苯處理兩次,每次約10min ；
(7)運用中性樹膠封片、烤干；
(8)使用Image-ProPlus 6.0軟件進行結(jié)果分析。
[0016]1.2.4 IHC 步驟
(O切片脫蠟和水化:首先將切片置于二甲苯I和二甲苯II各20 min進行脫蠟，隨后依次用100 %、95%、80%、70%的酒精進行水化，最后用PBS (PH7.4)沖洗3個5分鐘；
(2)抗原熱修復(fù):將切片放于0.01M (PH 6.0)的枸櫞酸鹽緩沖液中，微波爐加熱至960C -100°C,10 min后取出取出后自然冷卻至室溫，分別用蒸餾水和PBS沖洗3次，每次5min ；
(3)去氧化酶:將抗原修復(fù)后的切片置入含有3%雙氧水盒中室溫孵育10min，PBS洗3次，每次3 min ；
(4)封閉和一抗孵育:擦去玻片上多余水分，滴加5%封閉用山羊血清后，37°C孵育10min ,甩去多余血清,加入相應(yīng)稀釋一抗；
(5)二抗孵育:PBS漂洗3次(每次5min)，加入相應(yīng)二抗，37°C孵育30min，PBS漂洗3次(每次3 min)，加入相應(yīng)三抗，37°C孵育30 min, PBS漂洗3次。DA B顯色，顯示棕黃色，自來水終止反應(yīng)；
(6)復(fù)染:蘇木精復(fù)染3min后，自來水沖洗干凈，飽和碳酸鋰藍30 s,自來水沖洗干凈，鹽酸酒精分色Is左右，自來水沖洗干凈；
(7)脫水封片:60%，70%,80%,90 %, 100 %乙醇各3 min，二甲苯5 min，每個處理重復(fù)3次，中性樹膠封片。每組取5張切片，隨機選擇5個不同視野，棕黃色顯現(xiàn)為陽性。
[0017]1.2.5 Western blot 實驗
蛋白質(zhì)樣品的制備:
收集懷孕D4、D5、D6的實驗小鼠材料，按照以下步驟制取蛋白質(zhì)樣品:
(1)取990μ L的蛋白裂解液，置于1.5 mL的離心管中，之后再加入10 μ L的PMSF，充分混勻；
(2)取出凍存的小鼠子宮樣品，液氮快速研磨至粉狀，取50-100mg的蛋白樣品置于裂解液中，冰上裂解1.5h。期間每隔20 min搖勻樣品一次；
(3)4°〇下14000 rpm離心5-8 min，取出上清液，80 °C保存，備用。
[0018]蛋白質(zhì)濃度的測定:
所得樣品蛋白質(zhì)濃度的測定參照TIANGEN公司的BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA ProteinAssay Kit)法進行濃度測定。
[0019]SDS-PAGE 凝膠電泳:
根據(jù)所需條帶蛋白的相對分子量選擇合適的分離膠濃度，本實驗所用分離膠濃度為10%和12%兩種，操作步驟如下:
(1)加樣:每個EP管中加入4μ L I X SDS-PAGE Loading Buffer，根據(jù)所測蛋白濃度，每個樣品以50 μ g的蛋白含量計算出加樣體積，加入到EP管中，混勻；
(2)變性處理:100°C水浴5min，使蛋白樣品完全變性，冷卻后備用；
(3)上樣:每個EP管中的蛋白樣品全部加入膠孔中，Maker為碧云天彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標準，上樣量為8 μ L ;
(4)電泳:電泳槽中加入適量的IX SDS-PAGE凝膠電泳緩沖液，上樣完成后，按照濃縮膠80 V，分離膠120 V進行凝膠電泳。
[0020]轉(zhuǎn)膜:
(1)切膠:將電泳完成的膠從膠板上剝離，以Marker為參照將膠切成合適的大小，置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中備用；
(2)備膜:將硝酸纖維素膜裁剪成合適的大小(比膠略大)，將裁剪好的硝酸纖維素膜用甲醇處理30 S，之后轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜緩沖液中。同時也將轉(zhuǎn)膜用的濾紙置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中備用；
