一種霍山石斛種苗無激素快速培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種霍山石斛種苗無激素快速培養(yǎng)方法，本方法從霍山采摘生長100天左右尚未完全成熟的霍山石斛果莢，以果莢里乳白色粉末狀的幼胚為外植體。采用優(yōu)化的新型培養(yǎng)基，與經典的MS培養(yǎng)基相比，無機鹽等化學物、糖的用量少，針對培養(yǎng)的不同階段在培養(yǎng)基中分別添加山芋泥、麩皮糊、香蕉皮勻漿液等食用或廢棄物，碳源采用市售食用白糖，不添加激素。培養(yǎng)6個月種苗健壯，每棵苗高3-4厘米、具有3-4個節(jié)、6-8片葉、4-5條根、根長2-4厘米，移栽成活率達95%以上。之后轉入原產地自然環(huán)境中栽培，可以保持野生石斛品質。幼胚繁殖率高，種苗繁殖周期縮短，培養(yǎng)基成本低，提高了山芋、麩皮、香蕉皮（廢棄物）的利用價值，優(yōu)化的培養(yǎng)基適用于大規(guī)模工廠化生產。
【專利說明】一種霍山石斛種苗無激素快速培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種霍山石斛種苗無激素快速培養(yǎng)方法，屬于植物生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]霍山石斛是屬于國家一級保護珍稀中藥材?！侗静菥V目》記載:霍山石斛具有強陰益精，厚胃腸，補內絕不足，平胃氣，長肌肉，益智除驚，輕身延年之功效?；羯绞缓嗵?、生物堿、氨基酸等物質?，F(xiàn)代藥理研究表明:霍山石斛具有抗腫瘤、降血糖，能提高肌體免疫力，兼有藥用與營養(yǎng)保健作用，老少皆宜。
[0003]霍山石斛生長環(huán)境條件要求苛刻，自然繁殖緩慢，種子極小、無胚乳，自然狀態(tài)下很難萌發(fā)，野生資源瀕臨滅絕。已有許多學者對霍山石斛進行組織培養(yǎng)技術研究，培育出種苗。在現(xiàn)有技術中，多采用MSU/2MS培養(yǎng)基或改良的培養(yǎng)基，并添加一定量的激素。外源激素影響石斛的品質，種苗繁殖周期長(需8個月左右)，種苗成本高，每棵售價I元。因此， 研究霍山石斛種苗快速培養(yǎng)方法，優(yōu)化出不加激素，繁殖速度又快、價格低，能保持野生石斛品質的培養(yǎng)基，是解決霍山石斛產業(yè)化的重要課題。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種霍山石斛種苗無激素快速培養(yǎng)方法，該方法不添加激素，能保持野生石斛品質，且繁殖速度又快、價格低。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下:一種霍山石斛種苗無激素快速培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
(1)原球莖培養(yǎng)
①選擇外植體
從霍山采摘生長100天左右尚未完全成熟的霍山石斛果莢，先用1%的洗潔精浸泡 10-15min，然后用流水刷洗干凈；
②滅菌
將洗凈的果莢放入超凈工作臺無菌燒杯中，先用75%的酒精浸泡30-60s，無菌水沖洗I 次，再用5%的次氯酸鈉溶液浸泡20-30min，無菌水沖洗2_3次。
[0005]③接種培養(yǎng)
嚴格無菌操作，解剖刀沿果莢縱向切開，乳白色粉末狀的幼胚直接接種在I號培養(yǎng)基: 營養(yǎng)元素母液100ml/L+山芋泥100g/L+麩皮糊10g/L+白糖10g/L+瓊脂8g/L，幼胚在培養(yǎng)基的表面分散均勻，密而不成團，一個果莢可以接種4瓶。培養(yǎng)條件:室內溫度24-28°C，第一周暗培養(yǎng)，以后每天自然光照，培養(yǎng)10天，幼胚變成乳黃色開始脹大，培養(yǎng)20天發(fā)育成黃綠色的顆粒狀，培養(yǎng)30天頂端長出很小的綠色的葉原基，培養(yǎng)45天發(fā)育成基部有絲狀物翠綠的原球莖；
