甜櫻桃品種晚紅珠的離體再生方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甜櫻桃品種晚紅珠的離體再生方法，步驟為：1、外植體滅菌，取晚紅珠品種甜櫻桃樹在生長季的嫩梢作為外植體；利用大蒜水溶液滅菌；2、初代培養(yǎng)，在初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件22～25℃，光照2500～3000LX，光周期12h/d；3、繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)至莖段增殖系數(shù)達(dá)5～8；4、生根培養(yǎng)，培養(yǎng)至生根條數(shù)為11～15條；5、馴化和移栽：移栽在適宜壤土中栽培。本發(fā)明建立的甜櫻桃優(yōu)質(zhì)品種晚紅珠離體再生體系穩(wěn)定性好；組織培養(yǎng)繁殖系數(shù)較大，繁殖速度快；滅菌率高；滅菌成本低且環(huán)境友好。
【專利說明】甜櫻桃品種晚紅珠的離體再生方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及櫻桃的栽培技術(shù)，更具體地說，涉及甜櫻桃的離體再生方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甜櫻桃組織培養(yǎng)技術(shù)逐漸得到甜櫻桃栽培領(lǐng)域?qū)＜覍W(xué)者以及廣大甜櫻桃栽植者的廣泛重視和關(guān)注。甜櫻桃組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展現(xiàn)狀有以下方面:
[0003]1.可用于甜櫻桃苗木的快速繁殖。采用組織培養(yǎng)技術(shù)繁育甜櫻桃苗木，年繁育苗木數(shù)可以用公式表示為:Y = mX xn。其中，Y為年繁殖數(shù)，m為無菌母株數(shù)，x為每個(gè)培養(yǎng)周期增殖的倍數(shù)，η為全年可增殖的周期次數(shù)。由此可以看出，苗木繁殖速度是以幾何級(jí)數(shù)增殖的，因此采用組織培養(yǎng)技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)甜櫻桃苗木快速繁殖。
[0004]2.在甜櫻桃離體再生體系建立的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步進(jìn)行甜櫻桃苗木脫毒，生產(chǎn)無病毒甜櫻桃苗木。離體培養(yǎng)技術(shù)是關(guān)鍵，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合熱處理即可培育出脫病毒的甜櫻桃植株。
[0005]3.用于遺傳育種，培育遠(yuǎn)緣雜種。將甜櫻桃組織培養(yǎng)技術(shù)與常規(guī)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)相結(jié)合，對遠(yuǎn)緣雜交形成的幼胚進(jìn)行離體組織培養(yǎng)，使之在離體的條件下形成完整的試管植株，就可能培育出優(yōu)良的甜櫻桃遠(yuǎn)緣雜交新品種。
[0006]4.縮短育種時(shí)間。通過組織培養(yǎng)技術(shù)，對甜櫻桃的花粉、花藥、未受精的子房以及胚珠進(jìn)行培養(yǎng)，得到單倍體植株以后，再采用染色體人工加倍的方法使其恢復(fù)成為二倍體植株，從而培育成為新的甜櫻桃品種。這種方法大大縮短了育種周期，簡化了育種程序，提高了育種效率
[0007]5.種質(zhì)資源保存。采用組織培養(yǎng)技術(shù)保存試管苗可以大大地節(jié)省空間，一個(gè)
0.28m3的普通電冰箱可存放2000只試管，試管中放入甜櫻桃種質(zhì)資源，多個(gè)普通冰箱的聯(lián)合使用，在低溫條件下就可實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源的長期保存。
