一種大巖桐組培繁殖和塊莖保存及其再繁殖的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種大巖桐組培繁殖和保存及其再繁殖的方法，包括母株培養(yǎng)、外植體選擇與消毒，在培養(yǎng)溫度為26±2℃，光照培養(yǎng)時間為每天11～13h，光照強(qiáng)度為2500～5000lx條件下誘導(dǎo)分化；在500ml的三角瓶中繼代擴(kuò)繁；組培苗移栽，組培苗定植得到大巖桐組培苗木；組培苗保存及其再繁殖是將擴(kuò)繁瓶子苗在500ml的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為16～28℃，光照強(qiáng)度為500～1500lx，光照時間為每天11～12h，瓶內(nèi)結(jié)球，用塊莖保存繼代；瓶內(nèi)塊莖的復(fù)蘇和進(jìn)入下一周期的繼代擴(kuò)繁。本方法具有簡單易行、效高價廉、繁殖速度快，不受時間和季節(jié)的限制，有利于高效繁殖，并應(yīng)用于實際生產(chǎn)，具有較好經(jīng)濟(jì)效益、社會效益和生態(tài)效益。
【專利說明】一種大巖桐組培繁殖和塊莖保存及其再繁殖的方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于植物栽培【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及觀賞花卉快速繁殖和無菌材料的基因保存，具體涉及一種大巖桐組培繁殖和塊莖保存及其再繁殖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大巖桐speciiosa)是苦苣苔科大巖桐屬多年生肉質(zhì)球根草本花丼,原產(chǎn)于巴西的熱帶雨林，二十世紀(jì)三十年代引進(jìn)我國。大巖桐的塊莖扁球形，地上莖極短，株高15-25 cm，全株密被白色絨毛，花大色艷，花期長，是室內(nèi)盆栽、花壇造型、會議租擺的理想花卉。大巖桐不耐寒，植株地上部分在冬季會枯死，地下塊莖越冬保存需要非常適宜的溫度、濕度和基質(zhì)，一般是把塊莖取出，埋藏在微濕的沙中；在管理得當(dāng)?shù)那闆r下，大巖桐的塊莖可連續(xù)栽植7年至8年；在太濕、太干、太冷的條件下越冬，大巖桐塊莖容易腐爛、干癟，失去活性。大巖桐常規(guī)采用播種、分割塊莖、枝插、葉插等方法繁殖，繁殖系數(shù)較低。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以在短時間內(nèi)提供大批大巖桐苗木，且能保持優(yōu)良品種的性狀，是一個很有潛力的發(fā)展方向。
[0003]二十年來，國內(nèi)研究大巖桐組織培養(yǎng)的論文超過一百篇，但大多數(shù)研究停留在實驗室探討階段。目前為止，國內(nèi)只有我們和上海師范大學(xué)的趙小梅、孫靜秋、戴黎鳴注意到大巖桐外植體有瓶內(nèi)結(jié)球、形成塊莖的現(xiàn)象。趙小梅等以大巖桐葉、頂芽為外植體，研究了“NAA、IBA對大巖桐塊莖形成的影響”(上海師范大學(xué)學(xué)報，2006年4期);孫靜秋等在“大巖桐試管結(jié)球的初步研究”中，探討了不同蔗糖濃度、添加活性炭和液體懸浮培養(yǎng)對大巖桐試管結(jié)球的影響(上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2003年4期);戴黎鳴等在“影響大巖桐試管塊莖形成的若干因素”中，以大巖桐頂芽帶2對葉、葉帶葉柄為材料，研究了不同碳源、BA濃度和光照條件對大巖桐試管塊莖形成的影響(上海師范大學(xué)學(xué)報，2006年5期)。
`[0004]本發(fā)明專利的發(fā)明人黃小榮，1985~2010年在廣西林科院組培室研究了“華南地區(qū)年產(chǎn)100萬組培苗工廠新樹種基因庫的建立”，對金花茶、牡丹山茶等五十幾種珍稀林木、花卉組培基因的保存技術(shù)進(jìn)行了研究(廣西林業(yè)，1990年SI期)。1998年，林業(yè)部重點(diǎn)項目“南亞熱帶珍稀花木培育技術(shù)研究”的實施，引進(jìn)了 8種珍稀大巖桐品種，其中4個品種建立了無菌再生繁殖體系(黃小榮等，“大巖桐的組織培養(yǎng)”，廣西林業(yè)科學(xué)，2001年3期)。與上海師范大學(xué)的三個研究團(tuán)隊不同的是，我們的大巖桐結(jié)球是在500 ml三角瓶的改良ER繼代培養(yǎng)基上自然發(fā)生的，塊莖為土豆色；他們的大巖桐試管結(jié)球是誘導(dǎo)產(chǎn)生的，塊莖為淺綠、黃綠、鮮綠和墨綠色；我們用于保存的塊莖質(zhì)量較好，個頭較大(4~7 _)，而且是處于半休眠狀態(tài)的塊莖。我們繼代保存培養(yǎng)時使用的是瓶苗的基部，而他們研究試管內(nèi)結(jié)球時使用的材料是頂芽、葉、頂芽帶2對葉、葉帶葉柄。我們用來使組培苗從旺盛生長繁殖轉(zhuǎn)向結(jié)球半休眠狀態(tài)的關(guān)鍵因素不是NAA、IBA、BA、活性炭、懸浮培養(yǎng)，而是培養(yǎng)基的瓊脂含量，即基質(zhì)的含水率和硬度，輔以弱光照和比常規(guī)繼代擴(kuò)繁培養(yǎng)基略高的蔗糖含量。
