一種花生慢生根瘤菌及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種慢生根瘤菌（Bradyrhizobium?sp.）WD-1，它的培養(yǎng)方法及其用途。該培養(yǎng)方法包括斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)與發(fā)酵培養(yǎng)，得到的發(fā)酵培養(yǎng)物含有100億/ml慢生根瘤菌WD-1。與對(duì)照相比，本發(fā)明的花生根瘤菌WD-1的花生結(jié)瘤數(shù)提高925.6%，植株干重提高63.6%，植株全氮提高18.1%，并且花生產(chǎn)量可提高57.9%。與現(xiàn)有生產(chǎn)使用的花生根瘤菌144相比，單株結(jié)瘤數(shù)提高27.4%，單株干重提高8.7%，單株全氮含量提高6.5%，單株產(chǎn)量提高30.45%。因此本發(fā)明在花生種植業(yè)上有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種花生慢生根瘤菌及其用途
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，本發(fā)明涉及一種慢生根瘤菌WD-1，還涉及所述慢生根瘤菌WD-1的用途。
【【背景技術(shù)】】
[0002]自然界中有些原核微生物能合成固氮酶，在常溫常壓下，將空氣中的N2還原成NH3。由固氮微生物固定的氮素約占地表化合態(tài)氮的65%~70%，其中以根瘤菌與豆科植物共生體系固氮能力最強(qiáng)，占生物固氮量的65%以上。利用根瘤菌與豆科植物共生固氮提高土壤肥力和農(nóng)作物產(chǎn)量是世界農(nóng)業(yè)的經(jīng)典經(jīng)驗(yàn)。
[0003]花生是一年生豆科植物，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含維生素、蛋白質(zhì)和脂肪，是世界上種植面積最大的油料作物，在我國(guó)各地均有種植。花生根瘤菌能與花生形成共生根瘤來(lái)固定空氣中的氮?dú)?，為植物生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，提高花生的產(chǎn)量和品質(zhì)，可使花生在貧瘠的土壤中生長(zhǎng)，因此，研究花生根瘤菌具有重要的實(shí)際意義和應(yīng)用前景。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0004][要解決的技術(shù)問(wèn)題]
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種慢生根瘤菌WD-1。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述慢生根瘤菌WD-1的用途。
[0007][技術(shù)方案]
[0008]本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0009]本發(fā)明涉及一種慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.) CGMCC N0.8386,該菌株已于2013年10月23日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCC N0.8386。
[0010]本發(fā)明還涉及所述的慢生根瘤菌WD-1的培養(yǎng)方法。
[0011]該培養(yǎng)方法的步驟如下:
[0012]A、斜面培養(yǎng)
[0013]使用接種環(huán)將慢生根瘤菌WD-1接種于裝在試管中的斜面培養(yǎng)基的斜面上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度28~30°C的條件下斜面培養(yǎng)5~7d,得到斜面培養(yǎng)物；
[0014]B、種子培養(yǎng)
[0015]使用接種環(huán)取一環(huán)步驟A得到的斜面培養(yǎng)物接種到液體種子培養(yǎng)基中，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中，在溫度28~30°C與轉(zhuǎn)速180rpm的條件下培養(yǎng)4~5d，得到種子培養(yǎng)物；
[0016]C、發(fā)酵培養(yǎng)
[0017]按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)3%~5%接種量，將步驟B得到的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度28~30°C與轉(zhuǎn)速180rpm的條件下培養(yǎng)4~5d，發(fā)酵結(jié)束所得到的發(fā)酵液含有100億/ml慢生根瘤菌WD-1。發(fā)酵液即為慢生根瘤菌劑。[0018]根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式,所述斜面培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基)的制備方法如下:
[0019]將10~20克甘露醇、0.1~1.0克氯化鈉、0.1~1.0克硫酸鎂、0.1~1.0克硫酸鈣、0.1~1.0克磷酸氫二鉀、I~10克酵母膏與18~20克瓊脂溶于水中，再往得到的溶液中添加I~IOml以重量計(jì)1%鑰酸鈉水溶液與I~IOml以重量計(jì)1%硼酸水溶液,接著用水補(bǔ)充達(dá)到總體積1000ml ;最后,使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿將溶液的pH值調(diào)節(jié)至6.8~7.0。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述種子培養(yǎng)基的制備方法如下:
[0021]將10~20克甘露醇、0.1~I克氯化鈉、0.1~I克硫酸鎂、0.1~I克硫酸鈣、0.1~I克磷酸氫二鉀、I~10克酵母膏與18~20克瓊脂溶于水中，再往得到的溶液中添加I~IOml以重量計(jì)1%鑰酸鈉與I~IOml以重量計(jì)1%硼酸，接著用水補(bǔ)充達(dá)到總體積1000ml ;最后,使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿將溶液的pH值調(diào)節(jié)至6.8~7.0。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法如下: [0023]將I~10克酵母膏、5~20克甘油、0.1~2克硝酸鉀、0.1~2克磷酸氫二銨、0.1~I克硫酸錳、0.1~I克三氯化鐵、0.1~2克磷酸氫二鉀、0.1~2克磷酸二氫鉀與
0.1~I克氯化鈉溶于水中，接著用水補(bǔ)充達(dá)到總體積1000ml ;最后,使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿將溶液的PH值調(diào)節(jié)至6.8~7.0。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的無(wú)機(jī)酸選自硫酸或鹽酸；所述的無(wú)機(jī)堿選自氫氧化鈉或氫氧化鉀。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿的水溶液濃度是5-6M。
[0026]本發(fā)明涉及一種采用所述培養(yǎng)方法所得到的慢生根瘤菌劑。
[0027]本發(fā)明還涉及所述的慢生根瘤菌劑在花生種植中用途。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在花生種植期，所述的慢生根瘤菌劑，按140~160ml/畝地的用量與花生種子進(jìn)行混勻拌種，然后播種。
[0029]下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0030]本發(fā)明涉及一種慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.) WD-1,該菌株已于2013年10月23日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCC N0.8386。
[0031]本發(fā)明人通過(guò)從山東、河北、河南、遼寧四個(gè)花生種植地區(qū)的20個(gè)土樣中分離出20株野生型花生根瘤菌，初篩后，其中九株與花生有較好的結(jié)瘤效果，經(jīng)過(guò)16s測(cè)序、生物學(xué)鑒定、回接實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了這九個(gè)菌株均為花生慢生型根瘤菌，又經(jīng)過(guò)多次盆栽實(shí)驗(yàn)和田間實(shí)驗(yàn)復(fù)篩，最終篩選出了一株高效固氮的慢生根瘤菌。
[0032]A、花生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)的分離、初篩。從山東、河北、河南、遼寧四個(gè)地區(qū)搜集了 20個(gè)花生種植地的土樣，對(duì)這20個(gè)土樣進(jìn)行根瘤菌的捕捉實(shí)驗(yàn)。
[0033]捕捉實(shí)驗(yàn)方法如下:將IOg 土壤樣與90g無(wú)菌水加到三角瓶中，震蕩搖勻，得到IO-1稀釋度的土壤懸液，然后取IOml 土壤懸液，然后加90ml無(wú)菌水，震蕩搖勻，得到10_2稀釋度的土壤懸液，按照同樣方式制備得到10_3、10_4、10_5稀釋度的土壤懸液。這些土壤懸液都分別進(jìn)行了捕捉實(shí)驗(yàn)。
[0034]將Iml上述土壤懸液接種到預(yù)先表面消毒及萌芽的花生種子中，在花盆中以蛭石作為培養(yǎng)介質(zhì)對(duì)花生種子進(jìn)行培養(yǎng)，定期澆灌常規(guī)低氮培養(yǎng)液(蛭石和低氮培養(yǎng)液均經(jīng)過(guò)滅菌處理，所述低氮培養(yǎng)液是按照常規(guī)方法配制的)。在培養(yǎng)I個(gè)月后，收獲的植物均有根瘤，將這種根瘤在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行多次分離純化，于是獲得20株野生型菌株。
[0035]將獲得的20株野生型菌株在花生上進(jìn)行常規(guī)的回接實(shí)驗(yàn)，以確定該菌種與宿主是否有良好的結(jié)瘤效果，在實(shí)驗(yàn)中使用的蛭石、花盆、澆灌用水、花生種子均進(jìn)行了常規(guī)滅菌處理。
[0036]經(jīng)過(guò)2個(gè)月的培養(yǎng)觀察，發(fā)現(xiàn)其中9個(gè)菌株與宿主花生有較好的結(jié)瘤效果，不同程度的促進(jìn)了植物生長(zhǎng)，而其它11個(gè)菌株結(jié)瘤效果較差，促生長(zhǎng)效果不明顯，有些還會(huì)使作物根部變成褐色。因此，上述9個(gè)菌株作了保藏，以便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0037]B、對(duì)初篩的9個(gè)菌株進(jìn)行了下述的分子生物學(xué)鑒定，進(jìn)一步確定所選菌株為花生根瘤菌。
