誘導(dǎo)五倍體草莓染色體加倍的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種誘導(dǎo)草莓染色體加倍的方法，屬于植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法五倍體草莓離體莖尖并用秋水仙素溶液將離體莖尖浸泡；然后將獲得的所有五倍體材料進(jìn)行批量加倍，并結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)和染色數(shù)目計(jì)數(shù)法將加倍后獲得的材料進(jìn)行了鑒定，獲得了大量的十倍體材料。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，誘變時(shí)間較短，誘變率高，能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的十倍體材料，是一種實(shí)用、可行、高效的誘導(dǎo)加倍技術(shù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】誘導(dǎo)五倍體草莓染色體加倍的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于果樹(shù)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種使用秋水仙素誘導(dǎo)草莓染色體加倍的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用野生草莓來(lái)改良現(xiàn)有栽培草莓的品種，將野生草莓與栽培草莓品種結(jié)合，以期使栽培草莓獲得野生草莓在抗性、硬度和品質(zhì)等方面的優(yōu)良性狀， 該研究方向已是一種趨勢(shì)和方向。野生草莓資源在抗性、芳香味和果實(shí)硬度等方面具有優(yōu)良的育種價(jià)值，野生草莓資源具有非常巨大的潛在價(jià)值。
[0003]野生五倍體和通過(guò)種間雜交獲得的五倍體在生物遺傳上表現(xiàn)出育性差或不育，要解決該問(wèn)題需要通過(guò)染色體加倍的方法，使其成為十倍體，并具有育性良好、容易結(jié)實(shí)，抗寒、抗病等優(yōu)良抗性性狀， 同時(shí)能夠具有在植株形態(tài)、花期、花粉活力較五倍體的大、長(zhǎng)、高等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題提供一種誘導(dǎo)五倍體草莓染色體加倍的方法，該方法通過(guò)秋水仙素水溶液加倍五倍體草莓以獲得十倍體草莓。
[0005]本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0006]一種誘導(dǎo)五倍體草莓染色體加倍的方法，該方法包括以下步驟:
[0007]I)將五倍體草莓叢生芽的離體莖尖經(jīng)無(wú)菌水沖洗后放入秋水仙素溶液中浸泡，所述的秋水仙素溶液為無(wú)菌溶液；
[0008]2)將經(jīng)步驟I)浸泡后的離體莖尖和秋水仙素溶液密封避光，并放入溫度為25 °C ±1°C的振蕩器中振蕩；
[0009]3)取出經(jīng)步驟2)處理后的離體莖尖，經(jīng)無(wú)菌水沖洗后接種于MS+6.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖的培養(yǎng)基中，在溫度為25°C ±1°C，LED燈照射條件下培養(yǎng)25~30d得到成活的莖尖；
[0010]4)將步驟3)成活的莖尖接種于MS+1.0mg/L6-BA+6.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖的培養(yǎng)基中25~30d。
[0011]所述步驟I)的五倍體草莓為二倍體野生草莓和八倍體栽培草莓雜交得到五倍體草莓叢生芽或野生五倍體草莓叢生芽。所述步驟I)的五倍體草莓叢生芽的離體莖尖長(zhǎng)度為 0.5 ~0.8cm。
[0012]所述步驟I)的秋水仙素溶液濃度為1.0~7.0mg/mL,優(yōu)選濃度為1.0mg/mL ;步驟O的浸泡時(shí)間為24~72h，優(yōu)選為48h。
[0013]所述步驟2)的振蕩器的轉(zhuǎn)速為100~120rpm，振蕩器的振蕩時(shí)間為24~72h，優(yōu)選為48h。
[0014]所述步驟3)LED燈的光照強(qiáng)度為1500~20001ux，優(yōu)選步驟3)離體莖每天在LED燈下光照16h。
[0015]所述步驟2)和步驟4)的操作步驟均在無(wú)菌的條件下完成，所述的無(wú)菌條件下完成是在開(kāi)著紫外燈的超凈工作臺(tái)上完成，此外，紫外燈需提前連續(xù)開(kāi)24h。