[0005]大巖桐組培快繁工廠化生產(chǎn)中存在的最大問題，是生產(chǎn)期與銷售期的脫節(jié)，以及在不生產(chǎn)的年份如何低成本地保存無菌離體基因，在生產(chǎn)的季節(jié)隨時提供無菌材料擴(kuò)大生產(chǎn)。大巖桐無菌離體繁殖材料在常規(guī)MS繼代培養(yǎng)條件下生長太快，特別是瓶子苗的株高生長，每月達(dá)3~6 cm，很快頂?shù)脚囵B(yǎng)容器上部的棉塞或瓶蓋，容易因此造成污染。所以，一般大巖桐無菌瓶苗I個月需要繼代培養(yǎng)I次。在I~2年都沒有大訂單的情況下，請工人配培養(yǎng)基、消毒、繼代來保存無菌離體繁殖材料的花費(fèi)相當(dāng)大；另一方面，大巖桐外植體消毒接種的成功率很低，且接種材料的獲取受到室外溫度、盆苗植株生長狀況的影響；當(dāng)重新出現(xiàn)市場需求時，如果要從重新接種來形成生產(chǎn)規(guī)模的話，往往需要較長時間，難以滿足市場需求。因此，只有開發(fā)一種能夠減緩大巖桐瓶子苗株高生長的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，減少繼代轉(zhuǎn)瓶頻率，同時又能夠保持無菌材料的活力和數(shù)量以備隨時投入生產(chǎn)，形成一套‘收放自如’的大巖桐組培生產(chǎn)和保存體系，才能達(dá)到低成本地保存無菌材料和迅速擴(kuò)繁生產(chǎn)盈利的雙重要求。
[0006]我們試驗了不同培養(yǎng)容器對大巖桐瓶內(nèi)結(jié)球的影響，發(fā)現(xiàn)有利于大巖桐離體保存的培養(yǎng)容器從優(yōu)到劣排列順序是500 ml三角瓶、250 ml三角瓶、250 ml廣口瓶、直徑3 cm試管、直徑2 cm試管。通過調(diào)整繼代培養(yǎng)基瓊脂含量、光照強(qiáng)度，使大巖桐瓶苗向結(jié)球供應(yīng)養(yǎng)料，減緩瓶苗的株高生長和芽苗分化，延長繼代周期，利用大巖桐固有的結(jié)球特征進(jìn)行瓶內(nèi)基因保存，保存的材料隨時可應(yīng)用于快繁生產(chǎn)，這一技術(shù)具有實用性和創(chuàng)新性，特別是對于那些稀有大巖桐品種的離體保存和快速大規(guī)模商品化生產(chǎn)，具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對大巖桐常規(guī)繁殖技術(shù)的不足，旨在提供一種大巖桐組培繁殖和塊莖保存及其再繁殖的方法。
[0008]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
一種大巖桐組培繁殖和保存及其再繁殖的方法，組培繁殖包括母株培養(yǎng)、外植體選擇與消毒、誘導(dǎo)分化、繼代擴(kuò)繁、組培苗移栽、組培苗定植工序，得到大巖桐組培苗木；保存及其再繁殖的方法是將瓶子苗從擴(kuò)繁轉(zhuǎn)向瓶內(nèi)結(jié)球、保存塊莖的繼代、瓶內(nèi)塊莖的復(fù)蘇和進(jìn)入下一周期的繼代擴(kuò)繁，其操作步驟如下:
(1)母株培養(yǎng):選用開過花或正在`開花的盆栽大巖桐作為母株，適當(dāng)追肥、修剪，促進(jìn)大巖桐萌芽和植株的生長；
(2)外植體選擇與消毒:選擇大巖桐健壯的腋芽或頂芽帶下部枝條，剪成3~4cm，在超凈工作臺上用70 %的乙醇浸潤8~10秒，再用無菌水漂洗2次，然后將材料轉(zhuǎn)移到已滅菌的廣口瓶，用0.1 %的升汞消毒10~12分鐘,最后用無菌水清洗5次；
(3)誘導(dǎo)分化:將消毒好的外植體的兩端切口分別剪去2~3mm，將修剪好的外植體斜插在試管誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用改良ER配方，附加BA 0.5 mg/L,NAA 0.25mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂4.5 g/L，為了提高接種成功率，每只試管只插一個外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26±2 °C，光照培養(yǎng)時間為每天11~13 h，光照強(qiáng)度為2500~5000 Ix,