[0008]6.組織培養(yǎng)技術(shù)是甜櫻桃基因工程的平臺(tái)。轉(zhuǎn)基因獲得的甜櫻桃外植體，必須在組織培養(yǎng)技術(shù)才能再生為甜櫻桃完整的植株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明以現(xiàn)代植物組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)，建立一個(gè)具有體系穩(wěn)定、繁殖速度快、成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)的甜櫻桃優(yōu)良品種晚紅珠離體再生體系，為優(yōu)良品種晚紅珠乃至甜櫻桃的快速繁殖、苗木脫毒、培育遠(yuǎn)緣雜種、縮短育種時(shí)間、培育體細(xì)胞雜種、種質(zhì)資源保存、基因工程以及病理學(xué)、生理學(xué)及其它理論研究奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明以休眠季的葉芽和生長季的嫩梢為外植體，成功地建立起甜櫻桃優(yōu)良品種晚紅珠離體再生技術(shù)體系。
[0010]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明一種甜櫻桃品種晚紅珠的離體再生方法，包括如下步驟:
[0011]S1、外植體滅菌:取晚紅珠品種甜櫻桃樹在生長季的嫩梢作為外植體；所述嫩梢為2~3cm長頂端嫩梢，直接放入大蒜水溶液浸泡，取出后用無菌單蒸水沖洗3次，最后用無菌濾紙吸干水分；
[0012]S2、初代培養(yǎng):將所述外植體接種到初代培養(yǎng)基上；所述初代培養(yǎng)基為:MS+6_芐基腺嘌呤0.2~0.5mg/L+ Π引哚丁酸0.01~0.05mg/L+瓊脂5~7g/L+鹿糖20~30g/L,ρΗ5.6~5.8 ;培養(yǎng)室條件是22~25°C，光照強(qiáng)度2500~3000LX，光周期12h/d ；
[0013]S3、繼代培養(yǎng):所述外植體經(jīng)初代培養(yǎng)后，剪成單芽莖段接種到繼代培養(yǎng)基上；所述繼代培養(yǎng)基為:MS+6-芐基腺嘌呤0.5~1.0mg/L+吲哚丁酸0.05~0.2mg/L,附加瓊脂5~7g/L，蔗糖20~30g/L ;培養(yǎng)至莖段增殖系數(shù)可達(dá)5~8 ;
[0014]S4、生根培養(yǎng):在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基為:MS+6_芐基腺嘌呤
0.05~0.2mg/L+吲哚丁酸0.1~0.5mg/L,附加瓊脂5~7g/L，蔗糖20~30g/L ;培養(yǎng)至生根條數(shù)為11~15條；
[0015]S5、馴化和移栽:移栽在適宜基質(zhì)土壤中栽培。
[0016]優(yōu)選方式下，步驟S5所述基質(zhì)土壤為珍珠巖或沙土或蛭石或腐殖土。此外，步驟SI中所述大蒜水溶液的制配方法為:去皮大蒜搗成漿加無菌單蒸水?dāng)嚢?min，其中，按重量/體積比大蒜:無菌單蒸水為1:1，然后室溫下放置30min，備用。步驟S2中所述初代培養(yǎng)基為:MS+6-芐基腺嘌呤0.3mg/L+IBA0.04mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，pH5.8 ;培養(yǎng)室條件是23°C，光照強(qiáng)度2500LX，光周期12h/d ;步驟S3中所述繼代培養(yǎng)基為:MS+6_芐基腺嘌呤1.0mg/L+吲哚丁酸0.lmg/L,附加瓊脂7g/L，蔗糖30g/L，莖段增殖系數(shù)為8 ;步驟S4中所述生根培養(yǎng)基為:MS+6-芐基腺嘌呤0.lmg/L+吲哚丁酸0.5mg/L,附加瓊脂7g/L,蔗糖30g/L，生根條數(shù)為15條。 [0017]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn):
[0018]1.所用甜櫻桃品種晚紅珠為大連市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院培育的優(yōu)質(zhì)甜櫻桃新品種，資源新穎，也可選用其他品種的晚紅珠。
[0019]2.本發(fā)明建立的甜櫻桃優(yōu)質(zhì)品種晚紅珠離體再生體系穩(wěn)定性好；
[0020]3.組織培養(yǎng)繁殖系數(shù)較大；
[0021]4.本發(fā)明采用大蒜水溶液作為外植體滅菌劑，滅菌率可達(dá)到100% ；
[0022]5.與傳統(tǒng)的外植體滅菌方法相比無毒副作用，屬于環(huán)境友好型滅菌劑；
[0023]6.葉芽滅菌時(shí)不用剝除鱗片，而將其直接放入到大蒜水溶液中，故操作更簡便、節(jié)省時(shí)間。
