一種枯草芽孢桿菌及其在水稻稻曲病防治中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌及其在水稻稻曲病生物防治中的應(yīng)用技術(shù)，涉及植物病害生物防治【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種對(duì)稻曲病菌生長(zhǎng)具有明顯抑菌活性的枯草芽孢桿菌T122F，采用改良的細(xì)菌發(fā)酵液體培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌T122F，其發(fā)酵濾液能明顯抑制稻曲病菌分生孢子萌發(fā)和菌絲擴(kuò)展，使用枯草芽孢桿菌T122F對(duì)田間稻曲病具有較好防治效果，防治效果顯著高于10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑的正常使用劑量。本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌及其發(fā)酵液為制備防治水稻稻曲病的生物農(nóng)藥提供參考，本發(fā)明擴(kuò)大了枯草芽孢桿菌T122F的應(yīng)用范圍，對(duì)保障我國(guó)水稻糧食的安全生產(chǎn)和增產(chǎn)，減少因化學(xué)農(nóng)藥的大量投入使用產(chǎn)生的環(huán)境污染等問(wèn)題起著重要的意義。
【專利說(shuō)明】一種枯草芽孢桿菌及其在水稻稻曲病防治中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物病害生物防治【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體涉及一種枯草芽孢桿菌{Bacillus subtil is.、及其在水稻稻曲病生物防治中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]稻曲病{Ustilaginoidea virens (Cooke) Tak)為水稻穗部的真菌病害,又稱假黑穗病、綠黑穗病，俗稱“豐收病”。在中國(guó)、日本、菲律賓、印度、美國(guó)、澳大利亞、埃及、英國(guó)等五大洲40多個(gè)國(guó)家的水稻生產(chǎn)區(qū)都有分布。稻曲病也是近10年來(lái)在我國(guó)上升的主要水稻病害，特別是近年來(lái)，該病在我國(guó)常年危害面積為560飛40萬(wàn)公頃，大流行年份發(fā)生與危害面積可達(dá)1000萬(wàn)公頃。一般田塊的病穗率約為3%~5%，發(fā)病較重的田塊病穗率高達(dá)90%，直接產(chǎn)量損失可達(dá)50%以上，有的甚至絕收，經(jīng)濟(jì)損失巨大。稻曲病發(fā)生不僅降低稻谷產(chǎn)量及米質(zhì)，而且混雜于稻谷中的病粒及其病菌能產(chǎn)生對(duì)人畜有致畸作用的毒素，人畜食用這種稻米較多時(shí)會(huì)發(fā)生慢性中毒，影響健康。稻曲病的發(fā)生、流行及為害程度與(25~30°C)、高濕、寡日照利于病菌孢子萌發(fā)和侵染，開花期多陰天并帶有降水有利于發(fā)病。
[0003]選用適量的化學(xué)農(nóng)藥是目前防治稻曲病的主要措施。目前生產(chǎn)中使用的藥劑很多，銅制劑和有機(jī)錫等一些農(nóng)藥是防治稻曲病的有效藥劑，但這些藥劑對(duì)即將收獲的稻谷殘留及其重金屬對(duì)周邊植物的藥害、環(huán)境的安全及人體的傷害均是令人關(guān)注的問(wèn)題。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)稻曲病的生物防治研究較少，生產(chǎn)上發(fā)現(xiàn)用于防治水稻紋枯病的紋曲寧對(duì)水稻稻曲病具有一定的防治效果，紋曲寧是由枯草芽孢桿菌與井崗霉素進(jìn)行復(fù)配而成的微生物農(nóng)藥，但紋曲寧中的井崗霉素是紋枯病的有效藥劑，對(duì)稻曲病防治效果不理想，推測(cè)起防治作用的可能是枯草芽孢桿菌。