15天后外植體膨大，25天后出現(xiàn)芽點(diǎn)；
(4)繼代擴(kuò)繁:將試管接種成功的無菌材料轉(zhuǎn)入裝有繼代培養(yǎng)基的500ml三角瓶容器中，所述的繼代培養(yǎng)基采用改良ER配方，附加BA 0.2~0.25 mg/L, NAA 0.1~0.12 mg/L,蔗糖30 g/L、瓊脂4.5 g/L,主要是通過腋生枝途徑繼代擴(kuò)繁，少數(shù)接觸到繼代培養(yǎng)基的葉片也產(chǎn)生叢生芽，溫度和光照同誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，25~32天繼代I次，每瓶有效瓶子苗20~40株；
(5)組培苗移栽:移栽組培苗，苗床基質(zhì)先用0.1 %的高錳酸鉀淋透消毒I天后使用，所述的苗床基質(zhì)為沙3份+珍珠巖1份；移栽時先將3~6 cm高的組培叢生苗從三角瓶內(nèi)夾出，清水洗去培養(yǎng)基，再將組培叢生苗分成單株，移栽到苗床上；
(6)組培苗定植:組培苗在苗床上經(jīng)過28~32天的馴化適應(yīng)之后，挑選健壯植株移栽到裝有定植基質(zhì)的營養(yǎng)杯定植，所述的定植基質(zhì)為珍珠巖1份、沙3份、素土 3份，定植后的杯苗I月后可以出售；
(7)瓶內(nèi)結(jié)球:完成組培苗生產(chǎn)任務(wù)后，剩余的繼代擴(kuò)繁瓶子苗作為備用材料進(jìn)入保存階段，保存階段采用保存培養(yǎng)基在500 ml的三角瓶中培養(yǎng)，所述的保存培養(yǎng)基采用改良ER配方，附加 BA 0.2 ~0.25 mg/L, NAA 0.1 ~0.12 mg/L，蔗糖 40 g/L、瓊脂 6.5 g/L，培養(yǎng)溫度為16~28°C，光照強(qiáng)度為500~1500 lx，光照時間為每天11~12 h，修剪瓶子苗，剪去株高高于2.5~3 cm以上的部分，保留膨大的基部，剪好的材料直插方式轉(zhuǎn)入裝有保存培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中培養(yǎng),插入深度為3~6 mm,由于保存培養(yǎng)基較硬,模擬了冬季的干旱條件，瓶子苗的株高生長很慢，分化芽非常少，養(yǎng)分開始供應(yīng)基部結(jié)球，保存3.5~4月后，瓶子苗的基部結(jié)球直徑達(dá)2~4 mm ;
(8)保存塊莖的繼代:每隔3.5~4月，將瓶內(nèi)結(jié)球從舊的保存培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入新的保存培養(yǎng)基，以避免三角瓶的棉塞連續(xù)使用太長時間而出現(xiàn)霉菌污染，保留塊莖和其上部2.5~3cm高的植株，其余材料剪掉丟棄，保存溫度為16~28°C，光照強(qiáng)度為500~1500 lx，光照時間為每天11~12 h，塊莖逐漸增大，經(jīng)過I年的保存，塊莖直徑可達(dá)4~7 mm ;
(9)瓶內(nèi)塊莖的 復(fù)蘇:當(dāng)需要擴(kuò)大生產(chǎn)時，將半休眠狀態(tài)的塊莖材料復(fù)蘇喚醒，將保存的瓶內(nèi)塊莖和其上部植株整塊轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使塊莖完全浸泡在半固態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室溫度升高至26±2°C，光照強(qiáng)度提高到2500~5000 lx，每天光照11~13 h，20~30天塊莖分化大量新芽，繁殖系數(shù)10以上，切分塊莖，進(jìn)入下一周期腋生枝繼代擴(kuò)繁階段。
[0009]以上所述的改良ER 配方為=NH4NO3 1200 mg/L,KNO3 1600 mg/L,CaCl2 400 mg/L、MgSO4 370 mg/L、KH2PO4 170 mg/L、H3BO3 0.63 mg/L、MnSO4.4H20 2.23 mg/L、ZnSO4.7H2015 mg/L、Na2MoO2.2H20 0.025 mg/L、CuSO4.5H20 0.0025 mg/L、FeSO4.7H20 27.8 mg/L、Na2.EDTA.2H20 37.3 mg/L、肌醇 100 mg/L、煙酸 I mg/L、鹽酸吡哆醇 0.5 mg/L、鹽酸硫胺素I mg/L、甘氨酸I mg/L。
[0010]本發(fā)明相對于現(xiàn)有的技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):
