一種野牛草愈傷組織的誘導(dǎo)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種野牛草愈傷組織誘導(dǎo)方法，其以野牛草種子為外植體，消毒后置于無菌濾紙上進(jìn)行萌發(fā)，挑選已萌發(fā)長出胚根的種子，轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在25±1℃條件下黑暗培養(yǎng)20-25天；所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+2，4-D3.0-3.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH值5.8-6.0的固體培養(yǎng)基。本發(fā)明既排除了在消毒過程中消毒不徹底的種子在愈傷組織誘導(dǎo)過程中造成的污染現(xiàn)象，也排除了無生命力種子對愈傷誘導(dǎo)的干擾，同時也降低了操作的難度，免去了對成熟胚進(jìn)行垂直切割的步驟，在簡單易操作的基礎(chǔ)上同時提高了愈傷誘導(dǎo)率，使其達(dá)到了90%以上。
【專利說明】一種野牛草愈傷組織的誘導(dǎo)方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種野牛草愈傷組織的誘導(dǎo)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]野牛草(學(xué)名:Buchloe dactyloides)是一種具有發(fā)達(dá)匍匍莖的暖季型草坪草。野牛草具有極強(qiáng)的耐旱、耐熱和耐水淹性，抗病和再生能力強(qiáng)，適應(yīng)范圍廣的特點(diǎn)，是目前應(yīng)用較多的一種暖季型草坪草。但野牛草也存在一些缺點(diǎn)，如種子建坪的速度較慢，形成的草坪質(zhì)量較差，色澤灰綠，在北方的綠期短、耐蔭性和耐踐踏性差、近距離觀賞性和景觀效果較差，冬相枯黃等等，這些缺點(diǎn)都限制了野牛草在我國的應(yīng)用。為解決野牛草應(yīng)用方面的難題，草坪科學(xué)工作者加強(qiáng)了野牛草的應(yīng)用與基礎(chǔ)研究，所涉及的研究領(lǐng)域也越來越廣。但直至目前仍未培育中綠期明顯延長的野牛草新品種，這也說明傳統(tǒng)育種方法對這一性狀改良存在一定的局限性。
[0003]現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展使得我們對生物品種的選育和改良工作有了一個更為得心應(yīng)手的工具。利用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行品種改良不但更經(jīng)濟(jì)、有效，且可大大縮短育種時間。水稻、玉米、小麥等禾本科植物已成功通過突變體篩選及轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得優(yōu)良新品種，這諸多成功的案例為野牛草新品種的培育提供了重要的技術(shù)支撐。而大多數(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠順利進(jìn)行的基礎(chǔ)和所必需的階段是要建立高效的植株再生體系。目前以成熟胚為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)在多種植物的再生體系建立方面上都有了廣泛的應(yīng)用，而以野牛草成熟胚為外植體的再生體系建立尚處于起步階段。
[0004]在用于野牛草再生體系建立的各種外植體中，以成熟胚種子為外植體具有比其他外植體易采集、乃儲藏、不受季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn)，能保證不同個體間生理狀態(tài)一致性和提供大量愈傷組織等優(yōu)點(diǎn)，是開展遺傳轉(zhuǎn)化最為方便實(shí)用的受體，且成熟胚細(xì)胞具有潛在旺盛的分裂能力，是用于組織培養(yǎng)的良好材料。
[0005]2005年，錢永強(qiáng)以野牛草成熟胚為外植體材料，對外植體的滅菌、愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代及植株再生等各個培養(yǎng)階段的影響因素進(jìn)行了探討；并從不同角度對愈傷組織的褐化誘因進(jìn)行了研究。其是通過體胚發(fā)生途徑建立野牛草再生體系的方法，將消過毒的種子培養(yǎng)3天后，無菌操作取出萌芽的成熟胚，垂直于胚軸切割數(shù)段后繼續(xù)置于原培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)20天后，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到86.67%。但此方法在操作過程中易發(fā)生外植體污染或死亡的現(xiàn)象，由于野牛草的種子較小，對其成熟胚進(jìn)行切割很容易使得成熟胚失去活性，從而無法誘導(dǎo)出愈傷組織(錢永強(qiáng)，孫振元，李云，等.野牛草成熟胚植株再生及其影響因素研究[J].草業(yè)科學(xué)，2005 (2):101-106.)。
[0006]李瑞芬以野牛草幼穗為外植體，建立了愈傷組織誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)和植株再生體系。但這些工作都是處于起步階段，還沒有形成比較系統(tǒng)的研究結(jié)果，而且還都存在誘導(dǎo)出的愈傷組織褐化嚴(yán)重及再生率低的問題(李瑞芬，孫振元，魏建華，等.野牛草幼穗愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生[J].武漢植物學(xué)研究，2004(5):449-454.)。