(3)裝膜:在轉(zhuǎn)移槽中，按照濾紙一硝酸纖維素膜一膠一濾紙的順序依次疊放好，注意在疊放的過程中不要留 有氣泡；
(4)轉(zhuǎn)膜:裝膜完成后，將轉(zhuǎn)移槽裝入轉(zhuǎn)膜儀中，按照設(shè)定的程序轉(zhuǎn)膜30分鐘。
[0021]免疫反應(yīng):(1)將轉(zhuǎn)膜完成后的膜從轉(zhuǎn)膜儀中取出，標記好正反面，用TBST漂洗；
(2)封閉:將膜置于加有5%脫脂奶粉的封閉液中，4°C封閉過夜；
(3)—抗孵化:將膜從封閉液中取出，按照實驗所需裁剪成合適大小的條帶，用TBST將膜加以清洗，之后將膜放入裝有一抗的離心管(50 mL)中，搖床上低速孵化。根據(jù)一抗的類型，選擇常溫孵化2 h或是4°C冰箱過夜；
(4)將一抗回收，將膜用TBST清洗3遍，每遍清洗8min ；
(5)二抗孵化:清洗完成后，將膜放入裝有二抗的離心管中，室溫孵育I min ；
(6)將膜在TBST離心管中漂洗3次，每次8min。
[0022]化學(xué)發(fā)光、顯影:
(1)將膜放在保鮮膜上，置于顯影儀器中；
(2)按照實驗所需取適量超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物A、B兩種試劑，混合后用移液槍加入到膜上面，使其充分附著；
(3)使用ImageLab軟件進行顯影，根據(jù)不同條帶信號的強弱選擇合適的曝光時間，每一時間段內(nèi)曝光100張 照片；
(4)凝膠圖象分析:用ImageLab 3.0軟件對得到的圖片進行分析。
[0023]1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
數(shù)據(jù)用平均值土標準誤表示，兩組間比較采用t檢驗分析，*P〈0.05為顯著差異，**P〈0.01為極顯著差異，每個實驗至少重復(fù)3次。
[0024]2 結(jié)果。
[0025]2.1氫溴酸檳榔堿對懷孕小鼠胚胎數(shù)量和子宮重量的影響
統(tǒng)計結(jié)果表明氫溴酸檳榔堿處理組中懷孕小鼠的胚胎數(shù)量隨著氫溴酸檳榔堿劑量的增加逐步減少。當(dāng)懷孕小鼠注射劑量為20 mg/kg/day氫溴酸檳榔堿時，胚胎數(shù)量與對照組相比明顯減少0°〈0.01)，胚胎數(shù)量僅為對照組胚胎數(shù)量的59 %見圖1A，C和D。子宮重量也隨著氫溴酸檳榔堿劑量的增加逐步減少，當(dāng)劑量為20 mg/kg/day氫溴酸檳榔堿時，處理后的子宮重量約為對照組的77 %，具有顯著性差異(/X0.01)，見圖1B。
[0026]2.2氫溴酸檳榔堿對子宮組織形態(tài)的影響
HE染色觀察發(fā)現(xiàn)在懷孕第5天時，20 mg/kg/day氫溴酸檳榔堿處理的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞快速生長，且子宮內(nèi)腔張開并產(chǎn)生分支，而對照組小鼠子宮內(nèi)膜細胞生長正常，內(nèi)腔關(guān)閉無分支(圖2A1和A2)。同時發(fā)現(xiàn)第6天時20 mg/kg/day氫溴酸檳榔堿處理的小鼠子宮無脫膜分化的現(xiàn)象無著床胚胎，而此時對照組小鼠子宮正常脫膜分化并出現(xiàn)著床成功的胚胎，脫膜分化是正常小鼠懷孕后第六天必須經(jīng)歷的一個過程有助于胚胎著床(圖2B1和B2)。
[0027]2.3 IHC分析氫溴酸檳榔堿對懷孕小鼠子宮組織ERa和PR蛋白的影響
免疫組化觀察發(fā)現(xiàn)ER a和PR蛋白都能在子宮腺體、基質(zhì)細胞和上皮細胞表達，棕黃色為目的蛋白(見圖3A)。統(tǒng)計分析結(jié)果顯現(xiàn)氫溴酸檳榔堿處理同樣能顯著提高ER a和PR蛋白在子宮組織的表達量(P〈0.05，見圖3B)。