(2)分化葉培養(yǎng)
在超凈工作臺的無菌區(qū)，接種鏟從母瓶取出原球莖(不要鏟到培養(yǎng)基)接入2號培養(yǎng)基:營養(yǎng)元素母液100ml/L+山芋泥100g/L +麩皮糊10g/L +白糖20g/L +瓊脂8g/L中培養(yǎng)分化芽，I個母瓶可以接種5-6瓶，每瓶接種I鏟，原球莖在培養(yǎng)基的表面分散均勻，彼此間距2mm。培養(yǎng)條件:室內溫度24-28°C，自然光照，培養(yǎng)15天長出第一片葉，培養(yǎng)30天長出第二片葉，培養(yǎng)45天發(fā)育為高1.0-1.5cm健壯翠綠的小苗；
(3)繼代培養(yǎng)
用無菌圓頭鑷子輕輕取出小苗接入3號培養(yǎng)基:營養(yǎng)元素母液100ml/L+山芋泥50g/L+麩皮糊10g/L+香蕉皮勻漿液100g/L +白糖10g/L+瓊脂8g/L，I個母瓶可以接種9-10瓶，小芽在培養(yǎng)基的表面分散均勻，彼此間距5mm，培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)45天左右，長成苗高2-2.5cm,3-4片葉、2個節(jié)的大苗；(4)分化根培養(yǎng)
從母瓶里取出大苗先放在培養(yǎng)皿中，輕輕剔除基部附著的培養(yǎng)基并分散開，接入4號培養(yǎng)基:營養(yǎng)元素母液50ml/L+山芋泥50g/L+麩皮糊10g/L+香蕉皮勻漿液80g/L+白糖 10g/L+瓊脂8g/L，進行生根培養(yǎng)，250 ml三角瓶接種20-22棵，650 ml組培瓶接種25-26 棵，每棵間距I cm，輕按苗基部接觸培養(yǎng)基即可。每個母瓶可以接種12-15瓶。培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)12天就有根萌發(fā)，培養(yǎng)50天左右，生長成健壯的完整植株，生根率為100%，每棵苗高3-3.5cm, 6-8片葉，3-5條根，根長2_3cm，根粗壯；
(5)煉苗與移栽
①煉苗
選取苗高3-3.5cm,具有6-8片葉、3-5條根的健壯試管苗，打開封口膜，在溫度20_30°C 室內自然光下煉苗5-7天；
②移栽
取出試管苗，洗凈根部附著的培養(yǎng)基，將根部浸入0.5%KMn04溶液中浸泡4-6min，取出等根表面水分晾干；
栽培基質為:水苔、小石子、栗粉，栽培容器小塑料杯，水苔用1%1^1104溶液浸泡 20-30min后用洗衣機甩干,石子提前用水浸泡3_5h ；
1-2棵石斛為一簇將根捋順，用一小縷水苔將其根部包裹，水苔以此為中心纏繞，每纏繞1.5cm包裹進1-2棵石斛，莖基部不能包裹，松緊適中，包裹的大小與小塑料杯直徑相當， 放進塑料杯前杯底部先放少許的栗粉，上面用已浸泡好的小石子固定，放入室內，保持環(huán)境溫度為20-30°C，自然光照射，第一周不能澆水，每天用噴霧器噴霧2-3次，前兩周保持濕度為60-70%，以后逐漸降低濕度、每周澆水一次、一次性澆透，一個月后統(tǒng)計苗的成活率。
[0006]所述營養(yǎng)元素母液的制備方法如下:稱取10_12g硝酸鉀、S-1Og硝酸鈣、1.5_2g磷酸二氫鉀、2-2.5g硫酸鎂，先分別用少量超純水充分溶解后混合，然后用1000ml容量瓶定容即可。
