利用幼胚拯救技術(shù)獲得小報(bào)春與巖生報(bào)春種間雜種的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種利用幼胚拯救技術(shù)獲得小報(bào)春與巖生報(bào)春種間雜種的方法，選擇原產(chǎn)我國(guó)的報(bào)春屬小報(bào)春與巖生報(bào)春進(jìn)行雜交，采用子房培養(yǎng)手段進(jìn)行幼胚拯救，對(duì)獲得的后代材料進(jìn)行雜種形態(tài)學(xué)鑒定，選擇莖、葉、花期、花序等形態(tài)學(xué)特征介于雙親之間，出現(xiàn)雙親不具有的新的性狀的后代材料，即為種間雜交新品種。實(shí)現(xiàn)了報(bào)春花屬種間遠(yuǎn)緣雜交，獲得了一批雜種新種質(zhì)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】利用幼胚拯救技術(shù)獲得小報(bào)春與巖生報(bào)春種間雜種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于育種領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及利用幼胚拯救技術(shù)獲得小報(bào)春與巖生報(bào)春種間雜種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]報(bào)春花屬(Primula)是報(bào)春花科(Primulae)最大的屬,全世界約500種,我國(guó)約300種(陳封懷和胡啟明，1990)，報(bào)春大多早春開(kāi)花，花色豐富而艷麗，具有很高的觀賞價(jià)值。報(bào)春花屬植物多數(shù)種類(lèi)為多年生宿根花卉，少數(shù)為一兩年生，葉基生，成蓮座狀葉叢?；▋尚?，分長(zhǎng)短花柱，有利于異花傳粉，花冠漏斗狀或高腳碟狀；花序?yàn)?-3層傘形花序，少數(shù)種類(lèi)花成穗狀或頭狀花序，花色豐富，有粉、紅、黃、橙、紫、藍(lán)、褐色等，很多種類(lèi)是盆栽、花境、野趣園和巖石園的良好材料。
[0003]在種間雜交育種中，育種家利用二倍體翠南報(bào)春(Primula sieboldii)和二倍體P.kisoana進(jìn)行種間雜交，結(jié)合胚拯救獲得了種間雜種，而且雜種后代出現(xiàn)多種倍性，當(dāng)以翠南報(bào)春為母本時(shí)，雜交后代是三倍體，以P.kisoana為母本時(shí)，雜交后代為二倍體(Kato J，2000)。另外，還以翠南報(bào)春為母本、四季報(bào)春為父本進(jìn)行種間雜交，通過(guò)胚拯救獲得了二倍體雜種后代、三倍體后代和四倍體非雜種后代(Kato J, 2001) 0以二倍體的藏報(bào)春(P.sinensis)和二倍體陜西羽葉報(bào)春(P.fiIchnerae)種間雜交,產(chǎn)生了二倍體和六倍體后代，推測(cè)六倍體后代的產(chǎn)生可能是由于三倍體后代染色體加倍形成的(Amano J, etal, 2006) ο四倍體的球花報(bào)春(P.denticulata)和二倍體的長(zhǎng)白山報(bào)春(P.modesta)進(jìn)行種間雜交，F(xiàn)l代結(jié)實(shí)率比較高，而且產(chǎn)生了三倍體、五倍體、六倍體和八倍體等不同倍性的后代，這表明多倍體親本能提高種間雜交的結(jié)實(shí)率(Hayashi M, et al, 2007)。以四倍體球花報(bào)春(P.denticulata)和二倍體P.rosea種間雜交形成的三倍體后代做母本,與四倍體球花報(bào)春做父本進(jìn)行回交，形成了五倍體的植株(Hayashi M, et al, 2009)。
[0004]我國(guó)在報(bào)春花種間雜交方面的研究很少，尚處于起步階段。李翠娟(2007)取以燈臺(tái)報(bào)春組的橘紅燈臺(tái)報(bào)春(P.bulIeyana)、霞紅燈臺(tái)報(bào)春(P.beesiana)與海仙花報(bào)春(P.poissonii)為親本，進(jìn)行種間種間雜交后，以未成熟子房為外植體進(jìn)行胚拯救，成功獲得種間雜交苗201株。報(bào)春花組的小報(bào)春與報(bào)春花(P.malacoides)種間雜交,有較高結(jié)實(shí)率，燈臺(tái)報(bào)春組內(nèi)種間雜交，不同組合差異顯著，其中桔紅燈臺(tái)報(bào)春和霞紅燈臺(tái)報(bào)春種間雜交產(chǎn)生種子數(shù)量最多，報(bào)春的組間雜交存在受精障礙(梁樹(shù)樂(lè)，2006)。因此，利用原產(chǎn)我國(guó)的報(bào)春花屬野生資源，通過(guò)幼胚拯救技術(shù)獲得報(bào)春花屬報(bào)春花組的小報(bào)春與指葉報(bào)春組的巖生報(bào)春的種間雜種，進(jìn)行報(bào)春花種質(zhì)改良，將是我國(guó)報(bào)春花優(yōu)良性狀(花色、花型與花期等)育種和抗逆育種取得重要突破的關(guān)鍵所在。`