[0028]2.4 Western blotting分析氫溴酸檳榔堿對懷孕小鼠子宮組織ER a、PR、E-cadherin、β -catenin 和 MMP2 蛋白的影響
Western blotting結(jié)果統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)氫溴酸檳榔堿處理后子宮組織中ERa和PR蛋白表達量明顯上調(diào)(圖4);發(fā)現(xiàn)氫溴酸檳榔堿處理能顯著上調(diào)E-cadherin和β-catenin并下調(diào)MMP2在子宮組織中的表達(圖5 )。
[0029]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點。
[0030]1、本發(fā)明中雌性不育劑氫溴酸檳榔堿對雌鼠生育能力的控制極其顯著。實驗證明，對交配受孕成功后的雌性小鼠，以20 mg/kg/day的氫溴酸檳榔堿處理懷孕小鼠時,胚胎的數(shù)量和子宮重量分別是空白對照組的59 %和77 %，表明低劑量的氫溴酸檳榔堿即可對雌鼠的生育產(chǎn)生顯著影響。
[0031]2、本發(fā)明中雌性不育劑氫溴酸檳榔堿對鼠類的子宮有一定的損傷作用。氫溴酸檳榔堿抗生育機理研究表明，20 mg/kg/day的氫溴酸檳榔堿能通過改變懷孕小鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)和子宮內(nèi)膜容受性而導(dǎo)致胚胎著床數(shù)量減少，產(chǎn)生抗生育作用。具體表現(xiàn)為氫溴酸檳榔堿能使小鼠懷孕后第5天子宮內(nèi)腔打開和泡軟突嚴重受損，第6天子宮內(nèi)膜脫膜分化失敗而改變子宮內(nèi)膜的正常形態(tài)。
[0032]3、本發(fā)明中雌性不育劑氫溴酸檳榔堿對鼠類子宮內(nèi)胚胎著床的關(guān)鍵受體ERa，PR, E-cadherin, β -catenin和MMP-2表達水平產(chǎn)生影響。免疫組化實驗表明，ERa和PR蛋白都能在子宮基質(zhì)細胞、腺體細胞和上皮細胞中表達。平均光密度分析發(fā)現(xiàn)與對照組相比氫溴酸檳榔堿能明顯提高(P〈0.05)；ffestern blotting結(jié)果統(tǒng)計分析也發(fā)現(xiàn)氫溴酸檳榔堿處理后子宮組織中ERa和PR蛋白表達量明顯上調(diào)。Western blotting實驗結(jié)果還表明，氫溴酸檳榔堿處理能顯著上調(diào)E-cadherin和β-catenin并下調(diào)MMP2在子宮組織中的表達(P〈0.05)。這一結(jié)果表明氫溴酸檳榔堿能對雌鼠胚胎著床期間的關(guān)鍵受體產(chǎn)生影響，從而損害子宮內(nèi)膜的容受狀態(tài)導(dǎo)致胚胎著床失敗。這就意味著氫溴酸檳榔堿能夠通過影響胚胎的著床從而導(dǎo) 致雌鼠不育，控制鼠類的繁殖從而達到對鼠類種群的控制。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1不同劑量氫溴酸檳榔堿對懷孕小鼠胚胎數(shù)量和體重的影響。A.胚胎數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果(n=12) ；B.子宮重量統(tǒng)計結(jié)果(n=12)，*P〈0.05，#P〈0.01，與對照組相比；C.對照子宮圖片；D.氫溴酸檳榔堿處理子宮圖片。一:著床胚胎。
[0034]圖2氫溴酸檳榔堿對小鼠子宮形態(tài)的影響。#:關(guān)閉的子宮內(nèi)腔，&:張開的子宮內(nèi)腔，Ge:腺體，S:基質(zhì)細胞，Le:子宮內(nèi)膜上皮細胞，Em:胚胎，D5:懷孕后第5天，D6:懷孕后第6天。放大倍數(shù)為100X。