[0007]所述山芋的預處理如下:將山芋削去皮，稱取400_500g，切成4cm*2cm*lcm的小片，加入1000-1500ml水煮熟，冷卻后用組織勻漿機在5000-6000r/min速度下勻漿3-5min， 加水定容到2000ml即得山芋泥；每克山芋相當于4-5毫升的山芋泥。
[0008]所述麩皮的預處理如下:將麩皮先在干燥箱60-70°C下干燥l_2h后，用固體粉碎機在10000-15000r/min速度下粉碎5_10min，過50-60目不銹鋼面粉篩，稱取100_200g加 600-800ml水一起放在不銹鋼鍋中煮，先高溫煮沸再低溫悶20-30min，加水定容到1000ml即得麩皮糊；每克麩皮相當于5-10毫升的麩皮糊。
[0009]所述香蕉皮的預處理如下:稱取香蕉皮100_200g加入300_500ml水，用組織勻漿機在4000-5000r/min速度下勻衆(zhòng)5_8min,將香蕉皮勻衆(zhòng)液用4層紗布過濾,勻衆(zhòng)液收集于 1000ml燒杯中，加水至800ml即得香蕉皮勻漿液，每克香蕉皮相當于4_8毫升的香蕉皮勻漿液。
[0010]所述培養(yǎng)基的配制方法如下:
(1)按培養(yǎng)基配方稱取瓊脂條、白糖，量取山芋泥、麩皮糊、香蕉皮勻漿液、營養(yǎng)元素母液備用；
(2)用搪瓷缸量取200-250ml純水在電磁爐上加熱至沸騰，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀，加入白糖，攪拌至溶解；加入山芋泥、麩皮糊、香蕉皮勻漿液， 邊加熱邊用玻璃棒攪拌均勻；最后加入營養(yǎng)元素母液，充分混合均勻；
(3)用Imol的NaOH或HCl溶液調pH值，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，使其充分混合，pH調節(jié)至6.2-6.5，，然后加純水在錐形瓶中定容到1000ml ；
(4)溶化的培養(yǎng)基趁熱分裝。用玻璃棒引流倒入錐形瓶中，不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上，100ml錐形瓶中培養(yǎng)基的量為40-50ml，每IL培養(yǎng)基可分裝20-25瓶，用封口膜封口外加一層牛皮紙，扎好繩子，用碳素墨水筆標注培養(yǎng)基編號；
(5)培養(yǎng)基采用高壓蒸汽滅菌，在120-125°C下滅菌15-20min;滅菌后的培養(yǎng)基趁熱平放在實驗臺上，自然冷卻，3-4天后即可接種。
[0011]本發(fā)明的有益效果:
本方法從霍山采摘生長100天左右尚未完全成熟的霍山石斛果莢，以果莢里乳白色粉末狀的幼胚為外植體。采用優(yōu)化的新型培養(yǎng)基，與經典的MS培養(yǎng)基相比，無機鹽、糖的用 量少，針對培養(yǎng)的不同階段在培養(yǎng)基中分別添加山芋泥、麩皮糊、香蕉皮勻漿液等，碳源采用市售食用白糖，不添加激素，培養(yǎng)6個月種苗健壯，每棵苗高3-4厘米、具有3-4個節(jié)、6-8 片葉、4-5條根、根長2-4厘米，移栽成活率達95%以上。之后轉入原產地自然環(huán)境中栽培， 可以保持野生石斛品質。幼胚繁殖率高，種苗繁殖周期縮短，培養(yǎng)基成本低，提高了山芋、麩皮、香蕉皮(廢棄物)的利用價值，優(yōu)化的培養(yǎng)基適用于大規(guī)模工廠化生產。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為霍山石斛幼胚發(fā)育形成原球莖顯微拍照圖，其中(I)為培養(yǎng)20天的原球莖，
(2)為培養(yǎng)30天的原球莖，(3)為培養(yǎng)40天的原球莖。
[0013]圖2為原球莖分化形成的葉，其中(I)為培養(yǎng)20天的原球莖分化，(2)為培養(yǎng)40 天原球莖分化發(fā)育的小苗。
