一種峨眉雙蝴蝶的種子繁殖技術的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種組織培養(yǎng)式峨眉雙蝴蝶的種子繁殖方法，該方法包括（1）幼苗的獲得和培養(yǎng)；（2）生根培養(yǎng)；（3）煉苗移栽。本發(fā)明采用組培的方式進行峨眉雙蝴蝶的人工育苗更有利于苗種的規(guī)?；藴驶凸S化生產，同時提高了出芽的整齊度和成活率；本發(fā)明采用種子連同胎座一起進行培養(yǎng)的新技術，種子發(fā)芽率在99%以上，并且出芽非常整齊和一致，從接種到苗高5厘米，4-5片葉只要4-5個月，成苗率可達90%以上。
【專利說明】一種峨眉雙蝴蝶的種子繁殖技術
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種采用組織培養(yǎng)的器材和方法進行蛾眉雙蝴蝶種子繁殖的方法。
【背景技術】
[0002]龍膽科植物蛾眉雙蝴蝶，喜陰暗潮濕，常生于海拔500~600米的山坡茶樹林下和灌叢中，其葉、莖、根均可入藥，具清肺止咳、止血、解毒、散結的功效，用于肺結核、咯血、肺膿瘍、療癤瘡毒、支氣管炎、敗毒抗癌等都有很好的效果。
[0003]蛾眉雙蝴蝶屬大宗常用中藥材，是百余種中藥的主要原料，《本草綱目》中的正品。但因多年來土地開墾，畜牧業(yè)發(fā)展，及過度采伐等原因，使其資源遭到嚴重破壞，其產量由過去的26.7萬公斤下降到10.75萬公斤，市場價也由每公斤1.7元上升到每公斤28-35元，89年已被國家醫(yī)藥部門列入重點發(fā)展和保護品種，多年來因蛾眉雙蝴蝶繁殖難度大和生長條件的限制一直未發(fā)展成大規(guī)模人工生產。近幾年來隨著醫(yī)藥需求量增加，也只能少部分地方小面積栽培。[0004]蛾眉黃蝴蝶的種子微小，近黑色，橢圓形，長約2mm,寬1.2-0.3mm,每年國慶節(jié)前后開始開花，果實至元月底前后成熟，果實長，種子千粒重0.95g，自然條件下發(fā)芽時間長，極不整齊，發(fā)芽率很低，發(fā)芽率約1%，發(fā)芽后6個月長不出完全的真葉。我們用河沙、珍珠巖、加原產地土壤做了 3年種子繁殖試驗，最后沒有得到一株苗，說明自然條件下蛾眉雙蝴蝶的種子繁殖很難，它有一個非常明顯的無效幼苗期，制約著蛾眉雙蝴蝶大規(guī)模人工生產。
[0005]因此，為了保護和發(fā)展雙蝴蝶屬的野生資源，為其人工栽培提供足量的苗木，開發(fā)高效、實用的蛾眉雙蝴蝶種子繁殖技術是十分必要的。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術問題就是針對蛾眉雙蝴蝶在自然條件下發(fā)芽率低、發(fā)芽后生長周期長、成苗率低的缺陷，建立一種高效、實用的蛾眉雙蝴蝶種子繁殖方法，為蛾眉雙蝴蝶人工栽培提供大量苗木。
[0007]本發(fā)明包括以下幾個步驟:
(O幼苗的獲得和培養(yǎng):每年12月至次年2月采集蛾眉雙蝴蝶莖上飽滿無病蟲危害的紫紅色果實，先用自來水洗凈，后用飽和洗衣粉溶液漂洗5-6分鐘，再用自來水流水沖洗20-30分鐘，濾干水，放在干凈組培瓶中帶入無菌室，在超凈工作臺上用75%的乙醇浸50-60秒后，轉入0.1%的升汞溶液中浸泡16-20分鐘，其間不斷地搖動，以便充分殺菌。
[0008]升汞溶液滅菌后，用無菌水反復沖洗，打開干燥的無菌濾紙本，夾于濾紙本中。打開濾紙本用無菌解剖刀和鑷子，剝除紫紅色外果皮，露出白色棒狀的胎座，用刀輕輕將胎座縱向切開，露出芝麻大小紫黑色的種子，種子在胎座內縱向排列成4行，用刀沿種子排列的縱縫，將胎座連同種子切成4條，每條胎座都有一定數量的種子。用鑷子將胎座放在萌發(fā)培養(yǎng)基上，蓋上瓶蓋，并用封口膜加強，防止瓶內水分揮發(fā)和雜菌感染。