[0004]稻曲病菌的孢子有三種類型，分別是厚垣孢子、薄壁分生孢子和子囊孢子，厚垣孢子和子囊孢子萌發(fā)后均可形成薄壁的分生孢子，分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管能形成次生分生孢子。分生孢子目前被認(rèn)為是稻曲病菌有效的侵染形態(tài)，稻曲病的分生孢子可以在水稻孕穗期幼穎的穎殼表面形 成菌絲并伸展到穎殼內(nèi)部[代光輝等.稻曲病不同抗性水稻品種的組織化學(xué)及分生孢子侵染途徑的初步觀察.植物病理學(xué)報(bào)，2005，35 (I): 37-42]，在水稻孕穗期采用人工噴霧接種和注射接種方法證實(shí)了稻曲病菌的分生孢子能引起水稻發(fā)病并產(chǎn)生稻曲球病粒[王疏等.稻曲病接種菌源及接種方法的研究.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996 (I):33-35;楊秀娟等.水稻稻曲病室內(nèi)人工接種技術(shù).植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2011, 38(5):395-400]。
[0005]前期研究發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌分生孢子在含有枯草芽孢桿菌菌體的水瓊脂培養(yǎng)基平板上不能正常萌發(fā)，表現(xiàn)為不萌發(fā)或已萌發(fā)產(chǎn)生的芽管短而干縮，說(shuō)明在枯草芽孢桿菌菌體存在下，分生孢子萌發(fā)受抑制。在PSA培養(yǎng)基平板中，稻曲病菌菌落與枯草芽孢桿菌對(duì)峙生長(zhǎng)4天后，在兩者中間能產(chǎn)生寬度值約Ilmm的抑菌帶，對(duì)峙生長(zhǎng)20天后發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌菌落形態(tài)萎縮，菌落邊緣菌絲畸形膨大，原生質(zhì)溢出，表明枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的代謝物質(zhì)也能抑制病菌菌絲的生長(zhǎng)，并能殺死菌絲(附圖1)。[0006]枯草芽孢桿菌是一類嗜溫、好氧或兼性厭氧的腐生細(xì)菌，在自然界中分布廣泛，極易分離培養(yǎng)，對(duì)人畜無(wú)害，不污染環(huán)境。能夠產(chǎn)生對(duì)熱、紫外線、電磁輻射有很強(qiáng)抗性的芽孢，耐受各種不良的環(huán)境條件。產(chǎn)生多種抗菌素(如抗真菌肽、脂肽抗生素、小分子的多糖物質(zhì)、大分子的抗菌蛋白)和酶(如蛋白酶、淀粉酶、酯酶、幾丁質(zhì)酶及乙?；被咸擒彰傅燃?xì)胞壁降解酶)，具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力。對(duì)植物多種病原菌(如香蕉枯萎病菌、小麥白粉病菌，稻瘟病菌、棉花立枯病菌、大豆根腐病菌、番茄灰霉病菌、辣椒炭疽病菌等)產(chǎn)生抑制，已經(jīng)在黃瓜、辣椒、香蕉、水稻、小麥、玉米、棉花等農(nóng)作物主要病害上表現(xiàn)出很好的防治效果。目前利用枯草芽孢桿菌及其菌劑生物防治水稻稻曲病的研究和應(yīng)用較少，利用本發(fā)明的枯草芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)稻曲病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，開發(fā)稻曲病菌的生防微生物菌劑用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，對(duì)保障我國(guó)水稻糧食的安全生產(chǎn)和增產(chǎn)，減少因化學(xué)農(nóng)藥的大量投入使用產(chǎn)生的環(huán)境污染等問(wèn)題起著重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)水稻稻曲病菌具有較強(qiáng)抑制活性的枯草芽孢桿菌及其在稻曲病生物防治中的應(yīng)用，利用本發(fā)明的枯草芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)稻曲病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，開發(fā)稻曲病菌的生防微生物菌劑用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，解決使用化學(xué)農(nóng)藥對(duì)人、畜、環(huán)境等的危害，保障我國(guó)水稻糧食的安全生產(chǎn)和增產(chǎn)，減少因化學(xué)農(nóng)藥的大量投入使用產(chǎn)生的環(huán)境污染等問(wèn)題。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
1.本發(fā)明的枯草芽孢桿菌T122F菌株,其16s rDNA序列如SEQID NO:1 所示。