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種利用幼胚拯救技術(shù)獲得小報(bào)春與巖生報(bào)春種間雜種的方法。[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種利用幼胚拯救技術(shù)獲得小報(bào)春與巖生報(bào)春種間雜種的方法，包括以下步驟:
[0007]I)小報(bào)春與巖生報(bào)春雜交:利用巖生報(bào)春新鮮花粉，以小報(bào)春為母本進(jìn)行人工去雄并套袋隔離，重復(fù)授粉2-3次(優(yōu)選3次)，將授粉后的小報(bào)春置于溫室內(nèi)培養(yǎng)；
[0008]2)幼胚拯救及雜交后代的獲得:取雜交授粉后25-30d的小報(bào)春子房，以75%酒精進(jìn)行表面消毒(優(yōu)選消毒30s)后，置于含吐溫20的次氯酸鈉溶液中滅菌，然后用無(wú)菌水沖洗(優(yōu)選沖洗5次)，浙干或吸干表面水分，切開(kāi)子房取出未成熟的種子接種至培養(yǎng)基I中，于20-25 °C，每日光照10-12h，光照度1600-20001x的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；25_30d后，將得到的幼苗轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基II中壯苗，于20-25°C，每日光照10-12h，光照度1600_20001x的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；25-30d后，將得到的幼苗轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基III中，于20-25°C，每日光照10_12h，光照度1600-20001x的條件下進(jìn)行擴(kuò)繁，即獲得小報(bào)春與巖生報(bào)春雜交后代；
[0009]3)種間雜種鑒定:對(duì)獲得的雜交后代進(jìn)行雜種形態(tài)學(xué)鑒定。選擇莖、葉、花期、花序等形態(tài)學(xué)特征介于雙親之間，出現(xiàn)雙親不具有的新的性狀的后代材料，即為最終獲得的小報(bào)春與巖生報(bào)春種間雜交新品種。
[0010]其中，培養(yǎng)基I 為:l/2MS+50g/l 蔗糖 +0.lmg/1 NAA+0.lmg/16-BA+6g/l 瓊脂；培養(yǎng)基 II 為:l/2MS+30g/l 蔗糖 +6g/l 瓊脂；培養(yǎng)基 III 為:l/2MS+30g/l 蔗糖 +0.lmg/1NAA+2.0mg/16-BA+6g/l 瓊脂。
[0011]前述方法中，步驟2)中所述含吐溫20的次氯酸鈉溶液中有效氯含量為2%，吐溫20 含量為 1-1.5mL/L，滅菌 15min。
[0012]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0013](一)本發(fā)明利用我國(guó)原產(chǎn)的報(bào)春花屬植物小報(bào)春與巖生報(bào)春，采用幼胚拯救技術(shù)進(jìn)行報(bào)春花種質(zhì)改良，促進(jìn)了小報(bào)春與巖生報(bào)春之間的遺傳交流，合并了兩個(gè)種的優(yōu)異基因，實(shí)現(xiàn)了報(bào)春花屬種間遠(yuǎn)緣雜交，獲得了一批新種質(zhì)。
[0014](二)使利用改良的報(bào)春花種質(zhì)進(jìn)行報(bào)春花進(jìn)行育種成為可能，為報(bào)春花起源演化和報(bào)春屬親緣關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。
[0015](三)達(dá)到豐富報(bào)春花基因庫(kù)，獲得父母本優(yōu)異性狀(基因)的目標(biāo)，形成一整套系統(tǒng)的報(bào)春花品種改良和育種新方法。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為巖生報(bào)春(左)、雜種后代I (中)與小報(bào)春(右)株型、花與葉的對(duì)比圖。
[0017]圖2為巖生報(bào)春(左)、雜種后代2 (中)與小報(bào)春(右)株型、花與葉的對(duì)比圖。
[0018]圖3為巖生報(bào)春(左)、雜種后代3 (中)與小報(bào)春(右)株型、花與葉的對(duì)比圖。
[0019]圖4為巖生報(bào)春(左)、雜種后代4 (中)與小報(bào)春(右)株型、花與葉的對(duì)比圖。
[0020]圖5為巖生報(bào)春(左)、雜種后代5 (中)與小報(bào)春(右)株型、花與葉的對(duì)比圖。
[0021]圖6為巖生報(bào)春(左)、雜種后代6 (中)與小報(bào)春(右)株型、花與葉的對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下實(shí)施例用 于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。[0023]實(shí)施例利用幼胚拯救技術(shù)獲得小報(bào)春與巖生報(bào)春種間雜種的方法