[0009]所述萌發(fā)培養(yǎng)基的優(yōu)選配方為:l/2MS+20%香蕉提取液+6-BA2.0mg.L_1+NAA0.2mg.L_1+2% 鹿糖 + 瓊脂 6g.L'
[0010]22-28°C條件下，暗培養(yǎng)至種子萌發(fā)，萌發(fā)后每天給予1500-2500LX光照，直至分化長出幼小真葉。一般情況下，種子約20天發(fā)芽，約30天子葉完全展開，形成有兩片子葉的無菌蛾眉雙蝴蝶幼苗，發(fā)芽率99%以上，約50天分化出兩片幼小真葉。
(2)生根培養(yǎng):當有幼小真葉分化出來時，將小苗連同胎座整塊取出，放在打開的無菌濾紙本中，用鑷子和小刀把小苗互相分開，接種于生根壯苗培養(yǎng)基上，蓋上瓶蓋，并用封口膜加強，防止瓶內水分揮發(fā)和雜菌感染。22-28°C，每天1500-2500LX光強照射10-20小時，培養(yǎng)至苗高4-5厘米并有4-5片真葉。
[0011]所述生根壯苗培養(yǎng)基的優(yōu)選配方為:花寶3號3g.1^+20%香蕉提取液+IBA0.2mg.L—1+活性碳2g.1^+2%蔗糖+瓊脂6g.L—1，花寶3號是指美國進口速效復合肥，氮、磷、鉀三要素含量比例分別為10: 30: 20。
[0012]培養(yǎng)過程中，10-15天可見根系大量發(fā)生，50-70天可長出4_5片真葉，苗高
4.5-5.5 厘米。
[0013](3)煉苗移栽:當苗高4-5厘米、有4-5片真葉時進行練苗移栽，先在蔭蔽度70-80%的塑料大棚內閉瓶煉苗4-5天，再將瓶蓋完全旋松，但不拿開，煉苗兩天，再開瓶煉苗兩天，然后將苗從瓶中取出，用水將根部培養(yǎng)基洗干凈，栽于裝有蛭石:紅壤土:細河沙的塑料袋中，每袋栽一株，其中蛭石、紅壤土和細河沙的比例為1:2:2，并事先用高錳酸鉀水溶液處理。
[0014]栽好后用0. 2%-0.3%的花寶3號水溶液噴霧，洗凈植株表面，并使基質下沉，緊密與根接觸，基質含水量達到55-60%，再放在表面鋪有粗砂的塑料大棚內，大棚內做40-50公分高的支架，上面覆蓋農膜，使植株置于農膜的下面。覆蓋農膜48小時內，膜內空氣相對濕度控制在90%，溫度25-30°C，過高時揭膜調溫調濕，以后逐漸降低空氣相對濕度，15天后降低到70%，此時去掉農膜繼續(xù)煉苗20-40天，即可起苗定植。
[0015]本發(fā)明的特點是采用組織培養(yǎng)的方式對蛾眉雙蝴蝶進行種子繁殖育苗，特別是將種子連同胎座共同置于培養(yǎng)基上進行出苗的方式，克服了蛾眉雙蝴蝶種子出芽非常不整齊，成活率低的缺陷，使得本發(fā)明在蛾眉雙蝴蝶的育苗過程中具有十分重要的實用價值，本發(fā)明同時也有利于發(fā)展和保護蛾眉雙蝴蝶這一重要中草藥植物。
[0016]采用組培的方法，將種子連同胎座共同置于培養(yǎng)基上進行出苗可以克服蛾眉雙蝴蝶自然繁殖狀態(tài)下種子出芽非常不整齊，成活率低的缺陷的原因，我們經研究和分析，原因很可能是:在自然狀態(tài)下，由于胎座很快壞死和脫落，并且無法吸收培養(yǎng)基中的養(yǎng)分，因而無法產生某種植物激素，這種植物激素能夠使蛾眉雙蝴蝶種子出芽整齊，成活率提高；而在本發(fā)明的人工條件下，其胎座可以吸收培養(yǎng)基中的養(yǎng)分，從而向種子分離植物激素，使種子出芽整齊，成活率提高。
[0017]與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:采用組培的方式進行蛾眉雙蝴蝶的人工育苗更有利于苗種的規(guī)模化、標準化和工廠化生產，同時提高了出芽的整齊度和成活率。采用本技術，種子發(fā)芽率在99%以上，并且出芽非常整齊和一致，從接種到苗高5厘米，4-5片葉只要4-5個月，成苗率可達90%以上。
【具體實施方式】[0018]以下對蛾眉雙蝴蝶的種子繁殖方法進行詳細說明。
[0019]實施例1:
(O幼苗的獲得和培養(yǎng):12月22日采集蛾眉雙蝴蝶莖上飽滿無病蟲危害的紫紅色果實，先用自來水洗凈，后用飽和洗衣粉溶液漂洗5.8分鐘，再用自來水流水沖洗22分鐘，濾干水，放在干凈組培瓶中帶入無菌室，在超凈工作臺上用75%的乙醇浸52秒后，轉入0.1%的升汞溶液中浸泡17分鐘，其間不斷地搖動，以便充分殺菌；
升汞溶液滅菌后，用無菌水反復沖洗，打開干燥的無菌濾紙本，夾于濾紙本中，打開濾紙本用無菌解剖刀和鑷子，剝除紫紅色外果皮，露出白色棒狀的胎座，用刀輕輕將胎座縱向切開，露出芝麻大小紫黑色的種子，種子在胎座內縱向排列成4行，用刀沿種子排列的縱縫，將胎座連同種子切成4條，每條胎座都有一定數量的種子；用鑷子將胎座放在萌發(fā)培養(yǎng)基上，蓋上瓶蓋，并用封口膜加強，25°C條件下，暗培養(yǎng)至種子萌發(fā)，萌發(fā)后每天給予1600LX光照，直至分化長出幼小真葉；
(2)生根培養(yǎng):當有幼小真葉分化出來時，將小苗連同胎座整塊取出，放在打開的無菌濾紙本中，用鑷子和小刀把小苗互相分開，接種于生根壯苗培養(yǎng)基上，蓋上瓶蓋，并用封口膜加強，230C，每天1800LX光強照射12小時，培養(yǎng)至苗高4_5厘米并有4_5片真葉；
(3)煉苗移栽:先在蔭蔽度72%的塑料大棚內閉瓶煉苗4.5天，再將瓶蓋完全旋松，但不拿開，煉苗兩天，再開瓶煉苗兩天，然后將苗從瓶中取出，用水將根部培養(yǎng)基洗干凈，栽于裝有蛭石:紅壤土:細河沙的塑料袋中，每袋栽一株，其中蛭石、紅壤土和細河沙的比例為1:2:2，并事先用高錳酸鉀水溶液處理；
栽好后用0.21%的花寶3號水溶液噴霧，洗凈植株表面，并使基質下沉，緊密與根接觸，基質含水量達到57%，再放在表面鋪有粗砂的塑料大棚內，大棚內做43公分高的支架，上面覆蓋農膜，使植株置于農膜的下面，覆蓋農`膜48小時內，膜內空氣相對濕度控制在90%，溫度26°C，過高時揭膜調溫調濕，以后逐漸降低空氣相對濕度，15天后降低到70%，此時去掉農膜繼續(xù)煉苗25天，即可起苗定植。
[0020]本實施例中生根壯苗培養(yǎng)基的配方為花寶3號3g.1^+20%香蕉提取液+ΙΒΑ0.2mg.L—1+活性碳2g.L^+2%蔗糖+瓊脂6g.L—1 ;萌發(fā)培養(yǎng)基配方為l/2MS+20%香蕉提取液 +6-BA2.0mg.L^+NAA0.2mg.U1+2% 鹿糖 + 瓊脂 6g.L'
[0021]實施例2:
(1)幼苗的獲得和培養(yǎng):1月16日采集蛾眉雙蝴蝶莖上飽滿無病蟲危害的紫紅色果實，先用自來水洗凈，后用飽和洗衣粉溶液漂洗5.2分鐘，再用自來水流水沖洗27分鐘，濾干水，放在干凈組培瓶中帶入無菌室，在超凈工作臺上用75%的乙醇浸59秒后，轉入0.1%的升汞溶液中浸泡19分鐘，其間不斷地搖動，以便充分殺菌；
升汞溶液滅菌后，用無菌水反復沖洗，打開干燥的無菌濾紙本，夾于濾紙本中，打開濾紙本用無菌解剖刀和鑷子，剝除紫紅色外果皮，露出白色棒狀的胎座，用刀輕輕將胎座縱向切開，露出芝麻大小紫黑色的種子，種子在胎座內縱向排列成4行，用刀沿種子排列的縱縫，將胎座連同種子切成4條，每條胎座都有一定數量的種子；用鑷子將胎座放在萌發(fā)培養(yǎng)基上，蓋上瓶蓋，并用封口膜加強，27°C條件下，暗培養(yǎng)至種子萌發(fā)，萌發(fā)后每天給予2300LX光照，直至分化長出幼小真葉；
(2)生根培養(yǎng):當有幼小真葉分化出來時，將小苗連同胎座整塊取出，放在打開的無菌濾紙本中，用鑷子和小刀把小苗互相分開，接種于生根壯苗培養(yǎng)基上，蓋上瓶蓋，并用封口膜加強，260C，每天2400LX光強照射17小時，培養(yǎng)至苗高4_5厘米并有4_5片真葉；
(3)煉苗移栽:先在蔭蔽度79%的塑料大棚內閉瓶煉苗4.8天，再將瓶蓋完全旋松，但不拿開，煉苗兩天，再開瓶煉苗兩天，然后將苗從瓶中取出，用水將根部培養(yǎng)基洗干凈，栽于裝有蛭石:紅壤土:細河沙的塑料袋中，每袋栽一株，其中蛭石、紅壤土和細河沙的比例為1:2:2，并事先用高錳酸鉀水溶液處理；