[0024]本發(fā)明建立的甜櫻桃優(yōu)質(zhì)品種晚紅珠離體再生體系穩(wěn)定性好；組織培養(yǎng)繁殖系數(shù)較大，繁殖速度快；滅菌率高；滅菌成本低且環(huán)境友好。
[0025]此外，嫩梢作為外植體，由于抗外界環(huán)境干擾的能力較差，因此，現(xiàn)有技術(shù)的滅菌溶液對其傷害較大，因此限制了嫩梢作為外植體使用的可能。為此，本發(fā)明利用大蒜配置的水溶液作為滅菌溶液，具體以去皮大蒜搗成泥，與無菌單蒸水按重量體積比配置成1:1的溶液。該滅菌溶液溫和，適用于植物嫩梢作為外植體的滅菌，不傷害外植體。此處，所述嫩梢為植物生長季自植物莖頂偏下2~3cm(優(yōu)選)長的一段新梢或枝條。
【具體實(shí)施方式】
[0026]本發(fā)明以甜櫻桃優(yōu)質(zhì)品種晚紅珠為對象，基于植物細(xì)胞全能性的基本原理，在適宜的培養(yǎng)條件下，再生成完整植株。具體工藝流程:[0027]1、外植體的滅菌:取休眠季的葉芽和生長季的嫩梢作為外植體,使用大蒜水溶液進(jìn)行滅菌處理。
[0028]2、初代培養(yǎng):將滅菌后的外植體進(jìn)行初代培養(yǎng)，并進(jìn)行培養(yǎng)基的篩選，確定最佳初
代培養(yǎng)基。
[0029]3、繼代培養(yǎng):在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，并進(jìn)行培養(yǎng)基的篩選，確定最佳繼代培養(yǎng)基。
[0030]4、生根培養(yǎng):在繼代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行生根培養(yǎng)，并進(jìn)行培養(yǎng)基的篩選，確定最佳生根培養(yǎng)基。
[0031]5、馴化與移栽:篩選適宜的馴化移栽基質(zhì)及條件。
[0032]實(shí)施例1
[0033]1、外植體滅菌:一種外植體是休眠季的葉芽。具體做法:冬末時(shí)，取甜櫻桃品種晚紅珠一年生葉芽枝，在室內(nèi)自來水沖洗lh，洗去表面浮塵。取葉芽枝剪成具有一個(gè)葉芽的莖段，然后在無菌操作條件下進(jìn)行外植體滅菌，將具有一個(gè)葉芽的莖段放在500mL的燒杯內(nèi)。用2:l(ff/V)大蒜水溶液(大蒜:無菌單蒸水為2:1，去皮大蒜搗成漿加無菌單蒸水?dāng)嚢?分鐘，然后室溫下放置30min后，備用)浸泡30min，取出后用無菌單蒸水沖洗3次，用解剖刀切下葉芽放在無菌濾紙上吸干水分，然后接種到初代培養(yǎng)基上。
[0034]另一種外植體是生長季的嫩梢。具體做法:取2~3cm長頂端嫩梢，直接放入到1:1 (W/ν)大蒜水溶液(大蒜:無菌單蒸水為1:1，去皮大蒜搗成漿加無菌單蒸水?dāng)嚢?min，然后室溫下放置30min后,備用)浸泡30min,取出后用無菌單蒸水沖洗3次,最后用無菌濾紙吸干水分。
[0035]外植體的無菌率均為100%。
[0036]2.初代培養(yǎng):
[0037]將上述滅菌后的外植體接種到初代培養(yǎng)基上。初代培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基為:
[0038]MS+6-芐基腺嘌呤 0.2 ~0.5mg/L+ 吲哚丁酸 0.01 ~0.05mg/L+ 瓊脂 5 ~7g/L+鹿糖 20 ~30g/L, pH5.6 ~5.8。
[0039]初代培養(yǎng)的結(jié)果分兩種情況，一種是外植體是休眠季的葉芽時(shí)，初代培養(yǎng)的萌芽率可達(dá)85~95%。另一種是外植體是生長季的嫩梢時(shí),生長率可達(dá)90~98%。
[0040]培養(yǎng)室條件是22~25°C，光照強(qiáng)度2500~3000LX，光周期12h/d。
[0041]3.繼代培養(yǎng):
[0042]外植體經(jīng)初代培養(yǎng)，剪成單芽莖段接種到繼代培養(yǎng)基上。適宜的繼代培養(yǎng)基為:MS+6-芐基腺嘌呤0.5~1.0mg/L+吲哚丁酸0.05~0.2mg/L,附加瓊脂5~7g/L，蔗糖20~30g/L，莖段增殖系數(shù)可達(dá)5~8。
[0043]4.生根培養(yǎng):
[0044]適宜的培養(yǎng)基為:MS+6-芐基腺嘌呤0.05~0.2mg/L+吲哚丁酸0.1~0.5mg/L,附加瓊脂5~7g/L，蔗糖20~30g/L。生根率可達(dá)到90~100%，生根條數(shù)為11~15條。
