一種用于防治蘋果樹腐爛病的糖絲菌及其制備方法
【專利摘要】一種用于防治蘋果樹腐爛病的糖絲菌及其制備方法，本發(fā)明公開了一種楊凌糖絲菌（Saccharothrix?yanglingensis）的Hhs.015菌株，保藏編號為CGMCC?No.3023。楊凌糖絲菌（Saccharothrix?yanglingensis）Hhs.015菌株分泌的抗菌活性物質(zhì)主要為抗生素物質(zhì)，具有效果持久、植物不會產(chǎn)生藥害等特點，對蘋果樹腐爛病具有顯著的防治效果并有一定的促生作用。
【專利說明】一種用于防治蘋果樹腐爛病的糖絲菌及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種糖絲菌、其微生物制劑以及將其應(yīng)用于防治蘋果樹腐爛病的病害。
【背景技術(shù)】 [0002]由于化學(xué)農(nóng)藥的長期使用，使植物病害存在對殺菌劑的適應(yīng)性變異，在某些殺菌劑的長期選擇壓力下，可以產(chǎn)生明顯的抗藥性，從而導(dǎo)致化學(xué)防治的失敗。生產(chǎn)中應(yīng)綜合地考慮不同殺菌劑的應(yīng)用策略，以充分發(fā)揮各種殺菌劑的作用，盡量避免抗藥性的產(chǎn)生。放線菌是一種常見的拮抗微生物，有助于開發(fā)和利用這類微生物資源。放線菌與人類的生產(chǎn)和生活關(guān)系極為密切，目前廣泛應(yīng)用的抗生素約70%是各種放線菌所產(chǎn)生。內(nèi)生放線菌指存在于健康植物體內(nèi)，產(chǎn)生系列活性物質(zhì)并能與宿主植物共同生活的放線菌。它們的代謝活動及產(chǎn)物可促進宿主植物適應(yīng)外界各種(生物、非生物)環(huán)境壓力，維持生態(tài)系平衡。
[0003]蘋果是我國的重要經(jīng)濟作物和出口水果，栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位。然而，病害卻嚴(yán)重制約著我國蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，特別是蘋果樹腐爛病在我國分布廣、危害重、防治難，果農(nóng)將其稱之為蘋果樹“癌癥”。
[0004]目前蘋果樹腐爛病的防治方法主要有物理防治和化學(xué)防治?；瘜W(xué)農(nóng)藥的大量使用造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留，病菌抗藥性、耐藥性。這些問題已對人們的生活產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，而生物防治可以最大限度地減少化學(xué)農(nóng)藥的用量，以改善生態(tài)環(huán)境。農(nóng)用抗生素作為生物農(nóng)藥中的重要類群，較其它生物農(nóng)藥具有更高效、快速、安全等優(yōu)點，且均在農(nóng)作物病蟲害防治工作中發(fā)揮著重要作用。
[0005]但是，目前我國生物農(nóng)藥的市場占有率僅有2%~3%，其潛力遠沒有得到充分的開發(fā)和應(yīng)用。目前國內(nèi)尚無利用拮抗菌防治蘋果樹腐爛病的生防制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的旨在于探尋生物農(nóng)藥的新來源，利用內(nèi)生微生物資源而開發(fā)一種可以用于蘋果樹腐爛病害防治的高效、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的生防菌菌株。本發(fā)明提供了一種楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株以及該菌株的篩選、鑒定方法；進一步地，提供該菌株發(fā)酵工藝及抗菌活性物質(zhì)制備工藝，以及提供該菌株抗菌活性物質(zhì)防治蘋果樹腐爛病的應(yīng)用。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0008]本發(fā)明所述的楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株分離自溫室大棚內(nèi)黃瓜根部組織中，經(jīng)形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生理生化特性、細胞壁組分分析和16S rDNA同源性序列分析，確定該菌株為楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis)Hhs.015。具有以下特征:
[0009]1、菌株在高氏一號培養(yǎng)基上基內(nèi)菌絲杏黃色，氣生菌絲淺粉色，不產(chǎn)生可溶性色素；[0010]2、基生菌絲細長，舒展，發(fā)達；多分枝，無隔。氣生菌絲細密柔曲，頂部螺旋狀，生長不旺盛，易斷裂。培養(yǎng)后期，氣生菌絲成熟，分化成孢子鏈，少螺旋，松散；