[0016]二倍體野生草莓和八倍體栽培草莓雜交得到五倍體草莓叢生芽或野生五倍體草莓叢生芽是將長(zhǎng)勢(shì)好，整齊，粗壯的組培苗在配方為MS+1.0mg/L6-BA+6.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖或MS+1.0mg/L6-BA+0.lmg/L NAA+6.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)以獲得大量的叢生芽。
[0017]步驟2)采用的秋水仙素溶 液為經(jīng)0.22 μ m水系微孔濾膜兩次過(guò)濾后的無(wú)菌溶液。
[0018]本發(fā)明的有益效果
[0019]1.采用本發(fā)明方法誘導(dǎo)五倍體草莓染色體加倍的操作步驟簡(jiǎn)單，不需要將秋水仙素加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行誘變，減輕了秋水仙素持續(xù)毒害作用，提高了誘變效率，同時(shí)，工作量較?。?br> [0020]2.采用本發(fā)明方法誘變時(shí)間短，誘變率高，能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的十倍體植株，
[0021]誘變率能達(dá)42.22%。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1A為流式細(xì)胞儀檢測(cè)五倍體草莓葉片相對(duì)DNA含量分布圖，圖1B為流式細(xì)胞儀檢測(cè)十倍體草莓葉片相對(duì)DNA含量分布圖。
[0023]圖2A為五倍體草莓染色體數(shù)目計(jì)數(shù)法檢測(cè)草莓有絲分裂中期染色體數(shù)目圖，圖2B為十倍體草莓染色體數(shù)目計(jì)數(shù)法檢測(cè)草莓有絲分裂中期染色體數(shù)目圖。
[0024]圖3A為五倍體草莓形態(tài)圖，圖3B為十倍體草莓形態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此:
[0026]實(shí)施例1
[0027]第一步:選取長(zhǎng)勢(shì)好，整齊，粗壯的野生五倍體草莓組培苗在配方為MS+1.0mg/L6-BA+6.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)以獲得大量的叢生芽以供選取離體莖尖用；
[0028]第二步:獲得叢生芽后，在超凈工作臺(tái)上(需提前連續(xù)開(kāi)24h紫外)選取0.5cm離體莖尖，先將其放入無(wú)菌水中，沖洗掉培養(yǎng)基殘留物和雜質(zhì)；接著，將其放入經(jīng)0.22 μ m水系微孔濾膜兩次過(guò)濾后獲得的無(wú)菌秋水仙素溶液中浸泡48h，該無(wú)菌秋水仙素溶液濃度為1.0mg/mL ；
[0029]第三步:將第二步中將裝有離體莖尖和秋水仙素水溶液用封口膜和橡皮筋進(jìn)行封口，保證其與外界隔離。將其在溫度為25°C條件下避光，并在恒溫振蕩器中處理48h，恒溫振蕩器的轉(zhuǎn)速I(mǎi)OOrpm ；
[0030]第四步:在超凈工作臺(tái)上(需提前連續(xù)開(kāi)24h紫外)將經(jīng)第三步處理完全后離體莖尖經(jīng)無(wú)菌水沖洗5次后，用經(jīng)滅菌后的濾紙上將殘留的水分吸干，接種于配方為MS+6.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖的培養(yǎng)基上，在溫度25°C、每天在15001x組培專(zhuān)用LED燈下光照16h，培養(yǎng)25d，獲得成活的莖尖；
[0031]第五步:將成活的莖尖接種于配方為MS+1.0mg/L6-BA+6.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖的培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)25d。取草莓嫩葉制樣在流式細(xì)胞儀上初步檢測(cè)所獲得株系的倍性，此時(shí)的誘變率能達(dá)42.22%。
[0032]為了更為準(zhǔn)確的檢測(cè)經(jīng)上述方法培養(yǎng)獲得株系的倍性，將上述第五步的草莓大量增殖、生根后獲得幼苗并將其接種于滅菌后的基質(zhì)中(草木炭:蛭石:珍珠巖=9:3:1)煉苗，移栽，等植株抽生匍匐莖后取根尖進(jìn)行根尖常規(guī)壓片，通過(guò)染色體數(shù)目計(jì)數(shù)法進(jìn)一步鑒定十倍體株系植株，此時(shí)的誘變率能達(dá)98.81%。
[0033]圖1是實(shí)施例1培育的十倍體株系植株的檢測(cè)結(jié)果，使用儀器為FACScan流式細(xì)胞儀(美國(guó)BECKMAN公司)，激發(fā)光源為15mW氬離子，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，檢測(cè)樣品的PI熒光激發(fā)強(qiáng)度，圖1A中100處為五倍體DNA含量峰值，圖1B為相應(yīng)加倍后十倍體在100處的峰值。