[0038](I) 16S rDNA 序列測(cè)定:
[0039]樣品總DNA的制備:按常規(guī)的細(xì)菌DNA提取方法進(jìn)行。
[0040]PCR引物:正向引物27F，反向引物1492R
[0041 ] PCR反應(yīng)體系:反應(yīng)體系20 μ L體積，反應(yīng)液組成:I μ L DNA模板，10 μ L2XMastarMix,0.4μ L 27F,0.4μ L 1492R，超純水補(bǔ)足至 20 μ L。
[0042]PCR 擴(kuò)增程序:95 °C 2min ；30 個(gè)循環(huán)(84 °C lmin，52 °C lmin，65 °C 8min)；65 °C 18min。
[0043]擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后送北京三博遠(yuǎn)志公司測(cè)序。將測(cè)到的DNA序列進(jìn)行人工矯正后，使用NCBI中的BIAST軟件在線比對(duì)，經(jīng)過(guò)比對(duì)，所鑒定的9個(gè)菌株與大豆根瘤菌的相似度為99%，所以斷定這9個(gè)菌株均為根瘤菌屬，在回接實(shí)驗(yàn)中與花生有較好的結(jié)瘤效果，于是可以確定`它們?yōu)榛ㄉ鼍?br> [0044](2)生理生化鑒定
[0045]⑴、牛肉膏-蛋白胨反應(yīng):將9個(gè)菌株分別接種在牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基中在溫度28°C下培養(yǎng)5天。如果培養(yǎng)液澄清，菌體未見生長(zhǎng)，與未接種菌株的對(duì)照相同，這表明該菌株不能在牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
[0046]牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基組成如下:3g牛肉膏、IOg蛋白胨、5g酵母膏、5g氯化鈉、1000ml 蒸餾水，ρΗ7.2。
[0047](ii) ,BTB反應(yīng):將9個(gè)菌株分別在BTB平板上在溫度28°C下培養(yǎng)7天。如果平板顏色變藍(lán)，說(shuō)明該菌株在BTB平板上產(chǎn)堿，屬于慢生型菌株。
[0048]BTB反應(yīng)培養(yǎng)基組成如下:10g甘露醇、0.8g酵母浸膏粉、0.25g磷酸氫二鉀、0.25g磷酸二氫鉀、0.2g硫酸鎂、0.1g氯化鈉、15-20g瓊脂、1000ml蒸餾水，Iml以重量計(jì)0.25%溴麝香草酚藍(lán)，PH6.8-7.0。
[0049](iii)、石蕊牛奶反應(yīng):將9個(gè)菌株分別在石蕊牛奶培養(yǎng)基中在溫度28°C下培養(yǎng)7天，培養(yǎng)基顏色變藍(lán)，并形成乳清環(huán)，表明該菌株產(chǎn)堿，屬于慢生型。
[0050]石蕊牛奶培養(yǎng)基組成如下:100ml脫脂牛奶，4ml2.5%石蕊溶液，低壓滅菌。
[0051](iv)、3_酮基乳糖反應(yīng):反應(yīng)呈陰性，菌落周圍未出現(xiàn)黃褐色沉淀，表明該菌株為非土壤桿菌。
[0052]3-酮基乳糖培養(yǎng)基組成如下:10g乳糖、Ig酵母浸膏粉、1000ml蒸餾水、15_20g瓊脂，PH7.2。[0053]通過(guò)上述方法鑒定，判定所篩選的9個(gè)菌株均為花生慢生型根瘤菌。
[0054]C、盆栽篩選
[0055]初篩得到的9個(gè)菌株按采集地區(qū)分別命名為ZMW、LX、XCW、Xffff、YS、YSW、ZW、DMW,WD-1，另取本公司公開銷售的一株花生根瘤菌株144加入設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將上述10個(gè)菌株進(jìn)行盆栽比較實(shí)驗(yàn)。
[0056]實(shí)驗(yàn)方法如下:
[0057]⑴、按照本申請(qǐng)說(shuō)明書前面描述的培養(yǎng)方法，對(duì)上述10個(gè)菌株分別進(jìn)行活化和發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)得到的慢生根瘤菌劑備用。
[0058]⑵、采用種子常規(guī)消毒方法(例如，用95%的酒精浸泡5min)對(duì)花生種子表面進(jìn)行消毒，然后把消毒花生種子放在浸透無(wú)菌水的濕紗布上，再將其整體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，在溫度28°C培養(yǎng)箱中催芽7-10天。選取花生芽長(zhǎng)相同的花生種子，分別浸泡于在步驟I中制備的10個(gè)菌株的發(fā)酵液中，浸泡lOmin，然后栽植至裝有蛭石的13 X 15cm花盆中，每個(gè)花盆栽一株，每個(gè)菌株設(shè)計(jì)為一組，每組8個(gè)平行，另加一組清水浸種作為對(duì)照，共計(jì)11組。
[0059]吸取相應(yīng)的發(fā)酵液接種于種子周圍，根據(jù)測(cè)定菌液的OD值(λ=600ηπι)，接種時(shí)保證每顆種苗接種量達(dá)到1.0X IO9個(gè)以上。根據(jù)培養(yǎng)溫室光照、溫度與濕度情況按照花生栽培方法進(jìn)行常規(guī)管理，其中包括燒水。
