水稻黃化轉(zhuǎn)綠標記基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水稻黃化轉(zhuǎn)綠標記基因及其應用。本發(fā)明提供了水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79，其保藏號為CGMCC?NO.8769。還提供了水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79中的突變基因mGRY79。上述水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79或上述的突變基因mGRY79在培育具有黃化轉(zhuǎn)綠性狀水稻雄性不育系中的應用；本發(fā)明的實驗證明，利用化學誘變獲得水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79。比較野生型和突變體，在野生型水稻發(fā)現(xiàn)一個新基因GRY79，在突變體中發(fā)現(xiàn)該基因?qū)钠渫蛔兓?，突變基因可作為葉色標記基因，用于雜交稻秧苗早期有效鑒定和高效去除假雜種，從而提高雜交稻的田間純度。
【專利說明】水稻黃化轉(zhuǎn)綠標記基因及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種水稻黃化轉(zhuǎn)綠標記基因及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物葉色是葉綠體中各種色素的綜合表現(xiàn)，正常葉片中葉綠素占優(yōu)勢，通常表現(xiàn)為綠色。葉色突變是水稻中較為常見的突變類型，一般受隱性核基因控制。已報道的水稻葉色突變體有數(shù)十個，大致可分為黃化、白化、條紋、斑點等幾大類，在水稻各染色體上均發(fā)現(xiàn)有葉色突變基因的分布。葉色突變的分子機制較為復雜，突變基因可以經(jīng)由多種途徑引起葉色變異，如葉綠素生物合成相關(guān)基因突變，葉綠體分化與發(fā)育受阻，質(zhì)-核信號轉(zhuǎn)導途徑受阻，血紅素的反饋調(diào)節(jié)紊亂，光敏色素調(diào)控受阻，葉綠體蛋白轉(zhuǎn)運受阻等，總之，突變基因直接或間接影響光合色素，特別是葉綠素的合成和降解，導致各種色素的含量和比例改變，從而引起葉色變異。例如，水稻葉綠素合酶基因YGLl和聯(lián)乙烯還原酶基因OsDVR參與葉綠素生物合成，這2個基因突變引起葉色黃化(Wu ZM, Zhang X, HeB，Diao LPj Sheng SLj Wang JLj Guo XPj Su N，Wang LFj Jiang L, Wang CM，Zhai HQj WanJM(2007)A chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyllideesterification in chlorophyll biosynthesis.Plant Physiol145:29-40 ；Wang PR，GaoJXj Wan CM，Zhang FT, Xu ZJ，Huang XQ，Sun XQ，Deng XJ(2010)Divinyl chlorophyll (ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase inrice.Plant Physioll53:994-1003);水稻白條紋基因V2基因編碼鳥苷酸激酶，參與催化質(zhì)體和線粒體內(nèi)鳥苷酸代謝途徑中GMP轉(zhuǎn)化為GDP步驟，突變基因?qū)θ~綠體早期發(fā)育過程有延緩作用(Sugimoto H，Kusumi K，Noguchi K，Yano M, Yoshimura A, Iba K(2007)The ricenuclear gene, VIRESCENT2, is essential for chloroplast development and encodesa novel type of guanylate kinase targeted to plastids and mitochondria.PlantJ52:512-527)0
[0003]以光溫敏雄性核不育為基礎(chǔ)的兩系法雜交水稻已在生產(chǎn)上大面積應用，為我國水稻生產(chǎn)以及雜交水稻技術(shù)的發(fā)展做出了巨大貢獻。然而，光溫敏核不育系存在育性表達受環(huán)境條件特別是溫度的影響，有些年份因無法預測的異常天氣條件而導致育性的波動，致使制種田所生產(chǎn)的雜交種子中含有較多的不育系自交種子(即“假雜種”)，給制種和大田生產(chǎn)帶來重大損失。葉色標記可應用于及早鑒定雜交水稻特別是兩系雜交稻的種子純度，高效排除假雜種，提高雜交種純度，防范可能給生產(chǎn)造成的重大損失，因而受到關(guān)注。在雜交水稻育種中應用的葉色標記性狀應具備以下4個條件:(I)標記性狀明顯，表達時期早，幼苗易鑒別；(2)標記性狀穩(wěn)定，不易受環(huán)境因素影響；(3)標記性狀受隱性核基因控制；(4)標記性狀對雜交種或不育系的產(chǎn)量無顯著負效應。