[0034]圖3是實(shí)施例1培育的十倍體株系植株比較圖，圖3A中為五倍體植株形態(tài)圖，圖3B為相應(yīng)加倍后十倍體植株形態(tài)圖。
[0035]實(shí)施例2
[0036]第一步:選取長(zhǎng)勢(shì)好，整齊，粗壯的二倍體野生草莓和八倍體栽培草莓雜交得到五倍體草莓組培苗，在配方為MS+1.0mg/L6-BA+0.lmg/L NAA+6.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)以獲得大量的叢生芽以供選取離體莖尖用；
[0037]第二步:獲得叢生芽后，在超凈工作臺(tái)上(需提前連續(xù)開(kāi)24h紫外)選取0.6cm離體莖尖，先將其放入適量無(wú)菌水中，沖洗掉培養(yǎng)基殘留物和雜質(zhì)；接著，將其放入經(jīng)0.22 μ m水系微孔濾膜兩次過(guò)濾后獲得的無(wú)菌秋水仙素溶液中浸泡24h，該無(wú)菌秋水仙素溶液濃度為 3mg/mL。
[0038]第三步:將第二步中將裝有離體莖尖和秋水仙素水溶液用封口膜和橡皮筋進(jìn)行封口，保證其與外界隔離。將其在溫度為25°C條件下避光，并在恒溫振蕩器中處理72h，恒溫振蕩器的轉(zhuǎn)速I(mǎi)lOrpm ；
[0039]第四步:在超凈工作臺(tái)上(需提前連續(xù)開(kāi)24h紫外)將經(jīng)第三步處理完全后離體莖尖經(jīng)無(wú)菌水沖洗5次后，用經(jīng)滅菌后的濾紙上將殘留的水分吸干，接種于配方為MS+6.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖的培養(yǎng)基上，在溫度25°C、每天在18001x組培專(zhuān)用LED燈下光照16h，培養(yǎng)27d，獲得成活的莖尖；
[0040]第五步:將成活的莖尖接種于配方為MS+1.0mg/L6-BA+6.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖的培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)27d。取草莓嫩葉制樣在流式細(xì)胞儀上初步檢測(cè)所獲得株系的倍性，此時(shí)的誘變率能達(dá)32.14%。
[0041]為了更為準(zhǔn)確的檢 測(cè)經(jīng)上述方法培養(yǎng)獲得株系的倍性，將上述第五步的草莓大量增殖、生根后獲得幼苗并將其接種于滅菌后的基質(zhì)中(草木炭:蛭石:珍珠巖=9:3:1)煉苗，移栽，等該十倍體植株抽生匍匐莖后取根尖進(jìn)行根尖常規(guī)壓片，通過(guò)染色體數(shù)目計(jì)數(shù)法進(jìn)一步鑒定十倍體株系植株。此時(shí)的誘變率能達(dá)98.03%。
[0042]圖2是實(shí)例2培育的十倍體株系植株的檢測(cè)結(jié)果，方法為根尖常規(guī)壓片法進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)分析；在正置突光顯微鏡(Zeiss Axio Imager Al)下對(duì)染色體進(jìn)行觀察分析。圖2A為五倍體有絲分裂中期染色體數(shù)目圖，圖2B為相應(yīng)加倍后十倍體有絲分裂中期染色體數(shù)目圖。
[0043]實(shí)施例3
[0044]第一步:選取長(zhǎng)勢(shì)好，整齊，粗壯的野生五倍體草莓組培苗在配方為MS+1.0mg/L6-BA+6.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)以獲得大量的叢生芽以供選取離體莖尖用；
[0045]第二步:獲得叢生芽后，在超凈工作臺(tái)上(需提前連續(xù)開(kāi)24h紫外)選取0.Sm離體莖尖，先將其放入適量無(wú)菌水中，沖洗掉培養(yǎng)基殘留物和雜質(zhì)；接著，將其放入經(jīng)0.22 μ m水系微孔濾膜兩次過(guò)濾后獲得的 無(wú)菌秋水仙素溶液中浸泡72h，該無(wú)菌秋水仙素溶液濃度為 7mg/mL ；
[0046]第三步:將第二步中將裝有離體莖尖和秋水仙素水溶液用封口膜和橡皮筋進(jìn)行封口，保證其與外界隔離。將其在溫度為25°C條件下避光，并在恒溫振蕩器中處理30h，恒溫振蕩器的轉(zhuǎn)速120rpm ；
[0047]第四步:在超凈工作臺(tái)上(需提前連續(xù)開(kāi)24h紫外)，將經(jīng)第三步處理完全后離體莖尖經(jīng)無(wú)菌水沖洗5次后，用經(jīng)滅菌后的濾紙上將殘留的水分吸干，接種于配方為MS+6.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖的培養(yǎng)基上，在溫度25°C、每天在20001x組培專(zhuān)用LED燈下光照16h，培養(yǎng)30d，獲得成活的莖尖；