[0014]圖3為繼代培養(yǎng)后的大苗。
[0015]圖4為培養(yǎng)生根后的完整植株。
【具體實施方式】
[0016]一種霍山石斛種苗無激素快速培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
(I)原球莖培養(yǎng)
①選擇外植體從霍山采摘生長100天左右尚未完全成熟的霍山石斛果莢，先用1%的洗潔精浸泡 lOmin，然后用流水刷洗干凈；
②滅菌
將洗凈的果莢放入超凈工作臺無菌燒杯中，先用75%的酒精浸泡30s，無菌水沖洗I次， 再用5%的次氯酸鈉溶液浸泡20min,無菌水沖洗2次。
[0017]③接種培養(yǎng)
嚴格無菌操作，解剖刀沿果莢縱向切開，乳白色粉末狀的幼胚直接接種在I號培養(yǎng)基: 營養(yǎng)元素母液100ml/L+山芋泥100g/L+麩皮糊10g/L+白糖10g/L+瓊脂8g/L，幼胚在培養(yǎng)基的表面分散均勻，密而不成團，一個果莢可以接種4瓶。培養(yǎng)條件:室內溫度26°C，第一周暗培養(yǎng)，以后每天自然光照，培養(yǎng)10天，幼胚變成乳黃色開始脹大，培養(yǎng)20天發(fā)育成黃綠色的顆粒狀，培養(yǎng)30天頂端長出很小的綠色的葉原基，培養(yǎng)45天發(fā)育成基部有絲狀物翠綠的原球莖(圖1);
(2)分化葉培養(yǎng)
在超凈工作臺的無菌區(qū)，接種鏟從母瓶取出原球莖(不要鏟到培養(yǎng)基)接入2號培養(yǎng)基: 營養(yǎng)元素母液100ml/L+山芋泥100g/L +麩皮糊10g/L +白糖20g/L +瓊脂8g/L中培養(yǎng)分化葉，I個母瓶可以接種6瓶，每瓶接種I鏟，原球莖在培養(yǎng)基的表面分散均勻，彼此間距 2mm。培養(yǎng)條件:室內溫度26°C，自然光照，培養(yǎng)15天長出第一片葉，培養(yǎng)30天長出第二片葉，培養(yǎng)45天發(fā)育為高Icm健壯翠綠的小苗(圖2)；
(3)繼代培養(yǎng)
用圓頭鑷子輕輕取出小苗接入3號培養(yǎng)基:營養(yǎng)元素母液100ml/L+山芋泥50g/L+麩皮糊10g/L+香蕉皮勻漿液100g/L +白糖10g/L+瓊脂8g/L，I個母瓶可以接種10瓶，小苗在培養(yǎng)基的表面分散均勻，彼此間距5mm，培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)45天長成苗高2cm，4片葉、2 個節(jié)的大苗(圖3);
(4)分化根培養(yǎng)
從母瓶里取出大苗先放在培養(yǎng)皿中，輕輕剔除基部附著培養(yǎng)基并分散開，接入4號培養(yǎng)基:營養(yǎng)元素母液50ml/L+山芋泥50g/L+麩皮糊10g/L+香蕉皮勻漿液80g/L+白糖IOg/ L+瓊脂8g/L，進行生根培養(yǎng)，250 ml三角瓶接種20棵，650 ml組培瓶接種25棵，每棵間距 I cm,輕按苗基部接觸培養(yǎng)基即可。培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)12天就有根萌發(fā)，培養(yǎng)50天生長成健壯完整植株(圖4)，生根率為100%，每棵苗高3cm，6片葉，3_5條根，根長2_3cm，根粗壯；
(5)煉苗與移栽
①煉苗
選取苗高約4cm，具有6片葉、平均有4條根的健壯試管苗，打開封口膜，在溫度 22-30°C室內自然光下煉苗6天；
②移栽
取出試管苗，洗凈根部附著的 培養(yǎng)基，將根部浸入0.5%KMn04溶液中浸泡5min，取出等根表面水分晾干；