其中黃化(或白化)轉(zhuǎn)綠型突變性狀作為葉色標記性狀在解決雜交稻種子純度上尤具優(yōu)勢，一方面可實現(xiàn)雜種純度的及早、簡便、準確鑒定；另一方面具該性狀的不育系，秧苗前期生長慢，群體競爭力弱，如混雜于雜交種中，易受蔭蔽而死亡，從而達到高效排除假雜種(母本不育系)，提高雜交種純度；第三，避免全生育期表達由于光合作用弱，可能影響不育系本身的農(nóng)藝性狀及其繁殖、制種產(chǎn)量，因而更為育種者所重視和利用(Wu D X, Shu Q Y, Xia Y W.1n vitro mutagenesisinduced novel thermo/photoperiod sensitive genic male sterile indica rice withgreen-revertible xanthan leaf color marker.Euphytica, 2002，123:195-202 ;趙海軍，吳殿星，舒慶堯，沈圣泉，馬傳喜(2004)攜帶白化轉(zhuǎn)綠型葉色標記光溫敏核不育系玉兔S的選育及其特征特性.中國水稻科學，18(6):515-521 ;吳偉，劉鑫，舒小麗，舒慶堯，夏英武，吳殿星(2006)攜帶白化轉(zhuǎn)綠型葉色標記兩系雜交水稻不育系NHR111S.核農(nóng)學報，20(2): 103-105)。
[0004]最近，文獻報道水稻苗期白化轉(zhuǎn)綠突變基因ysa可作為標記基因，用于兩系雜交稻秧苗早期有效鑒定和高效去除假雜種，從而提高兩系雜交稻的田間純度(Su N，Hu ML1WuDX,ffu FQ, Fei GL, Lan Y, Chen XL, Shu XL, Zhang X，Guo XP, Cheng ZJ, Lei CL1Qi CK, JiangL, Wang HY, Wan JM(2012)Disruption of a rice pentatricopeptide repeat proteincauses a seedling-specific albino phenotype and its utilization to enhance seedpurity in hybrid rice production.Plant Physioll59:227_238)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供一種DNA分子。
[0006]本發(fā)明提供的DNA分子(即為突變基因mGRY79)，是如下1)_4)中任一種的DNA分子:
[0007]I)編碼區(qū)為序列A自5’末端第10-7501位所示的DNA分子，所述序列A為將序列表中序列I自5’末端第4218位堿基C突變?yōu)門得到的序列；
[0008]2)編碼區(qū)為序列B自5’末端第10-2625位，所述序列B為將序列表中序列2自5’末端第1169位堿基C突變?yōu)門 ；
[0009]3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子;
[0010]4)與I)或2)限定的DNA序列至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
[0011]上述嚴格條件為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65 °C下雜交，然后用2 X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0012]本發(fā)明的另一個目的是提供水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79。
[0013]本發(fā)明提供的水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79，其保藏號為CGMCC N0.8769。
[0014]上述的DNA分子(即為突變基因mGRY79)或上述的水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79在培育具有黃化轉(zhuǎn)綠性狀水稻雄性不育系中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0015]可以按照常規(guī)的培育方法，將常規(guī)的雜交水稻親本不育系與水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79雜交和/或回交轉(zhuǎn)育，從而得到具有黃化轉(zhuǎn)綠性狀的水稻雄性不育系。
[0016]上述應用中，黃化轉(zhuǎn)綠性狀為植物在I葉期-3葉期葉片呈黃綠色，從4葉期開始葉片逐漸轉(zhuǎn)綠，且在第6葉期-抽穗結(jié)實期葉片為綠色；所述植物為水稻；
[0017]上述應用中，所述水稻具體為粳稻或秈稻。
[0018]本發(fā)明還提供一種培育具有黃化轉(zhuǎn)綠性狀水稻雄性不育系的方法。[0019]本發(fā)明提供的方法，為以上述的水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79為供體、雜交水稻親本不育系為受體，進行雜交和/或回交轉(zhuǎn)育，得到具有黃化轉(zhuǎn)綠性狀的水稻雄性不育系；
[0020]所述黃化轉(zhuǎn)綠性狀為植物在I葉期-3葉期葉片呈黃綠色，從4葉期開始葉片逐漸轉(zhuǎn)綠，且在第6葉期-抽穗結(jié)實期葉片為綠色；所述植物為水稻；