[0048]第五步:將成活的莖尖接種于配方為MS+1.0mg/L6-BA+6.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖的培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)30d。取草莓嫩葉制樣在流式細(xì)胞儀上初步檢測(cè)所獲得株系的倍性，此時(shí)的誘變率能達(dá)40.79%。
[0049]為了更為準(zhǔn)確的檢測(cè)經(jīng)上述方法培養(yǎng)獲得株系的倍性，將上述第五步的草莓大量增殖、生根后獲得幼苗并將其接種于滅菌后的基質(zhì)中(草木炭:蛭石:珍珠巖=9:3:1)煉苗，移栽，等該十倍體植株抽生匍匐莖后取根尖進(jìn)行根尖常規(guī)壓片，通過(guò)染色體計(jì)數(shù)法進(jìn)一步鑒定十倍體株系植株。此時(shí)的誘變率能達(dá)97.89%。
【權(quán)利要求】
1.一種誘導(dǎo)五倍體草莓染色體加倍的方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: 1)將五倍體草莓叢生芽的離體莖尖經(jīng)無(wú)菌水沖洗后放入秋水仙素溶液中浸泡，所述的秋水仙素溶液為無(wú)菌溶液； 2)將經(jīng)步驟I)浸泡后的離體莖尖和秋水仙素溶液密封避光，并放入溫度為25±1°C的振湯器中振湯； 3)取出經(jīng)步驟2)處理后的離體莖尖，經(jīng)無(wú)菌水沖洗后接種于MS+6.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖的培養(yǎng)基中，在溫度為25 V ± 1°C，LED燈照射條件下培養(yǎng)25~30d得到成活的莖尖; 4)將步驟3)成活的莖尖接種于MS+1.0mg/L6-BA+6.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖的培養(yǎng)基中25~30d。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)五倍體草莓染色體加倍的方法，其特征在于:所述步驟O的五倍體草莓為二倍體野生草莓和八倍體栽培草莓雜交得到五倍體草莓叢生芽或野生五倍體草莓叢生芽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的誘導(dǎo)五倍體草莓染色體加倍的方法，其特征在于:所述步驟I)的五倍體草莓叢生芽的離體莖尖長(zhǎng)度為0.5~0.8cm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)五倍體草莓染色體加倍的方法，其特征在于:所述步驟O的秋水仙素溶液濃度為1.0~7.0mg/mL,優(yōu)選濃度為1.0mg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)五倍體草莓染色體加倍的方法，其特征在于:所述步驟O的浸泡時(shí)間為24~72h，優(yōu)選為48h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)五倍體草莓染色體加倍的方法，其特征在于:所述步驟2)的振蕩器的轉(zhuǎn)速為100~120rpm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的誘導(dǎo)五倍體草莓染色體加倍的方法，其特征在于:所述步驟2)的振蕩器的振蕩時(shí)間為24~72h，優(yōu)選為48h。
8.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的誘導(dǎo)五倍體草莓染色體加倍的方法，其特征在于:所述步驟3)LED燈的光照強(qiáng)度為1500~20001ux。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的誘導(dǎo)五倍體草莓染色體加倍的方法，其特征在于:所述步驟3)離體莖每天在LED燈下光照16h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)五倍體草莓染色體加倍的方法，其特征在于:所述步驟2)和步驟4)的操作步驟在無(wú)菌的條件下完成。
【文檔編號(hào)】A01H1/08GK103733986SQ201310719862
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月17日
【發(fā)明者】喬玉山, 陳丙義, 陳孟龍, 蔡斌華, 章鎮(zhèn), 高志紅 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)