栽培基質為:水苔、小石子、栗粉，栽培容器為小塑料杯(底有排水篩孔)，水苔用 l%KMn04溶液浸泡30min后用洗衣機甩干,石子提前用水浸泡4h ；2棵石斛為一簇將根捋順，用一小縷水苔將其根部包裹，水苔以此為中心纏繞，每纏繞
1.5cm包裹進2棵石斛，莖基部不能包裹，松緊適中，包裹的大小與小塑料杯直徑相當，放進塑料杯前杯底部先放2g栗粉，上面用已浸泡好的小石子固定，放入室內，保持環(huán)境溫度為 20-30°C,自然光照射，第一周不能澆水，每天用噴霧器噴霧2次，前兩周保持濕度為65%，以后逐漸降低濕度、每周澆水一次、一次性澆透，一個月后統(tǒng)計苗的成活率達95%以上。
[0018]上述營養(yǎng)元素母液的制備方法如下:用感量為0.01g的電子天平稱取IOg硝酸鉀、Sg硝酸鈣、1.6g磷酸二氫鉀、2g硫酸鎂，先分別用少量超純水充分溶解后混合，然后用 1000ml容量瓶定容即可。
[0019]上述山芋的預處理如下:將山芋削去皮，稱取500g,切成4cm*2cm*lcm的小片，加 A 1500ml水煮熟，冷卻后用組織勻漿機在5000r/min速度下勻漿5min，加水定容到2000ml
即得山芋泥；每克山芋相當于4毫升的山芋泥。
[0020]上述麩皮的預處理如下:將麩皮先在干燥箱70°C下干燥Ih后，用固體粉碎機在 15000r/min速度下粉碎5min，過60目不銹鋼面粉篩，稱取100g加600ml水一起放在不銹鋼鍋中煮，先高溫煮沸再低溫悶20min，加水定容到1000ml即得麩皮糊；每克麩皮相當于10
毫升的麩皮糊。
[0021]上述香蕉皮的預處理如下:稱取香蕉皮200g加入500ml水，用組織勻漿機在 5000r/min速度下勻衆(zhòng)5min,將香蕉皮勻衆(zhòng)液用4層紗布過濾,勻衆(zhòng)液收集于1000ml燒杯中，加水至800ml即得香蕉皮勻漿液，每克香蕉皮相當于4毫升的香蕉皮勻漿液。
[0022]上述培養(yǎng)基的配制方法如下:
(1)按培養(yǎng)基配方稱取瓊脂條、白糖，量取山芋泥、麩皮糊、香蕉皮勻漿液、營養(yǎng)元素母液備用；
(2)用搪瓷缸量取200ml純水在電磁爐上加熱至沸騰，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀，加入白糖，攪拌至溶解；加入山芋泥、麩皮`糊、香蕉皮勻漿液，邊加熱邊用玻璃棒攪拌均勻；最后加入營養(yǎng)元素，充分混合均勻；`
(3)用Imol的NaOH或HCl溶液調pH值，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，使其充分混合，pH調節(jié)至6.2-6.5，然后加純水在錐形瓶中定容到1000ml ；
(4)溶化的培養(yǎng)基趁熱分裝。用玻璃棒引流倒入錐形瓶中，不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上，100ml錐形瓶中培養(yǎng)基的量為40-50ml，每IL培養(yǎng)基可分裝20-25瓶，用封口膜封口外加一層牛皮紙，扎好繩子，用碳素墨水筆標注培養(yǎng)基編號；
(5)培養(yǎng)基采用高壓蒸汽滅菌，在121°C下滅菌19min;滅菌后的培養(yǎng)基趁熱平放在實驗臺上，自然冷卻，3天后即可接種。
【權利要求】