[0060]⑶、按照常規(guī)的調(diào)查方法(例如數(shù)瘤數(shù)、稱干重、消煮法測(cè)全氮)，待花生植株生長(zhǎng)到花期時(shí)，開始調(diào)查結(jié)瘤數(shù)、干重、全氮，培養(yǎng)約4個(gè)月時(shí)調(diào)查產(chǎn)量，調(diào)查結(jié)果如下表1至表4。
[0061]表1:花生根瘤菌盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)瘤調(diào)查
[0062]
【權(quán)利要求】
1.一種慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.) WD-1,該菌株已于2013年10月23日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCC N0.8386。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢生根瘤菌WD-1的培養(yǎng)方法，其特征在于該方法的步驟如下: A、斜面培養(yǎng) 使用接種環(huán)將慢生根瘤菌WD-1接種于裝在試管中的斜面培養(yǎng)基的斜面上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度28~30°C的條件下斜面培養(yǎng)5~7d，得到斜面培養(yǎng)物； B、種子培養(yǎng) 使用接種環(huán)將一環(huán)步驟A得到的斜面培養(yǎng)物接種到液體種子培養(yǎng)基中，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中，在溫度28~30°C與轉(zhuǎn)速180rpm的條件下培養(yǎng)4~5d，得到種子培養(yǎng)物； C、發(fā)酵培養(yǎng) 按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)3%~5%接種量，將步驟B得到的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后置于恒溫培養(yǎng) 箱中在溫度28~30°C與轉(zhuǎn)速180rpm的條件下培養(yǎng)4~5d，發(fā)酵結(jié)束所得到的發(fā)酵培養(yǎng)物含有100億/ml慢生根瘤菌WD-1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述斜面培養(yǎng)基的制備方法如下: 將10~20克甘露醇、0.1~1.0克氯化鈉、0.1~1.0克硫酸鎂、0.1~1.0克硫酸鈣、0.1~1.0克磷酸氫二鉀、I~10克酵母膏與18~20克瓊脂溶于水中，再往得到的溶液中添加I~IOml以重量計(jì)1%鑰酸鈉水溶液與I~IOml以重量計(jì)1%硼酸水溶液,接著用水補(bǔ)充達(dá)到總體積1000ml ;最后,使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿將溶液的pH值調(diào)節(jié)至6.8~7.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基的制備方法如下: 將10~20克甘露醇、0.1~I克氯化鈉、0.1~I克硫酸鎂、0.1~I克硫酸鈣、0.1~I克磷酸氫二鉀、I~10克酵母膏與18~20克瓊脂溶于水中，再往得到的溶液中添加I~IOml以重量計(jì)1%鑰酸鈉與I~IOml以重量計(jì)1%硼酸，接著用水補(bǔ)充達(dá)到總體積1000ml ；最后，使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿將溶液的pH值調(diào)節(jié)至6.8~7.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法如下: 將I~10克酵母膏、5~20克甘油、0.1~2克硝酸鉀、0.1~2克磷酸氫二銨、0.1~I克硫酸錳、0.1~I克三氯化鐵、0.1~2克磷酸氫二鉀、0.1~2克磷酸二氫鉀與0.1~I克氯化鈉溶于水中，接著用水補(bǔ)充達(dá)到總體積1000ml ;最后，使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿將溶液的pH值調(diào)節(jié)至6.8~7.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的無(wú)機(jī)酸選自硫酸或鹽酸；所述的無(wú)機(jī)堿選自氫氧化鈉或氫氧化鉀。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液的濃度是5-6M。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述培養(yǎng)方法所得到的花生慢生根瘤菌劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的花生慢生根瘤菌劑在花生種植中用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于在花生種植期，所述的花生慢生根瘤菌劑，按140~160ml/畝地的用量與花生種子進(jìn)行混勻拌種，然后播種。
【文檔編號(hào)】A01N63/02GK103627662SQ201310643826
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月3日
【發(fā)明者】孫杉杉, 朱瑞艷, 杜迎輝, 徐志文 申請(qǐng)人:領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司