水稻葉色控制基因OscpSRP54及其編碼的蛋白質的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了水稻葉色控制基因OscpSRP54編碼區(qū)的cDNA序列SEQIDNo.1及其編碼蛋白氨基酸序列SEQIDNo.2。本發(fā)明通過圖位克隆技術從水稻淡綠葉突變體HM14中克隆控制水稻葉色的基因OscpSRP54,功能互補實驗證明OscpSRP54是控制水稻葉色的基因。葉綠體透射電鏡觀察證明本發(fā)明克隆的基因具有調(diào)控葉綠體發(fā)育，進而控制葉色的功能?？衫迷摶蛘{(diào)控水稻葉綠體發(fā)育，提高光合作用效率，增加水稻產(chǎn)量。本發(fā)明的葉色控制基因還可作為基因轉化植株后代的追蹤標記和雜交制種過程中真雜種的指示標記，應用于良種繁育和雜交育種。
【專利說明】水稻葉色控制基因0scpSRP54及其編碼的蛋白質
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種利用圖位克隆技術克隆的水稻0scpSRP54基因，可利用該基因調(diào)控水稻葉綠體發(fā)育，提高光合作用效率，增加水稻產(chǎn)量。本發(fā)明的葉色控制基因還可作為基因轉化植株后代的追蹤標記和雜交制種過程中真雜種的指示標記。
【背景技術】
[0002]水稻是世界上和我國重要的糧食作物，全球有35億人，我國有60%以上的人口以稻米為主食。為確保糧食安全，我國于1996年啟動了超級稻發(fā)展計劃。葉片光合作用效率是決定水稻產(chǎn)量的重要因子，而光合作用的高效依賴于葉綠素的合成和葉綠體的正常發(fā)育，葉綠體不但是植物光合作用而且也是許多重要化合物代謝的場所，因此對葉綠體的發(fā)育過程的研究具有重要意義。
[0003]高等植物葉綠體基因組編碼大約100個蛋白質，而水稻葉綠體中含有近4800個蛋白、酶和多肽。因此，絕大多數(shù)的葉綠體蛋白是由核基因編碼的，在細胞質中翻譯后運輸?shù)饺~綠體中。葉色突變體是指葉片發(fā)育過程中葉色表型明顯異于正常野生型葉色的一類突變體，這類突變體往往表現(xiàn)為葉綠素含量降低，葉綠體發(fā)育遲緩或敗育。對這些突變基因的克隆和功能研究對認識水稻葉綠體發(fā)育，培育高光效的水稻材料具有重要的研究意義。
[0004]水稻葉色變異作為形態(tài)標記具有易于鑒別、不受環(huán)境因素影響等特點，對產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀影響不大的葉色變異在水稻生產(chǎn)中具有重要的應用價值。葉色標記作為提高雜交水稻種子純度的有效途徑之一，已被育種家在育種實踐中應用。
[0005]目前只有少數(shù)的水稻葉色突變體基因被鑒定，仍有大量的葉色基因有待鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種新的水稻葉色基因，具有水稻葉色控制的功能，可利用該基因調(diào)控水稻葉綠體發(fā)育，提高光合作用效率，增加水稻產(chǎn)量。
[0007]本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的水稻cpSRP54蛋白。
[0008]一種水稻葉色控制基因0scpSRP54編碼的蛋白質，所述蛋白質的氨基酸序列與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性，所述蛋白質具有水稻葉色控制的功倉泛。
[0009]進一步地，所述的蛋白質氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸而生成的具有相同功能的氨基酸序列或衍生物。
[0010]優(yōu)選地，所述蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]在本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的編碼上述蛋白質的多核苷酸。
[0012]所述基因的核苷酸序列與SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性。
[0013]所述基因的核苷酸序列包括在SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物的核苷酸序列。
[0014]優(yōu)選地,所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0015]本發(fā)明還提供了含有上述基因序列的質?；蛑参锉磉_載體或宿主細胞。
[0016]所述植物表達載體為PcpSRP54。
[0017]所述宿主細胞為大腸桿菌細胞、農(nóng)桿菌細胞或植物細胞。宿主細胞含有上述載體，或基因組中整合有所述的多核苷酸。
[0018]在本發(fā)明的第五方面，提供一種使水稻葉色變淡的方法，該方法包括包括通過RNA1、Ant1-senseRNA、基因敲除或基因失活的方法降低具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的表達或活性。
[0019]本發(fā)明通過圖位克隆技術從水稻淡綠葉突變體HM14中克隆控制水稻葉色的基因0scpSRP54,功能互補實驗證明0scpSRP54是控制水稻葉色的基因。葉綠體透射電鏡觀察證明本發(fā)明克隆的基因具有調(diào)控葉綠體發(fā)育，進而控制葉色的功能。可利用該基因調(diào)控水稻葉綠體發(fā)育，提高光合作用效率，增加水稻產(chǎn)量。本發(fā)明的葉色控制基因還可作為基因轉化植株后代的追蹤標記和雜交制種過程中真雜種的指示標記，應用于良種繁育和雜交育種。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為水稻葉色突變體表型；其中，1:野生型IR64 ；2:突變體HM14。
[0021 ] 圖2為0scpSRP54基因在水稻第11染色體上的精細定位。
[0022]圖3為表達載體PcpSRP54圖譜。
[0023]圖4為功能互補實驗TO代轉基因水稻的表型示意圖；其中，I:IR64 ；2:HM14 ；3:HM14-0scpSRP54。
[0024]圖5為轉基因植株的RT-PCR驗證電泳圖;其中，M =Marker ；1:IR64 ；2:HM14 ;3_7:
轉基因植株。