1.一種霍山石斛種苗無激素快速培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)原球莖培養(yǎng)①選擇外植體從霍山采摘生長100天左右尚未完全成熟的霍山石斛果莢，先用1%的洗潔精浸泡 10-15min，然后用流水刷洗干凈；②滅菌將洗凈的果莢放入超凈工作臺無菌燒杯中，先用75%的酒精浸泡30-60s，無菌水沖洗I 次，再用5%的次氯酸鈉溶液浸泡20-30min，無菌水沖洗2_3次；③接種培養(yǎng)嚴格無菌操作，解剖刀沿果莢縱向切開，乳白色粉末狀的幼胚直接接種在I號培養(yǎng)基: 營養(yǎng)元素母液100ml/L+山芋泥100g/L+麩皮糊10g/L+白糖10g/L+瓊脂8g/L，幼胚在培養(yǎng)基的表面分散均勻，密而不成團，一個果莢可以接種4瓶；培養(yǎng)條件:室內溫度24-28°C，第一周暗培養(yǎng)，以后每天自然光照，培養(yǎng)10天，幼胚變成乳黃色開始脹大，培養(yǎng)20天發(fā)育成黃綠色的顆粒狀，培養(yǎng)30天頂端長出很小的綠色的葉原基，培養(yǎng)45天發(fā)育成基部有絲狀物翠綠的原球莖；(2)分化葉培養(yǎng)在超凈工作臺的無菌區(qū)，接種鏟從母瓶取出原球莖(不要鏟到培養(yǎng)基)接入2號培養(yǎng)基: 營養(yǎng)元素母液100ml/L+山芋泥100g/L+麩皮糊10g/L +白糖20g/L +瓊脂8g/L中培養(yǎng)分化芽，I個母瓶可以接種5-6瓶，每瓶接種I鏟，原球莖在培養(yǎng)基的表面分散均勻，彼此間距 2mm ；培養(yǎng)條件:室內溫度24-28°C，自然光照，培養(yǎng)15天長出第一片葉，培養(yǎng)30天長出第二片葉，培養(yǎng)45天長成高1.0-1.5cm健壯翠綠的小苗；(3)繼代培養(yǎng)用無菌圓頭鑷子輕輕取出小苗接入3號培養(yǎng)基:營養(yǎng)元素母液100ml/L+山芋泥50g/L+麩皮糊10g/L+香蕉皮勻漿液100g/L+白糖10g/L+瓊脂8g/L，I個母瓶可以接種9-10瓶，小芽在培養(yǎng)基的表面分散均勻，彼此間距5mm，培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)45天左右，長成苗高2-2.5cm,3-4片葉、2個節(jié)的大苗；(4)分化根培養(yǎng)從母瓶里取出大苗先放在培養(yǎng)皿中，輕輕剔除基部附著的培養(yǎng)基并分散開，接入4號培養(yǎng)基:營養(yǎng)元素母液50ml/L+山芋泥50g/L+麩皮糊10g/L+香蕉皮勻漿液80g/L+白糖 10g/L+瓊脂8g/L，進行生根培養(yǎng)，250 ml三角瓶接種20-22棵，650 ml組培瓶接種25-26 棵，每棵間距I cm，輕按苗基部接觸培養(yǎng)基即可；每個母瓶可以接種12-15瓶；培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)12天就有根萌發(fā)，培養(yǎng)50天左右，生長成健壯的完整植株，生根率為100%，每棵苗高3-3.5cm, 6-8片葉，3-5條根，根長2_3cm，根粗壯；(5)煉苗與移栽①煉苗選取苗高3-4cm，具有6-8片葉、3-5條根的健壯試管苗，打開封口膜，在溫度20_30°C室內自然光下煉苗5-7天；②移栽取出試管苗，洗凈根部附著的培養(yǎng)基，將根部浸入0.5%KMn04溶液中浸泡4-6min，取出等根表面水分晾干；栽培基質為:水苔、小石子、栗粉，栽培容器小塑料杯，水苔用1%1^1104溶液浸泡 20-30min后用洗衣機甩干,石子提前用水浸泡3_5h ；1-2棵石斛為一簇將根捋順，用一小縷水苔將其根部包裹，水苔以此為中心纏繞，每纏繞1.5cm包裹進1-2棵石斛，莖基部不能包裹，松緊適中，包裹的大小與小塑料杯直徑相當， 放進塑料杯前杯底部先放少許的栗粉，上面用已浸泡好的小石子固定，放入室內，保持環(huán)境溫度為20-30°C，自然光照射，第一周不能澆水，每天用噴霧器噴霧2-3次，前兩周保持濕度為60-70%，以后逐降低濕度、每周澆水一次、一次性澆透，一個月后統(tǒng)計苗的成活率。