[0011]3、生理生化反應(yīng)表現(xiàn)為:不能使牛奶凝固，也不能胨化，可使石蕊牛奶變紅；可水解淀粉；產(chǎn)卵磷脂酶；不產(chǎn)生硫化氫；產(chǎn)生黑色素；不能使明膠水解；產(chǎn)生纖維素酶；能還原硝酸鹽。生長溫度15~37 °C，最適生長溫度為28 0C ；能利用糊精、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、半乳糖、麥芽糖、甘油、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、肌醇、木糖、山梨醇；不能利用甘露糖、馬尿酸鈉、棉子糖。能以甘氨酸、丙氨酸、色氨酸為氮源；不能利用賴氨酸、L-半胱氨酸、胱氨酸、瓜氨酸、尿素、D, L-酪氨酸、天門冬氨酸；
[0012]4、16S rDNA序列分析結(jié)果在GeneBank中進行最大同源性比較,發(fā)現(xiàn)16S rDNA測序結(jié)果與糖絲菌屬16s rDNA序列同源性最大達到99%。
[0013]本發(fā)明所述的楊凌糖絲菌(Saccharothrixyanglingensis)Hhs.015 已于 2009 年04月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.3023。保藏期限30年，30年內(nèi)免費提供活菌。
[0014]本發(fā)明所制備的微生物制劑含有保藏編號為CGMCC N0.3023的楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015 的代謝產(chǎn)物。
[0015]制備具有保藏編號為CGMCC N0.3023的楊凌糖絲菌(Saccharothrixyanglingensis) Hhs.015的微生物制劑方法如下:
[0016]將-80 °C保藏的保藏編號為CGMCC N0.3023的楊凌糖絲菌(Saccharothrixyanglingensis)Hhs.015菌株接種在高氏一號培養(yǎng)基上,于28°C培養(yǎng)4天后,將其單菌落接種到IOOmL黃豆粉液體培養(yǎng)液中，于28°C、150rpm黑暗振蕩培養(yǎng)48小時，然后按照1%的種子液接種到IOOmL的黃豆粉培養(yǎng)液中，于28°C、150rpm黑暗振蕩培養(yǎng)120小時，所得發(fā)酵液經(jīng)5000rpm離心20min，取上清液即為無菌培養(yǎng)濾液。
[0017]根據(jù)試驗結(jié)果表明，以本發(fā)明保藏編號為CGMCC N0.3023的楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015制備的微生物制劑對蘋果樹腐爛病害有良好防治作用，并且對油菜菌核病、番茄灰霉病等也有較好的防治效果，具備了工業(yè)化生產(chǎn)的基本性狀。
[0018]需要說明的是，對本發(fā)明的抗菌活性物質(zhì)成分進行分析，包括通過硅膠柱、凝膠柱和反向柱技術(shù)所得，鑒定為抗生素類。
[0019]本發(fā)明有益效果在于，具有穩(wěn)定的天然原料來源，菌種來源于植物內(nèi)部，篩選方法簡單；發(fā)酵過程中所用原料主要有大豆粉和葡萄糖，成本較低；抗菌活性物質(zhì)制備簡單，操作方便，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，對光、熱、酸堿均有良好的穩(wěn)定性。本物質(zhì)對農(nóng)作物無藥害，綠色環(huán)保，防治蘋果樹腐爛病病害效果較好。
[0020]生物保藏信息說明:
[0021]分類命名:楊凌糖絲菌(Saccharothrixyanglingensis) Hhs.015 于 2009 年 04月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.3023。保藏期限30年，30年內(nèi)免費提供活菌?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明對蘋果樹腐爛病菌菌絲生長的抑制作用；
[0023]圖2為本發(fā)明對蘋果離體葉片接種處理后3天病斑擴展情況；
[0024]圖3為本發(fā)明對蘋果離體葉片接種處理后10天病斑擴展情況；
[0025]圖4為本發(fā)明施藥后各處理小區(qū)平均新生病疤數(shù)的周年消長情況；
[0026]圖5為實施例2中刮斑并涂抹本發(fā)明后病疤的平均愈合寬度。
【具體實施方式】
[0027]下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的描述。需要說明的是，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0028]需要說明的是，本發(fā)明楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis)Hhs.015的分
離與鑒定:
[0029]黃瓜根采自陜西楊凌高新技術(shù)示范區(qū)蔬菜大棚，用自來水沖洗后展開晾干，取植株的根段樣 品各稱取Ig進行表面消毒，其中使用99%乙醇中浸Imin,然后在3.125%的NaOCl中浸6min,再次放入99%乙醇中浸30sec,最后用無菌生理鹽水沖洗5次。將最后一次沖洗過的無菌水取200 UL涂在高氏一號平板上，用于檢測表面消毒是否徹底。取消毒后的材料用無菌手術(shù)刀切成0.5X0.5_大小的薄片，將表面消毒后的黃瓜根薄片，置于含有高氏一號平板上，28±1°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21d后統(tǒng)計放線菌菌落數(shù)并進行純化，可分離到楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株,將所得菌株采用甘油法保藏于-80°C冰箱。
[0030]根據(jù)內(nèi)生楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株對蘋果樹腐爛病的離體試驗調(diào)查結(jié)果，篩選到一種高效防病的活性菌株，經(jīng)菌落和形態(tài)的顯微觀察、細胞化學(xué)組成分析、常規(guī)生理生化特性實驗、16S rDNA序列分析，該菌株鑒定為的一個糖絲菌屬菌株楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis)。
[0031]根據(jù)上述所得的楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株制備其菌體的方法:
[0032]將一80°C保藏的楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis)Hhs.015 菌株接種在高氏一號培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)4d后，將其單菌落接種到IOOmL黃豆粉液體培養(yǎng)液中，于280C、150rpm黑暗振蕩培養(yǎng)48小時，然后按照1%的種子液接種到IOOmL的黃豆粉液體培養(yǎng)液中，于28°C、150rpm黑暗振蕩培養(yǎng)120小時，發(fā)酵液經(jīng)5000rpm離心20min后，所得沉淀物即為楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株的菌體。
[0033]需要說明的是，所述的黃豆粉液體培養(yǎng)液由豆粉20g (沸水煮30min，過濾保留濾液)，蔗糖 10g，可溶性淀粉 5g，蛋白胨 2g，酵母膏 2g，NaC12g, CaCO3Ig, MgSO4 ? 7H200.5g，KH2PO40.5g，瓊脂 15g，H2OlOOOmL 組成，且 pH 值為 7.2。
[0034]進一步地,本發(fā)明所述楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis)Hhs.015菌株的抗菌活性物質(zhì)的制備方法為:
[0035]將-80°C保藏的楊凌糖絲菌(Saccharothrixyanglingensis) Hhs.015 菌株接種在高氏一號培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)4天后，將其單菌落接種到IOOmL黃豆粉液體培養(yǎng)液中，于28°C、150rpm黑暗振蕩培養(yǎng)48小時，然后按照1%的種子液接種到IOOmL的黃豆粉培養(yǎng)液中，于28°C、150rpm黑暗振蕩培養(yǎng)120小時，所得菌液經(jīng)5000rpm離心20min，取上清液即為
無菌培養(yǎng)濾液。
[0036]其中，所述黃豆粉培養(yǎng)液包括豆粉2%、葡萄糖2%、NaCl0.8%、CaCO30.2%、(NH4)2SO40.32%，起始 pH7.0。
[0037]將本發(fā)明所述的楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株活性物質(zhì)進行分析，包括多種層析技術(shù)分離提純，得到淡黃色粉末狀純品，經(jīng)鑒定為抗生素類物質(zhì)。
[0038]進一步地，如圖1中的A、B、C、D所示，其中A為楊凌糖絲菌(Saccharothrixyanglingensis) Hhs.015瓊脂塊對蘋果腐爛病菌的抑制作用；B是光鏡下蘋果腐爛病菌菌絲；C和D分別是用本發(fā)明處理后蘋果腐爛病菌菌絲出現(xiàn)膨脹和原生質(zhì)滲出。
[0039]如圖2所示，離體葉片接種后，對照組發(fā)病快速、病斑擴展速度快，3天病斑直徑達到20.3mm ;楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis)Hhs.015發(fā)酵液原液處理組，發(fā)病緩慢，有的重復(fù)甚至不發(fā)病，3天后病斑直徑僅4.23mm。
[0040]如圖3所示，離體葉片接種后，對照組10天后病斑上出現(xiàn)大量孢子器；而楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015發(fā)酵液原液處理組沒有產(chǎn)抱；苯醚甲環(huán)唑處理組，不產(chǎn)孢。
[0041]為了進一步描述本發(fā)明的效果，下面將結(jié)合具體實施例進行分析。
[0042]實施例1
[0043]楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株代謝活性物質(zhì)對蘋果樹腐爛病的田間預(yù)防試驗。