(I)本發(fā)明一種大巖桐組培繁殖和塊莖保存及其再繁殖的方法，利用大巖桐的自然結(jié)球特性，通過改變培養(yǎng)基瓊脂含量，調(diào)整培養(yǎng)基含水率和硬度，調(diào)整光照強(qiáng)度，減緩瓶子苗株高生長，促使瓶內(nèi)結(jié)球，延長保存繼代周期，減少備用基因保存的成本。
[0011](2)本發(fā)明一種大巖桐組培繁殖和塊莖保存及其再繁殖的方法，使用瓶內(nèi)結(jié)球繼續(xù)轉(zhuǎn)入保存培養(yǎng)基的方法，使瓶內(nèi)塊莖在新的保存培養(yǎng)基上繼續(xù)增大、分化芽苗很少，形成的塊莖個頭大、質(zhì)量好，在需要生產(chǎn)時可以迅速擴(kuò)繁。
[0012](3)本發(fā)明一種大巖桐組培繁殖和塊莖保存及其再繁殖的方法，利用500 ml三角瓶作為容器進(jìn)行組培生產(chǎn)和備用基因保存，這種容器的內(nèi)空大，瓶口塞上棉塞，再包上牛皮紙，單瓶容納的材料多，單次保存繼代可存放3.5~4月不污染，極大地減少了勞力使用。如果采用試管保存，單管容納材料少，離體保存轉(zhuǎn)瓶需要的人力較多。廣口瓶的瓶高相對較矮，瓶苗容易頂?shù)狡可w，容易污染，達(dá)不到長期離體保存基因的目的。
[0013](4)本發(fā)明一種大巖桐組培繁殖和塊莖保存及其再繁殖的方法，結(jié)合組培快繁和離體基因保存技術(shù)，解決了大巖桐組培苗供求脫節(jié)的問題，具有簡便易行、成本低廉、擴(kuò)繁迅速、成活率高的特征；在組培快繁和離體保存中始終使用低激素，有利于保持品種的優(yōu)良特性。本發(fā)明對于珍稀大巖桐品種的保存和快繁具有重大意義。
【具體實施方式】
[0014]通過下面給出的具體實施例，可以進(jìn)一步清楚地了解本發(fā)明，但它們不是對本發(fā)明的限定。
[0015]實施例1
選用開過花或正在開花的盆栽大巖桐作為母株，適當(dāng)追肥、修剪，促進(jìn)大巖桐萌芽和植株的生長；選擇大巖桐健壯的腋芽或頂芽帶下部枝條為外植體，剪成3~4 cm,在超凈工作臺上用70 %的乙醇浸潤10秒，再用無菌水漂洗2次，然后將材料轉(zhuǎn)移到已滅菌的廣口瓶，用0.1 %的升汞消毒10分鐘,最后用無菌水清洗5次。
[0016]將消毒好的外植體的兩端切口分別剪去2~3 mm，將修剪好的外植體斜插在試管以 NH4NO3 1200 mg/L, KNO3 1600 mg/L, CaCl2 400 mg/L、MgSO4 370 mg/L,KH2PO4 170 mg/L、H3BO3 0.63 mg/L、MnSO4.4H20 2.23 mg/L、ZnSO4.7H20 15 mg/L、Na2MoO2.2H20 0.025 mg/L、CuSO4.5H20 0.0025 mg/L、FeSO4.7H20 27.8 mg/L、Na2.EDTA.2H20 37.3 mg/L、肌醇100 mg/L、煙酸I mg/L、鹽酸吡B多醇0.5 mg/L、鹽酸硫胺素I mg/L、甘氨酸I mg/L組成的改良ER配方，附加BA 0.5 mg/L、NAA 0.25 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂4.5 g/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每只試管只插一個外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26 ±2 V,光照培養(yǎng)時間為每天12h，光照強(qiáng)度為5000 lx，15天后外植體膨大，22天后出現(xiàn)芽點(diǎn)；再將試管接種成功的無菌材料轉(zhuǎn)入裝有上述改良ER配方，附加BA 0.2 mg/L, NAA 0.1 mg/L，蔗糖30 g/L、瓊脂4.5 g/L的繼代培養(yǎng)基的500 ml三角瓶容器中，主`要是通過腋生枝途徑繼代擴(kuò)繁，少數(shù)接觸到繼代培養(yǎng)基質(zhì)的葉片也產(chǎn)生叢生芽，溫度和光照同誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，25天繼代I次，每瓶有效瓶子苗28~32株。
[0017]將繼代擴(kuò)繁組培苗移栽，移栽前先用0.1 %的高錳酸鉀淋透苗床消毒I天，苗床基質(zhì)為沙3份+珍珠巖1份，繼代擴(kuò)繁組培苗移栽時先將3~6 cm高的組培叢生苗從三角瓶內(nèi)夾出，清水洗去培養(yǎng)基，再將組培叢生苗分成單株，移栽到苗床上；組培苗在苗床上經(jīng)過32天的馴化適應(yīng)之后，挑選健壯植株移栽到裝有以珍珠巖1份、沙3份、素土 3份的定植基質(zhì)的營養(yǎng)杯定植，定植I月后出售杯苗。