[0007]現(xiàn)有的野牛草成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)過程中存在著誘導(dǎo)率低，易污染的現(xiàn)象，通過本發(fā)明的方法可以避免愈傷組織因成熟胚材料消毒不徹底而引起的污染，使污染率降低到零，同時本發(fā)明的方法也提高了以野牛草成熟胚為外植體的愈傷誘導(dǎo)率，使得愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到了 90%以上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種野牛草愈傷組織的誘導(dǎo)方法。該方法可以避免因外植體消毒不徹底而造成的污染；操作簡便，能夠獲得大量的愈傷組織，愈傷誘導(dǎo)率在90%以上。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0010]本發(fā)明提供一種一種野牛草愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于，其以野牛草種子為外植體，消毒后進(jìn)行萌發(fā)，挑選已萌發(fā)長出胚根的種子，轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在25± I °C條件下黑暗培養(yǎng)20-25天；所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+2，4-D3.0-3.5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L，pH 值 5.8-6.0 的固體培養(yǎng)基。
[0011]更為具體地，所述方法包括如下步驟:
[0012]I)種子的預(yù)處理:將種子從穎苞中取出；
[0013]2)外植體的消毒:將步驟I)中得到的種子用自來水洗凈后，置于無菌操作臺中用70%的酒精和有效氯濃度為7%-10%的次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒，再用無菌水清洗4-5遍；
[0014]3)種子的萌發(fā):將步驟2)消毒過的種子置于鋪有濕潤無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25°C的光照培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)I~2天，期間要保證無菌培養(yǎng)皿中有足夠的無菌水以便種子萌發(fā)；
[0015]4)成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo):從培養(yǎng)皿中挑選已萌發(fā)長出胚根的種子，轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+2，4-D3.0-3.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH值5.8-6.0,培養(yǎng)條件為25土 1°C條件下黑暗培養(yǎng)，按照常規(guī)方法進(jìn)行高壓滅菌。
[0016]進(jìn)一步地，所述步驟2)外植體的消毒過程包括:先將洗凈的種子放入無菌容器中，在無菌工作臺中先用70%的酒精消毒60s，接著用有效氯濃度為7%-10%的的次氯酸鈉溶液消毒30min,后再用無菌水清洗4_5遍。
[0017]進(jìn)一步地，所述步驟3)種子的萌發(fā)過程包括:先在培養(yǎng)皿中鋪上雙層濾紙，高壓滅菌20min后置于無菌操作臺中，用無菌水潤濕，將經(jīng)過步驟2)消毒過的種子置于無菌濾紙上，并向培養(yǎng)皿中加入無菌水，之后將培養(yǎng)皿封口后置于光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。
[0018]作為優(yōu)選，步驟4)中所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+2，4-D3.0mg/L+蔗糖30g/L+ 瓊脂 7g/L，pH 值 5.8-6.0。
[0019]進(jìn)一步地，前述方法誘導(dǎo)出愈傷組織后再進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基 +10mg/L 脯氨酸 +lg/L 水解絡(luò)蛋白 +2，4-D3mg/L+NAAlmg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L ;培養(yǎng)條件為25±1°C條件下黑暗培養(yǎng)。
[0020]本發(fā)明的有益效果在于:
[0021]本發(fā)明優(yōu)選了 2，4_D濃度為3.0-3.5mg/L的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行野牛草遇上組織的誘導(dǎo)。并采用先對種子進(jìn)行消毒，然后置于無菌濾紙上使其萌發(fā)，再取已萌發(fā)的種子進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)方法。此步驟既排除了在消毒過程中消毒不徹底的種子在愈傷組織誘導(dǎo)過程中造成的污染現(xiàn)象，也排除了無生命力種子對愈傷誘導(dǎo)的干擾，同時該方法也降低了操作的難度，免去了對成熟胚進(jìn)行垂直切割的步驟，在簡單易操作的基礎(chǔ)上同時提高了愈傷誘導(dǎo)率，高達(dá)94.67%。本發(fā)明所述方法為簡化遺傳分析、作為轉(zhuǎn)基因材料以及基因組學(xué)研究材料打下基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中黑暗培養(yǎng)6天后的種子；
[0023]圖2為本發(fā)明接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中黑暗培養(yǎng)19天后的種子；
[0024]圖3為本發(fā)明接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中黑暗培養(yǎng)20天后的種子；
[0025]圖4為本發(fā)明繼代中的愈傷組織。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0027]實(shí)施例1愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中2，4-D濃度的優(yōu)化
[0028]1、種子的預(yù)處理:將種子從穎苞中取出；