[0021]所述水稻具體為粳稻或秈稻。
[0022]上述DNA分子(即為突變基因mGRY79)在輔助鑒定待測植株是否為黃化轉(zhuǎn)綠植株中的應用。 [0023]上述應用為檢測待測植株的基因組DNA或cDNA，若待測植株的基因組中含有上述DNA分子中I)所示的DNA分子(突變基因mGRY79的基因組DNA)或待測植株的cDNA中含有上述DNA分子中2)所示的DNA分子(突變基因mGRY79的cDNA)，則待測植株為或候選為黃化轉(zhuǎn)綠植株，若待測植株的基因組中不含有上述DNA分子中I)所示的DNA分子或待測植株的cDNA中不含有上述DNA分子中2)所示的DNA分子，則待測植株不為或候選不為黃化轉(zhuǎn)綠植株；
[0024]所述黃化轉(zhuǎn)綠性狀為植物在I葉期-3葉期葉片呈黃綠色，從4葉期開始葉片逐漸轉(zhuǎn)綠，且在第6葉期-抽穗結(jié)實期葉片為綠色；所述植物為水稻；
[0025]所述水稻具體為粳稻或秈稻。
[0026]本發(fā)明的另一個目的是提供一種蛋白。
[0027]本發(fā)明提供的蛋白，是如下(a)或(b):
[0028](a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0029](b)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物葉綠素含量相關(guān)的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
[0030]上述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0031]編碼上述蛋白的DNA分子(GRY79基因)也是本發(fā)明保護的范圍。
[0032]所述DNA分子(GRY79基因)具體是如下I) _4)中任一種的DNA分子:
[0033]I)編碼區(qū)為序列表中序列2自5’末端第10-2625位核苷酸所示的DNA分子所示的DNA分子；
[0034]2)編碼區(qū)為序列表中序列I自5’末端第10-7501位核苷酸所示的DNA分子；
[0035]3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子;
[0036]4)與I)或2)限定的DNA序列至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
[0037]上述嚴格條件為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65 °C下雜交，然后用2 X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0038]含有上述DNA分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也是本發(fā)明保護的范圍。
[0039]上述重組載體為將上述DNA分子插入表達載體中，得到表達上述蛋白的重組載體；具體為將序列表中序列2自5’末端第10-2625位所不的核苷酸插入表達載體PCAMBIA2300的XbaI和SalI酶切位點間得到的載體。[0040]上述蛋白、上述DNA分子或上述重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在使具有黃化轉(zhuǎn)綠性狀的植物恢復為具有綠化性狀的植物中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；
[0041]所述黃化轉(zhuǎn)綠性狀為植物在I葉期-3葉期葉片呈黃綠色，從4葉期開始葉片逐漸轉(zhuǎn)綠，且在第6葉期-抽穗結(jié)實期葉片為綠色；
[0042]所述綠化性狀為植物在I葉期-抽穗結(jié)實期葉片均為綠色；
[0043]或上述蛋白、上述DNA分子或上述重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在調(diào)控植物I葉期或2葉期或3葉期葉片葉綠素含量中的應用；
[0044]上述調(diào)控植物葉綠素含量為提高植物葉綠素含量。
[0045]所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻，所述水稻尤其具體為粳稻或秈稻。
[0046]本發(fā)明第三個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0047]本發(fā)明提供的方法，為將編碼上述蛋白的DNA分子導入具有黃化轉(zhuǎn)綠性狀的目的植物中，得到具有綠化性狀的轉(zhuǎn)基因植物；
[0048]所述轉(zhuǎn)基因植物在3葉期葉片的葉綠素含量高于所述目的植物；
[0049]所述編碼上述蛋白的 DNA分子具體通過上述的重組載體導入所述目的植物中；
[0050]所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻，所述水稻尤其具體為粳稻或秈稻。所述目的植物為水稻突變體gry79。