[0018]實施例2
選用開過花或正在開花的盆栽大巖桐作為母株，適當(dāng)追肥、修剪，促進(jìn)大巖桐萌芽和植株的生長；選擇大巖桐健壯的腋芽或頂芽帶下部枝條為外植體，剪成3~4 cm,在超凈工作臺上用70 %的乙醇浸潤10秒，再用無菌水漂洗2次，然后將材料轉(zhuǎn)移到已滅菌的廣口瓶，用0.1 %的升汞消毒11分鐘，最后用無菌水清洗5次。
[0019]將消毒好的外植體的兩端切口分別剪去2~3 mm，將修剪好的外植體斜插在以NH4NO3 1200 mg/L、KNO3 1600 mg/L、CaCl2 400 mg/L、MgSO4 370 mg/L、KH2PO4 170 mg/L、H3BO3 0.63 mg/L、MnSO4.4H20 2.23 mg/L、ZnSO4.7H20 15 mg/L、Na2MoO2.2H20 0.025 mg/L、CuSO4.5H20 0.0025 mg/L、FeSO4.7H20 27.8 mg/L、Na2.EDTA.2H20 37.3 mg/L、肌醇100 mg/L、煙酸I mg/L、鹽酸批卩多醇0.5 mg/L、鹽酸硫胺素I mg/L、甘氨酸I mg/L組成的改良ER配方，附加BA 0.5 mg/L,NAA 0.25 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂4.5 g/L的試管誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每只試管只插一個外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26±2 °C,光照培養(yǎng)時間為每天13 h，光照強(qiáng)度為2500 lx，15天后外植體膨大，25天后出現(xiàn)芽點(diǎn)；再將試管接種成功的無菌材料轉(zhuǎn)入裝有以上所述的改良ER配方，附加BA 0.25 mg/L,NAA 0.12 mg/L，蔗糖30 g/L、瓊脂4.5 g/L的繼代培養(yǎng)基的500 ml三角瓶容器中，主要是通過腋生枝途徑繼代擴(kuò)繁，少數(shù)接觸到繼代培養(yǎng)基質(zhì)的葉片也產(chǎn)生叢生芽，溫度和光照同誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，32天繼代I次，每瓶有效瓶子苗30~35株。
[0020]將繼代擴(kuò)繁組培苗移栽，移栽前先用0.1 %的高錳酸鉀淋透苗床消毒I天后使用，苗床基質(zhì)為沙3份+珍珠巖1份，繼代擴(kuò)繁組培苗移栽時先將3~6 cm高的組培叢生苗從三角瓶內(nèi)夾出，清水洗去培養(yǎng)基質(zhì)，整叢移栽到苗床上；組培苗在苗床上經(jīng)過32天的馴化適應(yīng)之后，分成單株，挑選健壯單株移栽到裝有定植基質(zhì)的營養(yǎng)杯定植，定植基質(zhì)為珍珠巖1份、沙3份、素土 3份，定植I月后出售杯苗。
[0021]實施例3
選用開過花或正在開花的盆栽大巖桐作為母株，適當(dāng)追肥、修剪，促進(jìn)大巖桐萌芽和植株的生長；選擇大巖桐健壯的腋芽或頂芽帶下部枝條為外植體，剪成3~4 cm,在超凈工作臺上用70 %的乙醇浸潤9秒，再用無菌水漂洗2次，然后將材料轉(zhuǎn)移到已滅菌的廣口瓶，用
0.1 %的升汞消毒12分鐘,最后用無菌水清洗5次。
[0022]將消毒好的外植體的兩端切口分別剪去2~3 mm，將修剪好的外植體斜插在以上所述的改良ER配方，附加BA 0.5 mg/L>NAA 0.25 mg/L、鹿糖30 g/L、瓊脂4.5 g/L的試管誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每只試管只插一`個外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26±2 °C,光照培養(yǎng)時間為每天12 h，光照強(qiáng)度為4000 Ix, 15天后外植體膨大，25天后出現(xiàn)芽點(diǎn)；再將試管接種成功的無菌材料轉(zhuǎn)入裝有以 NH4NO3 1200 mg/L,KNO3 1600 mg/L,CaCl2 400 mg/L,MgSO4 370mg/L、KH2PO4 170 mg/L、H3BO3 0.63 mg/L、MnSO4.4H20 2.23 mg/L、ZnSO4.7H20 15 mg/L、Na2MoO2.2H20 0.025 mg/L、CuSO4.5H20 0.0025 mg/L、FeSO4.7H20 27.8 mg/L、Na2.EDTA? 2H20 37.3 mg/L、肌醇100 mg/L、煙酸I mg/L、鹽酸吡B多醇0.5 mg/L、鹽酸硫胺素I mg/L、甘氨酸I mg/L組成的改良ER，附加BA 0.2~0.25 mg/L, NAA 0.1~0.12 mg/L，蔗糖