[0025]圖6為0scpSRP4基因的表達電泳圖；其中，M =Marker ；1:葉；2:葉鞘；3:莖；4:根;5:幼穗。
【具體實施方式】
[0026]以下結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
[0027]實施例1:突變體的分離與遺傳分析
通過對EMS誘變的水稻(IR64)突變體庫的篩選，分離獲得了一個水稻葉色突變體HM14，其表型能穩(wěn)定遺傳，在整個生育期內(nèi)均表現(xiàn)為淡綠色(如圖1所示)。利用突變體HM14與Moroberekan雜交獲得F1，F(xiàn)1植株具有正常的葉色表型，F(xiàn)2代中的野生型和突變體表型的分離比符合孟德爾單隱性突變的分離比，說明突變體HM14的淡綠葉表型由單隱性基因控制。
[0028]實施例2:突變基因的精細定位
根據(jù)已公布的粳稻和秈稻的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各染色體上的SSR引物進行多態(tài)性檢測及初步定位分析，將突變體HM14與Moroberekan雜交獲得的F2群體中具有突變體表型的單株作為定位群體， 共鑒定1008株具有突變體表型的F2個體，其中的72株作為初定位群體。初定位結果表明突變基因位于第11染色體短臂RM1812和RM26092之間。
[0029]篩選獲得RM1812和RM26092之間在親本間有多態(tài)性的引物RM26076、RM26079和RM26085,并用這5對引物分析1008個F2群體中的突變個體，利用獲得的信息構建物理圖譜。最終將突變基因精細定位于第11染色體BAC克隆AC116949和AC138196上RM26076和RM26079標記之間40.7kb范圍內(nèi)(如圖2所示)。
[0030]實施例3:基因預測和序列比對分析
根據(jù)精細定位的結果，對該區(qū)間的8個預測基因進行分析，發(fā)現(xiàn)一個編碼葉綠體信號識別顆粒蛋白的cpSRP54基因。測序發(fā)現(xiàn)突變體HM14中該基因第一內(nèi)含子中最后一個堿基發(fā)生了突變，可能影響了正常的剪接，因此將該基因定為候選基因并命名為0scpSRP54。 [0031]利用RT-PCR 技術，用引物對 SEQ ID N0.3 (TCGCTCATCGGCAATGGA)和 SEQ ID N0.4(TTCCACGGCATTCTTGGTTATT)擴增cDNA，比較0scpSRP54基因在野生型和突變體HM14中的片段大小，該實驗證實由于堿基突變造成了突變體中第一內(nèi)含子的保留，其擴增片段比正常剪接的野生型要大119bp (如圖5所示)。
[0032]實施例4:0scpSRP54基因功能互補驗證
構建包含0scpSRP54基因全長編碼區(qū)(SEQ ID N0.1)及自身啟動子的互補載體(圖3)，轉化到農(nóng)桿菌EHA105，以農(nóng)桿菌介導法轉化突變體HM14。轉基因植株表現(xiàn)為正常葉色表型，通過測序發(fā)現(xiàn)其在突變位點呈雙峰，同時RT-PCR驗證證實在轉基因植株中含有正常剪接的片段(圖5)，實驗結果表明互補載體能夠完全恢復HM14的突變表型(圖4)。如圖3所示的PcpSRP54，該載體可以表達有上述核苷酸序列編碼的多肽或其同源類似物。
[0033]實施例5:0scpSRP54基因的表達
利用RT-PCR技術，比較了 0scpSRP54基因在各個組織中的表達情況，從圖6可明顯觀察到葉片、葉鞘中0scpSRP54基因的表達明顯高于根和穗中的表達，而在莖中未檢測到0scpSRP54 的表達。
[0034]以上所述僅為本發(fā)明的若干個【具體實施方式】，應當指出，對于本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種水稻葉色控制基因OscpSRP54編碼的蛋白質，所述蛋白質的氨基酸序列與SEQID N0.2所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性，所述蛋白質具有水稻葉色控制的功能。
2.根據(jù)權利要求1所述的蛋白質，其特征在于，所述的蛋白質氨基酸序列為SEQIDN0.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸而生成的具有相同功能的氨基酸序列或衍生物。
3.根據(jù)權利要求1所述的蛋白質，其特征在于，所述蛋白質的氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。
4.一種編碼權利要求1、2或3所述蛋白質的基因。
5.根據(jù)權利要求4所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列與SEQID N0.1所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性。
6.根據(jù)權利要求5所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列包括在SEQIDN0.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物的核苷酸序列。
7.根據(jù)權利要求4所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID N0.1所/Jn o
8.一種含有權利要求4-7任一權利要求所述基因序列的質粒或植物表達載體或宿主細胞。
9.根據(jù)權利要求8所述的植物表達載體，其特征在于，所述植物表達載體為PcpSRP54。
10.根據(jù)權利要求8所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌細胞、農(nóng)桿菌細胞或植物細胞。
11.一種使水稻葉色變淡的方法，其特征在于，所述方法包括包括通過RNA1、Ant1-senseRNA、基因敲除或基因失活的方法降低具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的表達或活性。
【文檔編號】A01H5/00GK103613649SQ201310527040
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年10月30日 優(yōu)先權日:2013年10月30日
【發(fā)明者】施勇烽, 吳建利, 王惠梅, 徐霞, 張曉波 申請人:中國水稻研究所