[0051]本發(fā)明中黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79 (Oryza.sativa L.),于2014年I月14日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC N0.8769，分類命名為水稻(Oryza.sativa)。
[0052]擴增上述DNA分子全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護的范圍。
[0053]本發(fā)明的實驗證明，利用化學誘變獲得水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79，比較野生型和突變體，在野生型水稻發(fā)現(xiàn)一個新基因GRY79，在突變體中發(fā)現(xiàn)該基因?qū)钠渫蛔兓騧GRY79，突變基因mGRY79可作為葉色標記基因，用于雜交稻秧苗早期有效鑒定和高效去除假雜種，從而提高雜交稻的田間純度。新基因GRY79，將其導入利用化學誘變獲得水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79中，該突變體恢復綠色，且葉片中的葉綠素含量提高，因此說明該基因與葉綠素合成有關(guān)，調(diào)控葉片綠色。
【具體實施方式】
[0054]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0055]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0056]粳稻品系“l(fā)vpl”;公眾可從四川農(nóng)業(yè)大學獲得，記載過粳稻品系Ivpl的非專利文獻是:Sun CH, Fang J, Zhao TL, Xu B，Zhang FT, Liu LC, Tang JY, Zhang GF, Deng XJ, ChenF，Qian Q, Cao XF, Chu CC(2012)The histone methyItransferase SDG724mediatesH3K36me2/3deposition at MADS50and RFTland promotes flowering in rice.PlantCell24:3235-3247o
[0057]pCAMBIA2300 ;公眾可從四川農(nóng)業(yè)大學獲得，記載過pCAMBIA2300的非專利文獻是:Ding Y，Wang X，Su L, Zhai JX, Cao SY, Zhang DF, Liu CY, Bi YP, Qian, Cheng ZK, ChuCC, Cao XF(2007)SDG714, a histone H3K9methyltransferase, is involved in Tosl7DNAmethylation and transposition in rice.Plant Cell， 19:9—22。。
[0058]農(nóng)桿菌EHA105 ;公眾可從四川農(nóng)業(yè)大學獲得，記載過農(nóng)桿菌EHA105的非專利文獻是:Zhang ZH, Chen H, Huang XH, Xia R, Zhao QZ, Lai JB, Teng KL, Li Y, LiangLM, Du QS, Zhou XP, Guo HH, Xie Q.BSCTV C2Attenuates the degradation of SAMDCltosuppress DNA methyIat ion-mediated gene silencing in Arabidopsis.PlantCell,2011, 23:273 - 288。
[0059]實施例1、水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變基因mGRY79的發(fā)現(xiàn)及應用
[0060]1、黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79的獲得
[0061]利用EMS誘變處理粳稻品系Ivpl (以下也稱為野生型粳稻)，在其后代中獲得一個能夠穩(wěn)定遺傳的黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79 (green-revertible yellow79)。
[0062]該突變體在I葉期-3葉期葉片呈黃綠色，葉綠素含量降低，植株生長較緩慢，從4葉期開始逐漸轉(zhuǎn)綠，在第6葉期-抽穗結(jié)實期葉片均為綠色。
[0063]從上述看出，該突變體具有黃化轉(zhuǎn)綠性狀。
[0064]黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79 (Oryza.sativa L.),于2014年I月14日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJias:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC N0.8769，分類命名為水稻(Oryza.sativa)。
[0065]黃化轉(zhuǎn)綠性狀為植物在I葉期-3葉期葉片呈黃綠色，從4葉期開始葉片逐漸轉(zhuǎn)綠，且在第6葉期-抽穗結(jié)實期葉片為綠色。