[0024]1.小報(bào)春與巖生報(bào)春種間雜交后代材料的獲得
[0025]1.1材料選擇
[0026]選擇原產(chǎn)我國(guó)的報(bào)春花屬報(bào)春花組小報(bào)春(Primula forbesii)與報(bào)春花屬指葉報(bào)春組巖生報(bào)春(Primula saxatilis)。
[0027]1.2幼胚拯救及雜種獲得
[0028]于北京林業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)進(jìn)行雜交，以小報(bào)春為母本進(jìn)行人工去雄并套袋隔離，采集巖生報(bào)春花粉，于上午9-11時(shí)或下午3-5時(shí)授粉，重復(fù)授粉3次；雜交后采用子房培養(yǎng)手段進(jìn)行幼胚拯救，接種時(shí)取雜交授粉后25-30d的子房，以75%酒精表面消毒30s后置于有效氯為2%的次氯酸鈉溶液(吐溫20含量為1.5mL/L)中滅菌15min，無(wú)菌水沖洗5次后，用鑷子和手術(shù)刀將子房切開(kāi)取未成熟的種子接入l/2MS+50g/l蔗糖+0.lmg/1 NAA+0.lmg/16-BA+6g/l瓊脂培養(yǎng)基上，于20-25°C，每日光照10_12h，光照度1600_20001χ的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。30d后將得到的幼苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(l/2MS+30g/l蔗糖+6g/l瓊脂)壯苗，30d后幼苗轉(zhuǎn)入l/2MS+30g/l蔗糖+0.lmg/1 NAA+2.0mg/16-BA+6g/l瓊脂的培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，培養(yǎng)溫度20-25°C，每日光照10-12h，光照度1600-20001x，獲得報(bào)春花屬小報(bào)春(2n=2x=18)與巖生報(bào)春(2n=2x=24 )的種間雜交后代材料。
[0029]1.3小報(bào)春與巖生報(bào)春組間雜種的鑒定
[0030]將雜交父母本及后 代材料雜種于10月份同時(shí)在溫室進(jìn)行盆栽，12月起開(kāi)始對(duì)雜交父母本及后代材料的形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察與統(tǒng)計(jì)。后代材料的莖、葉、花序等形態(tài)學(xué)特征介于雙親之間、出現(xiàn)雙親不具有的新的性狀，即可判定其為真雜種。
[0031]對(duì)雜交父母本及雜種后代材料的初步觀察表明:新材料的株型、冠幅、株高、葉、花目艮、花萼與花序等形態(tài)特征介于雙親之間，具有父母本綜合性狀。小報(bào)春全株被白粉、花葶綠色、花萼反卷；巖生報(bào)春全株無(wú)白粉、花葶節(jié)部深紅色、花萼不反卷；小報(bào)春與巖生報(bào)春雜種全株僅花萼被白粉、花葶節(jié)部淡紫紅色、花萼不反卷。小報(bào)春、巖生報(bào)春與小報(bào)春X巖生報(bào)春雜種后代的形態(tài)特征描述如下:
[0032]小報(bào)春:株高14.2-21.0cm，冠幅29.5-40.1cm，群體花期12月11號(hào)-翌年6月10號(hào)，葉長(zhǎng)9.4cm、寬5.9cm、葉柄長(zhǎng)11.6cm,花徑2.26cm、花筒長(zhǎng)0.61cm，最多花輪數(shù)5，總花序長(zhǎng)48.9cm,全株被白粉,花葶綠色,花萼反卷。
[0033]巖生報(bào)春:株高9.8-14.2cm，冠幅22.3-31.6cm，群體花期12月11號(hào)_6月28號(hào)，葉長(zhǎng)9.0cm、寬9.1cm、葉柄長(zhǎng)8.2cm,花徑2.41cm、花筒長(zhǎng)1.34cm,最多花輪數(shù)2，總花序長(zhǎng)21.2cm，全株無(wú)白粉、花葶節(jié)部深紅色、花萼不反卷。
[0034]雜種后代1:株高7.2-11.5cm,冠幅12.3-24.2cm,群體花期12月15號(hào)-翌年5月10號(hào)，葉長(zhǎng)6.3cm、寬5.7cm、葉柄長(zhǎng)7.7cm，花徑2.06cm、花筒長(zhǎng)0.79cm，最多花輪數(shù)6，總花序長(zhǎng)46.2cm，花萼被白粉，花葶節(jié)部淡紫紅色，花萼不反卷。(圖1)
[0035]雜種后代2:株高7.5-10.7cm，冠幅14.4-25.1cm,群體花期12月15號(hào)-翌年5月10號(hào)，葉長(zhǎng)5.8cm、寬5.4cm、葉柄長(zhǎng)8.0cm，花徑2.13cm、花筒長(zhǎng)0.93cm，最多花輪數(shù)6，總花序長(zhǎng)46.2cm，花萼被白粉，花葶節(jié)部淡紫紅色，花萼不反卷。(圖2)