[0029]2、外植體的消毒:先將洗凈的種子放入無菌容器中，在無菌工作臺中先用70%的酒精消毒60s，接著用7-10%的次氯酸鈉溶液消毒30min，用無菌水沖洗4_5次后備用。
[0030]3、種子的萌發(fā):先配置不加激素的MS培養(yǎng)基，滅菌后倒入大培養(yǎng)皿中冷卻待用，將經(jīng)過消毒過的種子置于加有無激素MS培養(yǎng)基的大培養(yǎng)皿中。之后將培養(yǎng)皿封口后置于光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2-3天。
[0031]4、成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo):從培養(yǎng)皿中挑選已萌發(fā)長出胚根的種子，轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)(見圖1、圖2)。所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基+2，4-D3.0mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L，pH 值 5.8-6.0 ;2，4_D 濃度分別為 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0mg/L ;培養(yǎng)條件為:25土 TC條件下黑暗培養(yǎng)，按照常規(guī)方法進(jìn)行高壓滅菌。誘導(dǎo)20-25天后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率，結(jié)果如表1所示。
[0032]表1不同2，4_D濃度下成熟胚愈傷組織的愈傷誘導(dǎo)率
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一種野牛草愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于，其以野牛草種子為外植體，消毒后進(jìn)行萌發(fā)，挑選已萌發(fā)長出胚根的種子，轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在25土rc條件下黑暗培養(yǎng)20-25天；所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+2，4-D3.0-3.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH值5.8-6.0的固體培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)種子的預(yù)處理:將種子從穎苞中取出； 2)外植體的消毒:將步驟I)中得到的種子用自來水洗凈后，置于無菌操作臺中用70%的酒精和有效氯濃度為7%-10%的次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒，再用無菌水清洗4-5遍； 3)種子的萌發(fā):將步驟2)消毒過的種子置于鋪有濕潤無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25°C的光照培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)I~2天，期間要保證無菌培養(yǎng)皿中有足夠的無菌水以便種子萌發(fā)； 4)成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo):從培養(yǎng)皿中挑選已萌發(fā)長出胚根的種子，轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+2，4-D3.0-3.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH值5.8-6.0,培養(yǎng)條件為25± I°C條件下黑暗培養(yǎng)，按照常規(guī)方法進(jìn)行高壓滅菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟2)外植體的消毒過程包括:先將洗凈的種子放入無菌容器中，在無菌工作臺中先用70%的酒精消毒60s，接著用有效氯濃度為7%-10%的的次氯酸鈉溶液消毒30min，后再用無菌水清洗4_5遍。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟3)種子的萌發(fā)過程包括:先在培養(yǎng)皿中鋪上雙層濾紙，高壓滅菌20min后置于無菌操作臺中，用無菌水潤濕，將經(jīng)過步驟2)消毒過的種子置于無菌濾紙上，并向培養(yǎng)皿中加入無菌水，之后將培養(yǎng)皿封口后置于光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟4)中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基 +2，4-D3.0mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L，pH 值 5.8-6.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，誘導(dǎo)出愈傷組織后進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基+10mg/L脯氨酸+lg/L水解絡(luò)蛋白+2，4_D3mg/L+NAAlmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L ;培養(yǎng)條件為25 ± I °C條件下黑暗培養(yǎng)。
【文檔編號】A01H4/00GK103733993SQ201310698035
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月17日
【發(fā)明者】王顯國, 寧亞明, 張?zhí)N薇, 孫彥, 吳菲菲 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)