[0066]2、突變基因mGRY79的發(fā)現(xiàn)
[0067]遺傳分析發(fā)現(xiàn)黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79受一對隱性核基因控制。通過圖位克隆、測序，發(fā)現(xiàn)粳稻品系Ivpl和黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79的基因L0C_0s02g33610不同，將粳稻品系Ivpl 中基因 L0C_0s02g33610 命名為 GRY79。
[0068]GRY79位于水稻第2染色體長臂上，其基因組DNA的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第10-7501位，其cDNA序列為序列表中序列2自5’末端第10-2625位，DNA和cDNA序列長度分別為7492bp和2616bp，編碼的蛋白命名為GRY79，其氨基酸序列為序列表中序列3所示。蛋白GRY79的氨基酸序列由871個氨基酸殘基組成，分子量約為96kD。
[0069]黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79中，GRY79基因突變?yōu)閙GRY79基因，mGRY79的基因組DNA的序列為序列A自5’末端第10-7501位，序列A為將序列表中序列I自5’末端第4218位堿基C突變?yōu)門得到的序列；mGRY79的cDNA序列為序列B自5’末端第10-2625位，序列B為將序列表中序列2自5’末端第1169位堿基C突變?yōu)門 ；mGRY79基因編碼的蛋白的氨基酸序列為僅將序列表中序列3的第387位絲氨基(Ser)變?yōu)楸奖彼?Phe)，其他氨基酸殘基與序列3相同。
[0070]3、黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79或突變基因mGRY79在培育具有黃化轉(zhuǎn)綠性狀水稻雄性不育系中的應用
[0071]I)培育具有黃化轉(zhuǎn)綠性狀水稻雄性不育系
[0072]按照常規(guī)的培育方法，黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79可以與生產(chǎn)上的雜交水稻不育系(特別是培育兩系雜交稻的光溫敏核不育系)雜交和/或回交，培育出具有黃化轉(zhuǎn)綠性狀的新不育系。
[0073]2)鑒定或輔助鑒定待測植株是否為黃化轉(zhuǎn)綠植株[0074]將黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79與其野生型粳稻品系Ivpl進行比較:
[0075]通過測序基因組DNA，可以看出基因水平上二者僅mGRY79基因和GRY79基因的區(qū)別；
[0076]通過觀察葉片,可以看出黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79在I葉期_3葉期葉片呈黃綠色，從4葉期開始逐漸轉(zhuǎn)綠，在第6葉期-抽穗結(jié)實期葉片均為綠色；野生型粳稻品系Ivpl自始至終的葉片均為綠色；
[0077]農(nóng)藝性狀表型:在成熟期，與野生型粳稻Ivpl相比，黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79除每株有效穗數(shù)降低15%外，其它主要農(nóng)藝性狀與野生型沒有顯著差異。
[0078]因此，黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79中的突變基因mGRY79可以用來鑒定或輔助鑒定待測植株是否為黃化轉(zhuǎn)綠植株；檢測待測植株的基因組DNA，若待測植株的基因組中含有突變基因mGRY79，則待測植株為或候選為黃化轉(zhuǎn)綠植株，若待測植株的基因組中不含有突變基因mGRY79，則待測植株不為或候選不為黃化轉(zhuǎn)綠植株。
[0079]實施例2、水稻基因GRY79的獲得及功能驗證
[0080]一、水稻基因GRY79的克隆
[0081]合成下述引物對:[0082]Pl:5/ CCGTCTAGAATGGTGGCGCTCGCCTCC3'(下劃線為 Xba I 酶切位點)
[0083]P2:5/ GCCGTCGACTCATTGGGTTGCCATTTC3'(下劃線為 Sal I 酶切位點)
[0084]從正常綠色粳稻品系Ivpl葉片提取RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為cDNA,用引物Pl和P2進行RT-PCR擴增，得到約2500bp的片段，將該片段連接在pMD_19_T載體上，得到連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109菌株中，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒送去測序。
[0085]測序結(jié)果表明:擴增的片段具有序列表中序列2自5’末端第10-2625位核苷酸所示的序列，擴增的片段為基因GRY79，其開放閱讀框為序列表中序列2自5’末端第10-2625位，該基因編碼的蛋白GRY79的氣基酸序列為序列表中序列3。