2.根據權利要求1所述的一種霍山石斛種苗無激素快速培養(yǎng)方法，其特征在于，所述營養(yǎng)元素母液的制備方法如下:稱取10-12g硝酸鉀、S-1Og硝酸鈣、1.5-2g磷酸二氫鉀、 2-2.5g硫酸鎂，先分別用少量超純水充分溶解后混合，然后用1000ml容量瓶定容即可。
3.根據權利要求1所述的一種霍山石斛種苗無激素快速培養(yǎng)方法，其特征在于，所述山芋的預處理如下:將山芋削去皮，稱取400-500g，切成4cm*2cm*lcm的小片，加入 1000-1500ml水煮熟，冷卻后用組織勻漿機在5000-6000r/min速度下勻漿3_5min，加水定容到2000ml即得山芋泥；每克山芋相當于4-5毫升的山芋泥。
4.根據權利要求1所述的一種霍山石斛種苗無激素快速培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述麩皮的預處理如下:將麩皮先在干燥箱60-70°C下干燥l_2h后，用固體粉碎機在 10000-15000r/min速度下粉碎5-lOmin，過50-60目不銹鋼面粉篩，稱取100_200g加 600-800ml水一起放在不銹鋼鍋中煮，先高溫煮沸再低溫悶20-30min，加水定容到1000ml 即得麩皮糊；每克麩皮相當于5-10毫升的麩皮糊。
5.根據權利要求1所述的一種霍山石斛種苗無激素快速培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述香蕉皮的預處理如下:稱取香蕉皮100-200g加入300-500ml水，用組織勻漿機在 4000-5000r/min速度下勻漿5_8min，將香蕉皮勻漿液用4層紗布過濾，勻漿液收集于 1000ml燒杯中，加水至800ml即得香蕉皮勻漿液，每克香蕉皮相當于4_8毫升的香蕉皮勻漿液。
6.根據權利要求1所述的一種霍山石斛種苗無激素快速培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基的配制方法如下:(1)按培養(yǎng)基配方稱取瓊脂條、白糖，量取山芋泥、麩皮糊、香蕉皮勻漿液、營養(yǎng)元素母液備用；(2)用搪瓷缸量取200-250ml純水在電磁爐上加熱至沸騰，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀，加入白糖，攪拌至溶解；加入山芋泥、麩皮糊、香蕉皮勻漿液， 邊加熱邊用玻璃棒攪拌均勻；最后加入營養(yǎng)元素母液，充分混合均勻；(3)用Imol的NaOH或HCl溶液調pH值，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，使其充分混合，pH調節(jié)至6.2-6.5，，然后加純水在錐形瓶中定容到1000ml ；(4)溶化的培養(yǎng)基趁熱分裝；用玻璃棒引流倒入錐形瓶中，不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上，100ml錐形瓶中培養(yǎng)基的量為40-50ml，每IL培養(yǎng)基可分裝20-25瓶，用封口膜封口外加一層牛皮紙，扎好繩子，用碳素墨水筆標注培養(yǎng)基編號；(5)培養(yǎng)基采用高壓蒸汽滅菌，在120-125°C下滅菌15-20min ;滅菌后的培養(yǎng)基趁熱平放在實驗臺上，自然冷卻，3-4天后即可接種?！?br> 【文檔編號】A01G31/00GK103583364SQ201310566691
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月14日 優(yōu)先權日:2013年11月14日
【發(fā)明者】樊家榮 申請人:合肥學院