30g/L、瓊脂4.5 g/L的繼代培養(yǎng)基的500 ml三角瓶容器中，主要是通過腋生枝途徑繼代擴(kuò)繁，少數(shù)接觸到繼代培養(yǎng)基質(zhì)的葉片也產(chǎn)生叢生芽，溫度和光照同誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，28天繼代I次，每瓶有效瓶子苗28~32株。
[0023]將繼代擴(kuò)繁組培苗移栽，移栽前先準(zhǔn)備好沙3份+珍珠巖1份的苗床基質(zhì)，先用
0.1 %的高錳酸鉀淋透消毒I天后使用，繼代擴(kuò)繁組培苗移栽時先將3~6 cm高的組培叢生苗從三角瓶內(nèi)夾出，清水洗去培養(yǎng)基，再將組培叢生苗分成單株，移栽到苗床上；組培苗在苗床上經(jīng)過30天的馴化適應(yīng)之后，挑選健壯植株移栽到裝有以珍珠巖1份、沙3份、素土3份的定植基質(zhì)的營養(yǎng)杯定植，定植I月后出售杯苗。
[0024]實施例4
將上述實施例1中完成組培苗生產(chǎn)任務(wù)后剩余的繼代擴(kuò)繁瓶子苗保存，保存采用上述的保存培養(yǎng)基，即改良ER配方，附加BA 0.2 mg/L, NAA 0.1 mg/L，蔗糖40 g/L、瓊脂6.5 g/L，用500 ml的三角瓶進(jìn)行培養(yǎng)保存，培養(yǎng)溫度為22~28°C，光照強(qiáng)度為500~800 Ix,光照時間為每天12 h;修剪瓶子苗，剪去株高高于2.5~3 cm以上的部分，保留膨大的基部，剪好的材料直插方式轉(zhuǎn)入裝有保存培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中培養(yǎng)，插入深度為5~6 mm，由于保存培養(yǎng)基較硬，模擬了冬季的干旱條件，瓶子苗的株高生長很慢，分化芽非常少，養(yǎng)分開始供應(yīng)基部結(jié)球，保存3.5~4月后，瓶子苗的基部結(jié)球直徑達(dá)2~4 mm。
[0025]保存每隔3.5~4月，將瓶內(nèi)結(jié)球從舊的保存培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入上述新的保存培養(yǎng)基，以避免三角瓶的棉塞連續(xù)使用太長時間而出現(xiàn)霉菌污染，保存是保留塊莖和其上部2.5~3cm高的植株，其余材料剪掉丟棄，保存溫度為22~28°C，光照強(qiáng)度為500~800 lx，光照時間為每天12 h，塊莖逐漸增大，經(jīng)過I年的保存，塊莖直徑可達(dá)6~7 _ ;當(dāng)需要擴(kuò)大生產(chǎn)時，將半休眠狀態(tài)的塊莖材料復(fù)蘇喚醒，將保存的瓶內(nèi)塊莖和其上部植株整塊轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使塊莖完全浸泡在半固態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室溫度升高至26±2°C，光照強(qiáng)度提高到3500~5000 lx，每天光照12 h，20天塊莖分化大量新芽，繁殖系數(shù)10以上，切分塊莖，按實施例I大巖桐組培繁殖條件進(jìn)行下一周期腋生枝繼代擴(kuò)繁，能快速得到市場需要的杯苗。
[0026]實施例5
將上述實施例2完成組培苗生產(chǎn)任 務(wù)后剩余的繼代擴(kuò)繁瓶子苗保存，保存采用上述的保存培養(yǎng)基，即改良ER配方，附加BA 0.25 mg/L, NAA 0.12 mg/L，蔗糖40 g/L、瓊脂6.5g/L的保存培養(yǎng)基，用500 ml的三角瓶進(jìn)行保存培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為16~20°C，光照強(qiáng)度為1000~1500 lx，光照時間為每天11 h，修剪瓶子苗，剪去株高高于2.5~3 cm以上的部分，保留膨大的基部，剪好的材料直插方式轉(zhuǎn)入裝有上述保存培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中培養(yǎng)，插入深度為3~4 mm，由于保存培養(yǎng)基較硬，模擬了冬季的干旱條件，瓶子苗的株高生長很慢，分化芽非常少，養(yǎng)分開始供應(yīng)基部結(jié)球。