[0044]處理:發(fā)病對照(刮除病疤涂無菌水)；Hhs.015發(fā)酵液原液,5倍液涂樹干；10%世高(苯醚甲環(huán)唑)水分散粒劑，500倍涂樹干；45%代森銨水劑(施那寧)，500倍涂樹干；43%好力克(戊唑醇)懸浮劑，1000倍涂樹干。
[0045]選取小區(qū)進行試驗，設(shè)三次重復(fù)，每重復(fù)小區(qū)至少有5個腐爛病斑，10棵樹，病疤在調(diào)查以后都統(tǒng)一刮除，之后所有樹體(無論有無病斑、新舊病斑)按處理進行中心干涂藥統(tǒng)一涂至離地面2米高，大枝離分叉點0.4米。排列根據(jù)果園情況進行，其他管理措施按常規(guī)統(tǒng)一進行。
[0046]每個時間分別選取小區(qū)進行試驗，在每個施藥時間開始涂藥，間隔15d，3次藥后調(diào)查記錄不同時期所選小區(qū)的新生病斑數(shù)，并統(tǒng)計預(yù)防效果。
[0047]如圖4所示，在2010年4月、6月、9月及11月涂抹本發(fā)明發(fā)酵液，都能夠明顯減少新生病疤數(shù)的產(chǎn)生，且持效期長，I年之后的防效均穩(wěn)定在50%以上，顯著高于化學(xué)藥劑戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑及代森銨對照，其中2010年4月施用后，I年的防效高達74.42%。
[0048]實施例2
[0049]楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株代謝活性物質(zhì)對蘋果樹腐爛病的田間刮斑治療試驗。
[0050]處理:對照(刮除病疤涂無菌水);Hhs.015發(fā)酵液原液；10%世高(苯醚甲環(huán)唑)，100倍涂斑；45%代森銨水劑(代森銨)，100倍涂斑；海島素(殼寡糖)，1000倍涂斑，43%好力克(戊唑醇)懸浮劑，200倍涂斑。[0051]采用刮除病斑法:每處理設(shè)三次重復(fù)，每重復(fù)7個病斑，施藥前將病斑部位及其周邊2cm處的健康部位用刀立刮刮至韌皮部，周圍露出健康組織，然后用毛刷將攪拌均勻的處理藥劑涂抹于傷口處及周圍3cm范圍內(nèi)的健康樹皮上，其他管理措施按常規(guī)統(tǒng)一進行。
[0052]4月刮除病斑后涂抹處理藥劑，間隔15d涂抹I次，共涂藥3次，分別在2個月、6個月、9個月后調(diào)查記錄各處理病斑的愈和寬度及復(fù)發(fā)情況。
[0053]如圖5所示了不同時間的調(diào)查結(jié)果，其中，殼寡糖處理組愈合效果最好，9個月后的愈合寬度達到8.5mm ;本發(fā)明發(fā)酵液原液效果次之，9個月的愈合寬度為6.54mm，高于化學(xué)藥劑戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑及代森銨對照。同時，病疤復(fù)發(fā)情況調(diào)查結(jié)果顯示，施藥9個月后，戊唑醇及殼寡糖處理組的復(fù)發(fā)率最低，相對防效達到77.42%;其次是苯醚甲環(huán)唑及本發(fā)明發(fā)酵液原液，相對防效為61.29%o
[0054]對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis)的菌株Hhs.015,其特征在于,保藏編號為 CGMCC N0.3023。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述菌株的微生物制劑，其特征在于，所述微生物制劑含有保藏編號 CGMCC N0.3023 的楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015 的代謝產(chǎn)物。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物制劑的制備方法，其特征在于，將_80°C保藏的保藏編號為 CGMCC N0.3023 的楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015 菌株接種在高氏一號培養(yǎng)基上，于28°C培養(yǎng)4天后，將其單菌落接種到IOOmL黃豆粉液體培養(yǎng)液中，于28°C、150rpm黑暗振蕩培養(yǎng)48小時，然后按照1%的種子液接種到IOOmL的黃豆粉培養(yǎng)液中，于28°C、150rpm黑暗振蕩培養(yǎng)120小時，所得發(fā)酵液經(jīng)5000rpm離心20min，取上清液即為無菌培養(yǎng)濾液。
4.以保藏編號為CGMCC N0.3023 的楊凌糖絲菌(Saccharothrix yanglingensis)Hhs.015菌株的代謝產(chǎn)品成份所制備的微生物制劑用于防治蘋果樹腐爛病的病害。
【文檔編號】A01P3/00GK103667116SQ201310571781
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日
【發(fā)明者】黃麗麗, 顏霞, 高小寧, 涂璇, 李正鵬, 康振生 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)