[0035]圖3氫溴酸檳榔堿對子宮ERa和PR蛋白表達的影響。A:氫溴酸檳榔堿對子宮ERa和PR蛋白表達的免疫組化圖；B:氫溴酸檳榔堿對子宮ER a和PR相對蛋白表達強度分析(IHC)。Ge:腺體，S:基質(zhì)細胞，Le:子宮內(nèi)膜上皮細胞，Em:胚胎。D4:懷孕后第4天，D5:懷孕后第5天，D6:懷孕后第6天，棕黃色代表目的蛋白，*P〈0.05，林P〈0.01，與對照組相比(n=5 )。放大倍數(shù)為200 X。
[0036]圖4 Western blotting 檢測 ER a 和 PR 蛋白的相對表達。(A) Western blotting檢測ER a和PR圖。(B) ERa和PR蛋白相對表達水平，*P〈0.05，#P〈0.01，與相應(yīng)對照組比較。
[0037]圖5 Western blotting 檢測 E-cadherin, β-catenin 和 MMP2 蛋白的相對表達。(A) Western blotting 檢測 E-cadherin, β-catenin 和 MMP2 圖。(B) E-cadherin,β -catenin和MMP2蛋白相對表達水平，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，與相應(yīng)對照組比較。
【具體實施方式】
[0038]下文將通過實施實例對本發(fā)明做進一步說明，但實施實例不以任何方式限制本發(fā)明。
[0039]實例1:
選用純度為98 %的氫溴酸檳榔堿為不育劑藥物，以受孕第一天的ICR雌性小鼠為研究對象，以100 mg/kg/day的劑量連續(xù)灌胃給藥5天，發(fā)現(xiàn)胚胎著床平均數(shù)量與對照組相比無明顯差異，表明100 mg/kg/day劑量的氫溴酸檳榔堿對雌鼠胚胎著床情況無較大影響。
[0040]實例2:
選用純度為98 %的氫溴酸檳榔堿為不育劑藥物，以受孕第一天的ICR雌性小鼠為研究對象，以200 mg/kg/day的劑量連續(xù)灌胃給藥5天,發(fā)現(xiàn)胚胎著床平均數(shù)量與對照組相比減少超過40 %,表明200 mg/kg/day劑量的氫溴酸檳榔堿可對雌鼠胚胎著床數(shù)量產(chǎn)生一定影響。
[0041]實例3:
選用純度為98%的氫溴酸檳榔堿為不育劑藥物，以受孕第一天的ICR雌性小鼠為研究對象，以300 mg/kg/day的劑量連續(xù)灌胃給藥5天,發(fā)現(xiàn)胚胎著床平均數(shù)量與對照組相比減少達到70 %，實例表明為300 mg/kg/day劑量的氫溴酸檳榔堿不育率可達到70%，表明氫溴酸檳榔堿具有較好的抗生育效果。
[0042]實例4:選用純度為98%的氫溴酸檳榔堿為不育劑藥物，以受孕第一天的ICR雌性小鼠為研究對象，以500 mg/kg/day的劑量連續(xù)灌胃給藥5天，發(fā)現(xiàn)受孕小鼠致死率達到100 %，表明氫溴酸檳榔堿除了具有較好的抗生育作用，對雌鼠還有一定的毒殺作用。
【權(quán)利要求】
1.一種抗生育滅鼠劑，其特征在于，所述抗生育滅鼠劑是以氫溴酸檳榔堿作為活性組分的抗生育劑。
2.權(quán)利要求1所述的抗生育滅鼠劑，其特征在于，所述鼠類為雌鼠類動物。
3.權(quán)利要求1或2中所述的抗生育滅鼠劑，其特征在于，所述氫溴酸檳榔堿為人工合成的檳榔堿的氫溴酸鹽。
4.一種滅鼠方法，其特征在于，通過使用權(quán)利要求1-3任一項所述的抗生育滅鼠劑，控制雌鼠的生育及其種群的數(shù)量。
5.權(quán)利要求4所述的方法，包括在鼠類繁殖開始或繁殖期內(nèi)，每鼠每天按照100mg/kg-500 mg/kg體重進行 口服/灌胃給藥的方法，連續(xù)給藥5-7天，即可控制雌性鼠類生育及其數(shù)量。
【文檔編號】A01P11/00GK103918654SQ201410144382
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】楊志榮, 周建宏, 張 杰, 瞿成權(quán), 趙建, 孫群, 馮甦, 侯若彤 申請人:四川大學(xué)