[0027]保存3.5~4月后，瓶子苗的基部結(jié)球直徑達(dá)2~3 mm ;每隔3.5~4月，將瓶內(nèi)結(jié)球從舊的保存培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入新的保存培養(yǎng)基，以避免三角瓶的棉塞連續(xù)使用太長時間而出現(xiàn)霉菌污染，保留塊莖和其上部2. 5~3 cm高的植株，其余材料剪掉丟棄，保存溫度為16~20°C，光照強(qiáng)度為1000~1500 lx，光照時間為每天11 h，塊莖逐漸增大，經(jīng)過I年的保存，塊莖直徑可達(dá)4~6 mm ;當(dāng)需要擴(kuò)大生產(chǎn)時，將半休眠狀態(tài)的塊莖材料復(fù)蘇喚醒，將保存的瓶內(nèi)塊莖和其上部植株整塊轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使塊莖完全浸泡在半固態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室溫度升高至26±2°C，光照強(qiáng)度提高到2500~3000 lx，每天光照13 h，25天塊莖分化大量新芽，繁殖系數(shù)10以上，切分塊莖，按實施例2大巖桐組培繁殖條件進(jìn)行下一周期腋生枝繼代擴(kuò)繁階段，能快速得到市場需要的杯苗。
【權(quán)利要求】
1.一種大巖桐組培繁殖和保存及其再繁殖的方法，其特征在于:組培繁殖包括母株培養(yǎng)、外植體選擇與消毒、誘導(dǎo)分化、繼代擴(kuò)繁、組培苗移栽、組培苗定植工序，得到大巖桐組培苗木；保存及其再繁殖的方法是將瓶子苗從擴(kuò)繁轉(zhuǎn)向瓶內(nèi)結(jié)球、保存塊莖的繼代、瓶內(nèi)塊莖的復(fù)蘇和進(jìn)入下一周期的繼代擴(kuò)繁，其操作步驟如下: (1)母株培養(yǎng):選用開過花或正在開花的盆栽大巖桐作為母株，適當(dāng)追肥、修剪，促進(jìn)大巖桐萌芽和植株的生長； (2)外植體選擇與消毒:選擇大巖桐健壯的腋芽或頂芽帶下部枝條，剪成3~4cm，在超凈工作臺上用70 %的乙醇浸潤8~10秒，再用無菌水漂洗2次，然后將材料轉(zhuǎn)移到已滅菌的廣口瓶，用0.1 %的升汞消毒10~12分鐘,最后用無菌水清洗5次； (3)誘導(dǎo)分化:將消毒好的外植體的兩端切口分別剪去2~3mm，將修剪好的外植體斜插在試管誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，為了提高接種成功率，每只試管只插一個外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26±2 °C，光照培養(yǎng)時間為每天11~13 h，光照強(qiáng)度為2500~5000 lx，15天后外植體膨大，25天后出現(xiàn)芽點(diǎn)； (4)繼代擴(kuò)繁:將試管接種成功的無菌材料轉(zhuǎn)入裝有繼代培養(yǎng)基的500ml三角瓶容器中，主要是通過腋生枝途徑繼代擴(kuò)繁，少數(shù)接觸到繼代培養(yǎng)基的葉片也產(chǎn)生叢生芽，溫度和光照同誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，25~32天繼代I次，每瓶有效瓶子苗20~40株； (5)組培苗移栽:移栽組培苗，苗床基質(zhì)先用0.1 %的高錳酸鉀淋透消毒I天后使用；移栽時先將3~6 cm高的組培叢生苗從三角瓶內(nèi)夾出，清水洗去培養(yǎng)基，再將組培叢生苗分成單株，移栽到苗床上； (6)組培苗定植:組培苗在苗床上經(jīng)過28~32天的馴化適應(yīng)之后，挑選健壯植株移栽到裝有定植基質(zhì)的營養(yǎng)杯定植，定植后的杯苗I月后可以出售； (7)瓶內(nèi)結(jié)球:完成組 培苗生產(chǎn)任務(wù)后，剩余的繼代擴(kuò)繁瓶子苗作為備用材料進(jìn)入保存階段，保存階段采用保存培養(yǎng)基在500 ml的三角瓶中培養(yǎng)，修剪結(jié)球瓶子苗； (8)保存塊莖的繼代:每隔3.5~4月，將瓶內(nèi)結(jié)球從舊的保存培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入新的保存培養(yǎng)基，以避免三角瓶的棉塞連續(xù)使用太長時間而出現(xiàn)霉菌污染，保留塊莖和其上部2.5~3cm高的植株，其余材料剪掉丟棄，塊莖逐漸增大，經(jīng)過I年的保存,塊莖直徑可達(dá)4~7 mm ; (9)瓶內(nèi)塊莖的復(fù)蘇:當(dāng)需要擴(kuò)大生產(chǎn)時，將半休眠狀態(tài)的塊莖材料復(fù)蘇喚醒，將保存的瓶內(nèi)塊莖和其上部植株整塊轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使塊莖完全浸泡在半固態(tài)培養(yǎng)基中，20~30天塊莖分化大量新芽，繁殖系數(shù)10以上，切分塊莖，進(jìn)入下一周期腋生枝繼代擴(kuò)繁階段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大巖桐組培繁殖和保存及其再繁殖的方法，其特征在于:所述的改良 ER 配方為=NH4NO3 1200 mg/L、KN03 1 600 mg/L,CaCl2 400 mg/L、MgSO4 370mg/L、KH2PO4 170 mg/L、H3BO3 0.63 mg/L、MnSO4.4H20 2.23 mg/L、ZnSO4.7H20 15 mg/L、Na2MoO2.2H20 0.025 mg/L、CuSO4.5H20 0.0025 mg/L、FeSO4.7H20 27.8 mg/L、Na2.EDTA? 2H20 37.3 mg/L、肌醇100 mg/L、煙酸I mg/L、鹽酸吡B多醇0.5 mg/L、鹽酸硫胺素I mg/L、甘氨酸I mg/L ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大巖桐組培繁殖和保存及其再繁殖的方法，其特征在于:所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用改良ER配方，附加BA 0.5 mg/L、NAA 0.25 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂 4.5 g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大巖桐組培繁殖和保存及其再繁殖的方法，其特征在于:所述的繼代培養(yǎng)基采用改良ER配方，附加BA 0.2~0.25 mg/L, NAA 0.1~0.12 mg/L,鹿糖 30 g/L、瓊脂 4.5 g/Lo
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大巖桐組培繁殖和保存及其再繁殖的方法，其特征在于:所述的苗床基質(zhì)為沙3份+珍珠巖1份。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大巖桐組培繁殖和保存及其再繁殖的方法，其特征在于:所述的定植基質(zhì)為珍珠巖1份、沙3份、素土 3份。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大巖桐組培繁殖和保存及其再繁殖的方法，其特征在于:所述的保存培養(yǎng)基采用改良ER配方，附加BA 0.2~0.25 mg/L, NAA 0.1~0.12 mg/L,鹿糖 40 g/L、瓊脂 6.5 g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大巖桐組培繁殖和保存及其再繁殖的方法，其特征在于:所述的修剪結(jié)球瓶子苗的修剪方法是剪去結(jié)球瓶子苗株高高于2.5~3 cm以上的部分，保留膨大的基部，剪好的材料直插方式轉(zhuǎn)入裝有保存培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中培養(yǎng)，插入深度為3~6 mm，由于保存培養(yǎng)基較硬，模擬了冬季的干旱條件，瓶子苗的株高生長很慢，分化芽非常少，養(yǎng)分開始供應(yīng)基部結(jié)球，保存3.5~4月后，瓶子苗的基部結(jié)球直徑達(dá)2~4 mm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大巖桐組培繁殖和保存及其再繁殖的方法，其特征在于:所述的保存溫度為16~28°C，光照強(qiáng)度為500~1500 lx，光照時間為每天11~12 h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大巖桐組培繁殖和保存及其再繁殖的方法，其特征在于:所述的復(fù)蘇溫度為26±2°C`，光照強(qiáng)度提高到2500~5000 lx，每天光照11~13 h。
【文檔編號】A01H4/00GK103858763SQ201410100445
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月19日
【發(fā)明者】黃小榮, 閆鼎羽, 彭玉華, 申文輝, 龐世龍, 譚一波, 鐘瑜 申請人:廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院