[0045]5.馴化和移栽:在馴化過程中，珍珠巖或沙土或蛭石或腐殖土上的存活率均達(dá)到100% ;移栽在中性壤土中，成活率達(dá)90%~95%。
[0046]實(shí)施例2
[0047]1.外植體滅菌:一種外植體是休眠季的葉芽。具體做法:冬末時(shí)，取甜櫻桃品種晚紅珠一年生葉芽枝，在室內(nèi)自來水沖洗lh，洗去表面浮塵。取葉芽枝剪成具有一個(gè)葉芽的莖段，然后在無菌操作條件下進(jìn)行外植體滅菌，將具有一個(gè)葉芽的莖段放在500mL的燒杯內(nèi)。用2:l(ff/V)大蒜水溶液(大蒜:無菌單蒸水為2:1，去皮大蒜搗成漿加無菌單蒸水?dāng)嚢?分鐘，然后室溫下放置30min后，備用)浸泡30min，取出后用無菌單蒸水沖洗3次，用解剖刀切下葉芽放在無菌濾紙上吸干水分，然后接種到初代培養(yǎng)基上。
[0048]另一種外植體是生長季的嫩梢。具體做法:取2~3cm長頂端嫩梢，直接放入到1:1 (W/ν)大蒜水溶液(大蒜:無菌單蒸水為1:1，去皮大蒜搗成漿加無菌單蒸水?dāng)嚢?min，然后室溫下放置30min后,備用)浸泡30min,取出后用無菌單蒸水沖洗3次,最后用無菌濾紙吸干水分。
[0049]外植體的無菌率均為100%。
[0050]2.初代培養(yǎng):
[0051 ] 初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:MS+6-芐基腺嘌呤0.3mg/L+IBA0.04mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L, pH5.8。
[0052]初代培養(yǎng)的結(jié)果分兩種情況，一種是外植體為休眠季的葉芽時(shí)，初代培養(yǎng)的萌芽率可達(dá)95 %。另一種是外植體為生長季的嫩梢時(shí),生長率可達(dá)98 %。
[0053]培養(yǎng)室條件是23°C，光照強(qiáng)度2500LX，光周期12h/d。 [0054]3.繼代培養(yǎng):外植體經(jīng)初代培養(yǎng)，剪成單芽莖段接種到繼代培養(yǎng)基上。
[0055]繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:MS+6-芐基腺嘌呤1.0mg/L+吲哚丁酸0.lmg/L,附加瓊脂7g/L，蔗糖30g/L，莖段增殖系數(shù)為8。
[0056]4.生根培養(yǎng):
[0057]生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:MS+6_芐基腺嘌呤0.lmg/L+吲哚丁酸0.5mg/L,附加瓊脂7g/L，蔗糖30g/L，生根率達(dá)到100%，生根條數(shù)為15條。
[0058]5.馴化和移栽:在馴化過程中，珍珠巖上的存活率達(dá)到100%。移栽在中性壤土上，成活率93%。
[0059]實(shí)施例3
[0060]1.外植體處理和初代培養(yǎng):一種外植體是休眠季的葉芽。具體做法:冬末時(shí)，取甜櫻桃品種晚紅珠一年生葉芽枝，在室內(nèi)自來水沖洗lh，洗去表面浮塵。取葉芽枝剪成具有一個(gè)葉芽的莖段，然后在無菌操作條件下進(jìn)行外植體滅菌，將具有一個(gè)葉芽的莖段放在500mL的燒杯內(nèi)。用2:l(ff/V)大蒜水溶液(大蒜:無菌單蒸水為2:1，去皮大蒜搗成漿加無菌單蒸水?dāng)嚢?分鐘，然后室溫下放置30分鐘后，備用)浸泡30min，取出后用無菌單蒸水沖洗3次，用解剖刀切下葉芽放在無菌濾紙上吸干水分，然后接種到初代培養(yǎng)基上。
[0061]另一種外植體是生長季的嫩梢。具體做法:取2~3cm長頂端嫩梢，直接放入到1:1(W/ν)大蒜水溶液(大蒜:無菌單蒸水為1:1，去皮大蒜搗成漿加無菌單蒸水?dāng)嚢?min，然后室溫下放置30min后,備用)浸泡30min,取出后用無菌單蒸水沖洗3次,最后用無菌濾紙吸干水分，接種到初代培養(yǎng)基上。
[0062]培養(yǎng)室條件是22°C，光照強(qiáng)度2500LX，光周期12h/d.。初代培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基為:MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.05mg/L+ 瓊脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L，ρΗ5.8。