[0086]將含有該片段的質(zhì)粒命名為PMD-GRY79-1，該質(zhì)粒為將序列表中序列2自5’末端第10-2625位所示的核苷酸插入pMD-19-T載體上得到的載體。
[0087]二、水稻基因GRY79的功能驗證
[0088]1、表達載體的構(gòu)建
[0089]將上述一得到的質(zhì)粒pMD-GRY79-l，用XbaI和SalI雙酶切，回收2616bp的酶切片段，將該酶切片段與經(jīng)過同樣雙酶切的含有來自水稻的actl啟動子的表達載體PCAMBIA2300的10379bp的骨架連接，得到重組載體。
[0090]將重組載體經(jīng)XbaI和SalI雙酶切驗證，得到2616bp的為陽性。
[0091]再將酶切陽性的重組載體送去測序，結(jié)果，該重組載體為將序列表中序列2自5’末端第10-2625位所示的核苷酸插入表達載體pCAMBIA2300的XbaI和SalI酶切位點間得到的載體，為轉(zhuǎn)基因重組表達載體，命名為PCAMBIA2300-GRY79。
[0092]2、轉(zhuǎn)GRY79水稻的獲得
[0093]將上述I得到的重組載體pCAMBIA2300-GRY79轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，得到重組農(nóng)桿菌 EHA105/pCAMBIA2300-GRY79。
[0094]提取重組農(nóng)桿菌的質(zhì)粒送去測序，該質(zhì)粒為pCAMBIA2300-GRY79，證明該重組農(nóng)桿菌為陽性。[0095]將重組農(nóng)桿菌EHA105/pCAMBIA2300-GRY79轉(zhuǎn)入水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79成熟種子去殼后誘導愈傷組織中，重組農(nóng)桿菌EHA105/pCAMBIA2300-GRY79與所獲愈傷組織共培養(yǎng)以進行轉(zhuǎn)化，然后，經(jīng)過洗菌、篩選、分化、生根、煉苗、移栽大田等步驟，得到轉(zhuǎn)GRY79水稻。
[0096]分單株提取轉(zhuǎn)GRY79水稻的葉片DNA作模板進行PCR擴±曾，引物為5' -CAGGACTTACCTTGATGC-3'和 5' -ACGACGGCCAGTGCCAAG-3'(分別位于前述重組載體PCAMBIA2300-GRY79中的GRY79基因序列和載體本身序列上)，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，得到大小為1918bp條帶的為陽性轉(zhuǎn)GRY79水稻，共獲得22株陽性轉(zhuǎn)GRY79水稻。
[0097]3、轉(zhuǎn)GRY79水稻的表型研究
[0098]將陽性轉(zhuǎn)GRY79水稻、野生型粳稻Ivpl和突變體gry79收獲的種子在正常生長條件下分別播種，培養(yǎng)。實驗重復三次，每個陽性轉(zhuǎn)GRY79株系以及對照材料(Ivpl和gry79)每次重復20苗，結(jié)果取平均值。
[0099]1)表型觀察
[0100]持續(xù)觀察陽性轉(zhuǎn)GRY79水稻、野生型粳稻Ivpl和突變體gry79的葉片表型。
[0101]結(jié)果突變體gry79幼苗在I葉期_3葉期葉片呈黃綠色；而陽性轉(zhuǎn)GRY79水稻幼苗在I葉期-3葉期葉片恢復到與野生型粳稻Ivpl的葉片顏色一致，均為綠色。陽性轉(zhuǎn)GRY79水稻幼苗在4葉期-抽穗結(jié)實期葉片也均為綠色。
[0102]2)葉綠素含量的檢測
[0103]在三葉期取陽性轉(zhuǎn)GRY79水稻、野生型粳稻Ivpl和突變體gry79幼苗的葉片，每個材料用電子天平稱取0.2克并剪碎，用80%丙酮于4°C黑暗條件下浸提2天，將浸提液轉(zhuǎn)入25mL容量瓶定容，然后用UV-1700型(SHIMADZU)分光光度計分別在663nm、646nm和470nm波長下測定吸光值，每份樣品重復3次，取平均值計算葉綠素的含量，記載過上述檢測葉綠素含量的具體方法以及計算公式的非專利文獻是:王平榮，王兵，孫小秋，孫昌輝，萬春美，馬曉智，鄧曉建(2013)水稻白化轉(zhuǎn)綠基因gra75的精細定位和生理特性分析.中國農(nóng)業(yè)科學，46 (2): 225-232。
[0104]結(jié)果如下:
[0105]突變體gry79幼苗的葉片中葉綠素含量為每克葉片(鮮重)0.63mg ；
[0106]陽性轉(zhuǎn)GRY79水稻幼苗的葉片中葉綠素含量為每克葉片(鮮重)3.04mg ；
[0107]野生型粳稻Ivpl的葉片中葉綠素含量為每克葉片(鮮重)3.34mg。
[0108]葉綠素含量為葉綠素a含量+葉綠素b含量。
[0109]可以看出，陽性轉(zhuǎn)GRY79水稻幼苗在三葉期葉片葉綠素含量也與野生型相近，表明該突變體表型得到恢復。
[0110]因此，GRY79基因可以使含有mGRY79突變基因的水稻葉片在I葉期-三葉期恢復為綠色，且可以提高葉綠素含量。
【權(quán)利要求】