[0009]2.本發(fā)明的枯草芽孢桿菌iBacillus subtilis)Tl22Y菌株，已經(jīng)于2009年4月19日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱CGMCC，保藏編號(hào)為:CGMCC N0.3043。
[0010]3.本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) T122F菌株形態(tài)學(xué)鑒定:如下表I中所示:
表1細(xì)胞形態(tài)和生理生化試驗(yàn)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種枯草芽孢桿菌，其特征在于:所述枯草芽孢桿菌T122F菌株的保藏號(hào)為CGMCCN0.3043，其 16s rDNA 序列如 SEQ ID NO:1 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于:所述枯草芽孢桿菌T122F菌株從香蕉植株體內(nèi)分離篩選獲得。
3.—種如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌應(yīng)用，其特征在于:所述枯草芽孢桿菌T122F菌株用于抑制水稻稻曲病菌的生長(zhǎng)及其病害的防治。
4.一種如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌的選育方法，其特征在于:選育方法為:切取健康香蕉植株假莖3-5g，用無(wú)菌水沖洗晾干后，用70% V/V酒精表面消毒20-40S后，再用0.1wt.%升萊表面消毒2-4min,無(wú)菌水沖洗3次后晾干；樣品加10_15ml無(wú)菌水碾碎,靜止15-20min，取50 μ L涂于KB培養(yǎng)基平板中，28°C黑暗培養(yǎng)48~72h，根據(jù)枯草芽孢桿菌的菌落形態(tài)、顏色等挑取單菌落，按常規(guī)方法用NA培養(yǎng)基進(jìn)行菌株純化和保存；菌株對(duì)稻曲病病原菌的生物測(cè)定采用平板對(duì)峙生長(zhǎng)法，即在直徑為9cm的PSA固體培養(yǎng)基平板中央接入直徑為8mm的病原真菌菌塊，同時(shí)在距菌塊兩側(cè)2cm處用接種環(huán)點(diǎn)接一小環(huán)在28°C、NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-26h的待測(cè)菌株菌落，接著28°C下黑暗培養(yǎng)6-8d，篩選獲得對(duì)稻曲病菌生長(zhǎng)具有明顯抑制作用的枯草芽孢桿菌T122F。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的枯草芽孢桿菌的選育方法，其特征在于:所述的KB培養(yǎng)基配方為:蛋白胨 20.0g, MgSO4.7H20 1.5g，K2HPO4.H2O 1.8g，甘油 10.0ml，瓊脂 16.0~18.0g,蒸餾水 1000.0ml, ρΗ7.0-7.2 ； 培養(yǎng)用的NA培養(yǎng)基配方為:蛋白胨5.0g，牛肉浸膏3.0g，葡萄糖2.5g，瓊脂16.0~18.0g,蒸餾水 1000.0ml, pH 7.0-7.2 ；` 對(duì)峙培養(yǎng)用的PSA固體培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯200.0g,蔗糖20.0g,瓊脂20g，蒸餾水1000.0ml, pH 7.0-7.2。
6.一種如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:所述枯草芽孢桿菌T122F菌株在抑制水稻稻曲病菌生長(zhǎng)作用中的具體步驟為: (1)T122F菌株培養(yǎng):將所述T122F菌株在37°C條件下用改良細(xì)菌發(fā)酵液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)3天，培養(yǎng)液含菌量約為50-100億活芽孢/mL，獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液4°C保存?zhèn)溆茫? (2)T122F無(wú)菌培養(yǎng)濾液制作:將所述T122F菌株在37°C條件下用改良細(xì)菌發(fā)酵液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)3天,發(fā)酵液用無(wú)菌的雙層濾紙過(guò)濾后,在1000Orpm條件下離心10-20min,取離心后的上清液，用0.22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，得到無(wú)菌體上清液，4°C保存?zhèn)溆茫