栽好后用0.27%的花寶3號水溶液噴霧，洗凈植株表面，并使基質下沉，緊密與根接觸，基質含水量達到59%，再放在表面鋪有粗砂的塑料大棚內，大棚內做48公分高的支架，上面覆蓋農膜，使植株置于農膜的下面，覆蓋農膜48小時內，膜內空氣相對濕度控制在90%，溫度28°C，過高時揭膜調溫調濕，以后逐漸降低空氣相對濕度，15天后降低到70%，此時去掉農膜繼續(xù)煉苗34天，即可起`苗定植。
【權利要求】
1.一種蛾眉雙蝴蝶的種子繁殖方法，其特征在于包含以下幾個步驟: (O幼苗的獲得和培養(yǎng):每年12月至次年2月采集蛾眉雙蝴蝶莖上飽滿無病蟲危害的紫紅色果實，先用自來水洗凈，后用飽和洗衣粉溶液漂洗5-6分鐘，再用自來水流水沖洗20-30分鐘，濾干水，放在干凈組培瓶中帶入無菌室，在超凈工作臺上用75%的乙醇浸50-60秒后，轉入0.1%的升汞溶液中浸泡16-20分鐘，其間不斷地搖動，以便充分殺菌； 升汞溶液滅菌后，用無菌水反復沖洗，打開干燥的無菌濾紙本，夾于濾紙本中，打開濾紙本用無菌解剖刀和鑷子，剝除紫紅色外果皮，露出白色棒狀的胎座，用刀輕輕將胎座縱向切開，露出芝麻大小紫黑色的種子，種子在胎座內縱向排列成4行，用刀沿種子排列的縱縫，將胎座連同種子切成4條，每條胎座都有一定數量的種子；用鑷子將胎座放在萌發(fā)培養(yǎng)基上，蓋上瓶蓋，并用封口膜加強，22-28°C條件下，暗培養(yǎng)至種子萌發(fā)，萌發(fā)后每天給予1500-2500LX光照，直至分化長出幼小真葉； (2)生根培養(yǎng):當有幼小真葉分化出來時，將小苗連同胎座整塊取出，放在打開的無菌濾紙本中，用鑷子和小刀把小苗互相分開，接種于生根壯苗培養(yǎng)基上，蓋上瓶蓋，并用封口膜加強，22-280C，每天1500-2500LX光強照射10-20小時，培養(yǎng)至苗高4_5厘米并有4_5片真葉； (3)煉苗移栽:先在蔭蔽度70-80%的塑料大棚內閉瓶煉苗4-5天，再將瓶蓋完全旋松，但不拿開，煉苗兩天，再開瓶煉苗兩天，然后將苗從瓶中取出，用水將根部培養(yǎng)基洗干凈，栽于裝有蛭石:紅壤土:細河沙的塑料袋中，每袋栽一株，其中蛭石、紅壤土和細河沙的比例為1:2:2，并事先用高錳酸鉀水溶液處理； 栽好后用0.2%-0.3%的花寶3號水溶液噴霧，洗凈植株表面，并使基質下沉，緊密與根接觸，基質含水量達到55-60%，再放在表面鋪有粗砂的塑料大棚內，大棚內做40-50公分高的支架，上面覆蓋農膜， 使植株置于農膜的下面，覆蓋農膜48小時內，膜內空氣相對濕度控制在90%，溫度25-30°C，過高時揭膜調溫調濕，以后逐漸降低空氣相對濕度，15天后降低到70%，此時去掉農膜繼續(xù)煉苗20-40天，即可起苗定植。
2.根據權利要求1所述蛾眉雙蝴蝶種子繁殖方法所述的萌發(fā)培養(yǎng)基，其特征在于:萌發(fā)培養(yǎng)基配方為l/2MS+20%香蕉提取液+6-BA2.0mg.L^+NAA0.2mg.L^+2%蔗糖+瓊脂6g.1/1。
3.根據權利要求1所述蛾眉雙蝴蝶種子繁殖方法所述的生根壯苗培養(yǎng)基，其特征在于:生根壯苗培養(yǎng)基的配方為花寶3號3g.1^+20%香蕉提取液+IBA0.2mg.L—1+活性碳2g.1^+2%蔗糖+瓊脂6g.L—1，花寶3號是指美國進口速效復合肥，氮、磷、鉀三要素含量比例分別為 10: 30: 20。
【文檔編號】A01H4/00GK103718964SQ201310725609
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月25日 優(yōu)先權日:2013年12月25日
【發(fā)明者】田宏現 申請人:吉首大學