[0063]初代培養(yǎng)的結(jié)果分兩種情況，一種是外植體是休眠季的葉芽時(shí)，外植體的無菌率為100%，初代培養(yǎng)的萌芽率可達(dá)90 %。另一種是外植體是生長季的嫩梢時(shí)，所接種的嫩梢無菌率為100%，生長率為95%。
[0064]2.繼代培養(yǎng):外植體經(jīng)初代培養(yǎng)，剪成單芽莖段接種到繼代培養(yǎng)基上，以MS基本培養(yǎng)基+6-芐基腺嘌呤0.5mg/L+吲哚丁酸0.lmg/L,附加瓊脂7g/L,蔗糖30g/L，莖段增殖系數(shù)為最大，平均為5.6。
[0065]3.生根培養(yǎng):以MS基本培養(yǎng)基+6-芐基腺嘌呤0.lmg/L+吲哚丁酸0.lmg/L,附加瓊脂7g/L，蔗糖30g/L，生根最好，生根率達(dá)到100%，生根條數(shù)平均為12.5條。
[0066]4.馴化和移栽:在馴化過程中，珍珠巖和沙土上的存活率均達(dá)到100%。移栽在中性壤土中，成活率90.45%。
[0067] 以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種甜櫻桃品種晚紅珠的離體再生方法，其特征在于，包括如下步驟: .51、外植體滅菌:取晚紅珠品種甜櫻桃樹在生長季的嫩梢作為外植體；所述嫩梢為2~.3cm長頂端嫩梢，直接放入大蒜水溶液浸泡，取出后用無菌單蒸水沖洗3次，最后用無菌濾紙吸干水分； . 52、初代培養(yǎng):將所述外植體接種到初代培養(yǎng)基上；所述初代培養(yǎng)基為:MS+6-芐基腺嘿呤0.2~0.5mg/L+ Π引噪丁酸0.01~0.05mg/L+瓊月旨5~7g/L+鹿糖20~30g/L, pH5.6~.5.8 ;培養(yǎng)室條件是22~25°C，光照強(qiáng)度2500~3000LX，光周期12h/d ； 53、繼代培養(yǎng):所述外植體經(jīng)初代培養(yǎng)后，剪成單芽莖段接種到繼代培養(yǎng)基上；所述繼代培養(yǎng)基為:MS+6-芐基腺嘌呤0.5~1.0mg/L+吲哚丁酸0.05~0.2mg/L,附加瓊脂5~.7g/L，蔗糖20~30g/L ;培養(yǎng)至莖段增殖系數(shù)達(dá)5~8 ; .54、生根培養(yǎng):在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基為:MS+6-芐基腺嘌呤0.05~.0.2mg/L+吲哚丁酸0.1~0.5mg/L,附加瓊脂5~7g/L,鹿糖20~30g/L ;培養(yǎng)至生根條數(shù)為11~15條； .55、馴化和移栽:移栽在土壤中栽培。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述甜櫻桃品種晚紅珠的離體再生方法，其特征在于，步驟S5所述土壤為珍珠巖或沙土或蛭石或腐殖土。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述甜櫻桃品種晚紅珠的離體再生方法，其特征在于，SI中所述大蒜水溶液的制配方法為:去皮大蒜搗成漿加無菌單蒸水?dāng)嚢?min，其中，按重量/體積比大蒜:無菌單蒸水為1:1 ，，然后室溫下放置30min，備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述甜櫻桃品種晚紅珠的離體再生方法，其特征在于， .52、所述初代培養(yǎng)基為:MS+6-芐基腺嘌呤0.3mg/L+IBA0.04mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖.30g/L，pH5.8 ;培養(yǎng)室條件是23°C，光照強(qiáng)度2500LX，光周期12h/d ； .53、所述繼代培養(yǎng)基為:MS+6-芐基腺嘌呤1.0mg/L+吲哚丁酸0.lmg/L,附加瓊脂7g/L，蔗糖30g/L，莖段增殖系數(shù)為8 ； . 54、所述生根培養(yǎng)基為:MS+6-芐基腺嘌呤0.lmg/L+吲哚丁酸0.5mg/L,附加瓊脂7g/L,蔗糖30g/L，生根條數(shù)為15條。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104012406SQ201410137151
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】侯義龍, 于亞軍, 張立娟, 倪天澤 申請人:大連大學(xué)