1.一種DNA分子，是如下I) -4)中任一種的DNA分子: 1)編碼區(qū)為序列A自5’末端第10-7501位所示的DNA分子，所述序列A為將序列表中序列I自5’末端第4218位堿基C突變?yōu)門得到的序列； 2)編碼區(qū)為序列B自5’末端第10-2625位，所述序列B為將序列表中序列2自5’末端第1169位堿基C突變?yōu)門 ; 3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子； 4)與I)或2)限定的DNA序列至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
2.水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79，其保藏號為CGMCCN0.8769。
3.權(quán)利要求1所述的DNA分子或權(quán)利要求2所述的水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79在培育具有黃化轉(zhuǎn)綠性狀水稻雄性不育系中的應用； 所述黃化轉(zhuǎn)綠性狀為植物在I葉期-3葉期葉片呈黃綠色，從4葉期開始葉片逐漸轉(zhuǎn)綠，且在第6葉期-抽穗結(jié)實期葉片為綠色；所述植物為水稻； 所述水稻具體為粳稻或秈稻。
4.權(quán)利要求1所述DNA分子在輔助鑒定待測植株是否為黃化轉(zhuǎn)綠植株中的應用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于:所述應用為檢測待測植株的基因組DNA或cDNA，若待測植株的基因組中含有權(quán)利要求1所述DNA分子中I)所示的DNA分子或待測植株的cDNA中含有權(quán)利要求1所述DNA分子中2)所示的DNA分子，則待測植株為或候選為黃化轉(zhuǎn)綠植株，若待測植株的基因組中不含有權(quán)利要求1所述DNA分子中I)所示的DNA分子或待測植株的cDNA中不含有權(quán)利要求1所述DNA分子中2)所示的DNA分子，則待測植株不為或候選不為黃化轉(zhuǎn)綠植株； 所述黃化轉(zhuǎn)綠性狀為植物在I葉期-3葉期葉片呈黃綠色，從4葉期開始葉片逐漸轉(zhuǎn)綠，且在第6葉期-抽穗結(jié)實期葉片為綠色；所述植物為水稻； 所述水稻具體為粳稻或秈稻。
6.一種蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物葉綠素含量相關(guān)的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
7.編碼權(quán)利要求6所述蛋白的DNA分子； 所述DNA分子具體是如下I) -4)中任一種的DNA分子: 1)編碼區(qū)為序列表中序列2自5’末端第10-2625位核苷酸所示的DNA分子所示的DNA分子; 2)編碼區(qū)為序列表中序列I自5’末端第10-7501位核苷酸所示的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子； 4)與I)或2)限定的DNA序列至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
8.含有權(quán)利要求7所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
9.權(quán)利要求6所述蛋白、權(quán)利要求7所述DNA分子或權(quán)利要求8所述重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在使具有黃化轉(zhuǎn)綠性狀的植物恢復為具有綠化性狀的植物中的應用； 所述黃化轉(zhuǎn)綠性狀為植物在I葉期-3葉期葉片呈黃綠色，從4葉期開始葉片逐漸轉(zhuǎn)綠，且在第6葉期-抽穗結(jié)實期葉片為綠色； 所述綠化性狀為植物在I葉期-抽穗結(jié)實期葉片均為綠色； 或權(quán)利要求6所述蛋白、權(quán)利要求7所述DNA分子或權(quán)利要求8所述重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在調(diào)控植物在I葉期或2葉期或3葉期葉片葉綠素含量中的應用； 所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻，所述水稻尤其具體為粳稻或秈稻。
10.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將編碼權(quán)利要求6所述蛋白的DNA分子導入具有黃化轉(zhuǎn)綠性狀的目的植物中，得到具有綠化性狀的轉(zhuǎn)基因植物； 所述轉(zhuǎn)基因植物在3葉期葉片的葉綠素含量高于所述目的植物； 所述編碼權(quán)利要求6所述蛋白的DNA分子具體通過權(quán)利要求8所述的重組載體導入所述目的植物中； 所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻，所述水稻尤其具體為粳稻或秈稻。
【文檔編號】A01H1/02GK103740732SQ201410017382
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】鄧曉建, 萬春美, 王平榮, 馬曉智, 李春梅, 王洋, 孫昌輝, 徐正君, 朱建清, 高曉玲 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學