[0036]雜種后代3:株高9.2-12.5cm,冠幅19.6-27.6cm,群體花期12月13號(hào)-翌年5月10號(hào)，葉長(zhǎng)7.2cm、寬5.9cm、葉柄長(zhǎng)8.5cm,花徑2.29cm、花筒長(zhǎng)0.95cm,最多花輪數(shù)6，總花序長(zhǎng)46.2cm，花萼被白粉，花葶節(jié)部淡紫紅色，花萼不反卷。(圖3)
[0037]雜種后代4:株高6.5-9.3cm，冠幅13.1-19.1cm,群體花期12月13號(hào)-翌年5月10號(hào)，葉長(zhǎng)4.2cm、寬4.5cm、葉柄長(zhǎng)6.7cm，花徑1.86cm、花筒長(zhǎng)0.81cm，最多花輪數(shù)6，總花序長(zhǎng)46.2cm,花萼被白粉，花葶節(jié)部淡紫紅色，花萼不反卷。(圖4)
[0038]雜種后代5:株高7.8-11.9cm，冠幅15.5-28.3cm，群體花期12月11號(hào)-翌年5月10號(hào)，葉長(zhǎng)4.3cm、寬6.lcm、葉柄長(zhǎng)10.lcm，花徑1.65cm、花筒長(zhǎng)0.89cm，最多花輪數(shù)6，總花序長(zhǎng)46.2cm，花萼被白粉，花葶節(jié)部淡紫紅色，花萼不反卷。(圖5)
[0039]雜種后代6:株高8.6-12.6cm，冠幅17.5-24.7cm，群體花期12月27號(hào)-翌年5月10號(hào)，葉長(zhǎng)9.3cm、寬7.5cm、葉柄長(zhǎng)12.5cm,花徑1.94cm、花筒長(zhǎng)0.94cm,最多花輪數(shù)6，總花序長(zhǎng)46.2cm，花萼被白粉，花葶節(jié) 部淡紫紅色，花萼不反卷。(圖6)
[0040]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.利用幼胚拯救技術(shù)獲得小報(bào)春與巖生報(bào)春種間雜種的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)小報(bào)春與巖生報(bào)春雜交:利用巖生報(bào)春新鮮花粉，以小報(bào)春為母本進(jìn)行人工去雄并套袋隔離，重復(fù)授粉2-3次，將授粉后的小報(bào)春置于溫室內(nèi)培養(yǎng)； 2)幼胚拯救及雜交后代的獲得:取雜交授粉后25-30d的小報(bào)春子房，以75%酒精進(jìn)行表面消毒后，置于含吐溫20的次氯酸鈉溶液中滅菌，然后用無(wú)菌水沖洗，浙干或吸干表面水分，切開(kāi)子房取出未成熟的種子接種至培養(yǎng)基I中，于20-25°C，每日光照10-12h，光照度1600-20001x的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；25-30d后，將得到的幼苗轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基II中壯苗，于20-250C，每日光照10-12h，光照度1600-20001x的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；25_30d后，將得到的幼苗轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基III中，于20-25°C，每日光照10-12h，光照度1600_20001x的條件下進(jìn)行擴(kuò)繁，即獲得小報(bào)春與巖生報(bào)春雜交后代； 3)種間雜種鑒定:對(duì)獲得的雜交后代進(jìn)行雜種形態(tài)學(xué)鑒定，最終獲得小報(bào)春與巖生報(bào)春種間雜種； 其中，培養(yǎng)基 I 為:l/2MS+50g/l 蔗糖 +0.lmg/1 NAA+0.lmg/16_BA+6g/l 瓊脂；培養(yǎng)基 II 為:l/2MS+30g/l 蔗糖+6g/l 瓊脂；培養(yǎng)基 III 為:l/2MS+30g/l 蔗糖+0.lmg/1NAA+2.0mg/16-BA+6g/l 瓊脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中重復(fù)授粉3次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方 法，其特征在于，步驟2)中用75%酒精消毒30s。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述含吐溫20的次氯酸鈉溶液中有效氯含量為2%，吐溫20含量為1-1.5mL/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，用含吐溫20的次氯酸鈉溶液滅菌15min，然后用無(wú)菌水沖洗5次。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103563749SQ201310553128
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】潘會(huì)堂, 唐星林, 張啟翔, 劉艷梅, 程堂仁, 王佳, 孫明 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)