? (3)稻曲病菌的分離和培養(yǎng):從水稻田中采集新鮮的黃色、黃綠色或綠色稻曲球，采用改良的厚垣孢子懸浮液法分離稻曲病菌；用無(wú)菌挑針刮取單粒稻曲球表面上的厚垣孢子粉，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入0.5mL的無(wú)菌水懸浮制成厚垣孢子懸浮液，將厚垣孢子懸浮液與無(wú)菌水按1:5比例稀釋2~3個(gè)梯度，用移液槍吸已稀釋好的厚垣孢子懸浮液0.2mL于分離用脅本哲氏固體培養(yǎng)基表面，并用無(wú)菌玻璃三角棒均勻涂抹，再將含有上述培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿倒置放入恒溫箱中28°C黑暗培養(yǎng)6-7天，用尖頭挑針挑取黃色或白色小菌落移至培養(yǎng)用PSA固體培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)10-11天；用直徑5 _的打孔器在分離到的稻曲病菌菌落邊緣打取菌餅，用接種針將菌餅3塊接入到PSB液體培養(yǎng)基中，28 V，150 rpm,恒溫振蕩培養(yǎng)7-8d，培養(yǎng)液中即產(chǎn)生大量的分生孢子；用雙層無(wú)菌紗布濾去菌絲，收集濾液，用無(wú)菌水稀釋孢子懸浮液，使分生孢子終濃度為4-6 X IO6個(gè)/mL，備用；(4)含稻曲病菌分生孢子培養(yǎng)基的制作:吸取步驟(3)中的稻曲病菌分生孢子懸浮液ImL加入45-55°C的99 mL PSA培養(yǎng)基中，混勻，然后倒入15-25 mL的培養(yǎng)基于直徑9cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，制成含病菌孢子的PSA平板； (5)T122F無(wú)菌培養(yǎng)濾液對(duì)稻曲病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用測(cè)定:在步驟(4)的含病菌孢子的PSA平板中央放置I個(gè)6mmX 8mmX IOmm無(wú)菌牛津杯，待牛津杯自然沉降10-15min，往每個(gè)牛津杯中加入步驟(2)的T122F無(wú)菌發(fā)酵濾液200 μ L，28 °C，黑暗培養(yǎng)4-5d后，測(cè)量各個(gè)處理的抑菌圈直徑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:所述的改良細(xì)菌發(fā)酵液體培養(yǎng)基配方組成為:豆柏40g，玉米粉20g，氯化鈉5g，乳糖2g，碳酸鈣2g，蛋白胨3g，酵母粉5g，硫酸亞鐵含七水0.3g，硫酸鎂0.5g，磷酸二氫鉀0.5g，加水定容至1000mL,pH6.5~6.8,在121°C下高壓濕熱滅菌35_45min備用； 脅本哲氏培養(yǎng)基的配方為:馬鈴薯300g、蛋白胨5g、蔗糖15g、Ca(NO3)2.4H20 0.5g、Na2HPO4.12H20 2.0g、瓊脂16g、加水定容至lOOOmL，在121°C下高壓濕熱滅菌20~25min，待培養(yǎng)基冷卻至45°C~50°C時(shí)加入抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的氯霉素50μ g/ml混勻，倒入培養(yǎng)皿中凝固后備用； PSA固體培養(yǎng)基的配方為:馬鈴薯200g、 瓊脂20g、蔗糖20g、加水定容至1000mL,在121°C下高壓濕熱滅菌20-30min后備用； PSB液體培養(yǎng)基的配方為:馬鈴薯200g、蔗糖20g、加水定容至1000mL,在121°C下高壓濕熱滅菌20-30min后備用。
8.—種如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:所述枯草芽孢桿菌T122F菌株在田間水稻稻曲病防治中的應(yīng)用，具體步驟為:將T122F發(fā)酵液與清水按1:100倍稀釋后，在水稻稻曲病常發(fā)病田進(jìn)行試驗(yàn)，在水稻破口前5~7d第一次用藥，在50%水稻齊穗后再次施藥一次；采用手動(dòng)噴霧器，全株均勻噴施，每公頃用水量750-800L ;在水稻黃熟期時(shí)調(diào)查不同處理的水稻稻的病穗數(shù)及病穗的病粒數(shù)。
【文檔編號(hào)】A01P3/00GK103627659SQ201310607370
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】楊秀娟, 陳福如, 甘林, 石妞妞, 阮宏椿, 杜宜新 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所