一種快速建立葡萄遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的方法
【專利摘要】本發(fā)明為一種快速建立釀酒葡萄雷司令遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的方法，屬于葡萄轉(zhuǎn)基因育種【技術(shù)領(lǐng)域】。其特征是，利用組織培養(yǎng)誘導(dǎo)葡萄花藥獲得的愈傷組織，經(jīng)繼代培養(yǎng)篩選獲得胚性愈傷組織，以所獲得胚性愈傷組織作為受體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，利用選擇培養(yǎng)基篩選獲得抗性愈傷組織，再生葡萄植株。通過PCR驗(yàn)證和體視熒光顯微鏡觀察報(bào)告基因gfp表達(dá)與否，快速鑒定轉(zhuǎn)化體，提高葡萄轉(zhuǎn)基因效率。與已有技術(shù)相比，使用本發(fā)明培養(yǎng)基培育篩選效果好，可以快速進(jìn)行雷司令轉(zhuǎn)基因葡萄植株的再生，大幅度提高葡萄轉(zhuǎn)基因效率，再生率達(dá)到81％，轉(zhuǎn)化周期短，在7個(gè)月內(nèi)即可以獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化體大幅度增加，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到63％。
【專利說明】一種快速建立葡萄遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于新植物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及葡萄轉(zhuǎn)基因育種【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]培育葡萄新品種、改善果實(shí)品質(zhì)、提高植株抗性是葡萄科研工作者十分關(guān)注的問題，但是葡萄基因數(shù)量大且多呈雜合狀態(tài)，遺傳背景復(fù)雜，利用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行雜交育種，培育過程繁瑣，周期較長，成本較高，效率較低，通過雜交獲得優(yōu)良品種的方法容易受到親本材料的限制，雜交過程常常帶入不良的經(jīng)濟(jì)性狀，受到很大程度的制約。組織培養(yǎng)技術(shù)、分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為葡萄新品種選育和品質(zhì)改良研究開辟了新的途徑。利用轉(zhuǎn)基因手段培育葡萄優(yōu)良品種，改善葡萄的農(nóng)藝學(xué)性狀，同時(shí)提高果實(shí)產(chǎn)量具有十分廣闊的前景和極其重要的現(xiàn)實(shí)價(jià)值。
[0003]目前葡萄的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要包括基因槍法和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒法?；驑尫ň哂幸淮翁幚砜墒乖S多細(xì)胞轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)，但是獲得單拷貝整合的植株比較困難，轉(zhuǎn)基因植株的遺傳特性較復(fù)雜，穩(wěn)定性差，轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)困難，易出現(xiàn)沉默現(xiàn)象等。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化效率較高，可以導(dǎo)入的DNA片段較大，導(dǎo)入基因拷貝數(shù)低，表達(dá)效果較好，方法和使用的儀器簡單，費(fèi)用較低，是目前轉(zhuǎn)化機(jī)理研究最清楚，使用最廣泛，技術(shù)最成熟的方法。
[0004]以愈傷組織為受體材料進(jìn)行基因遺傳轉(zhuǎn)化研究具有很多優(yōu)勢(shì)。第一，已分化的細(xì)胞均回復(fù)到脫分化的分生細(xì)胞水平，易于接受外源基因，轉(zhuǎn)化效率較高；第二，擴(kuò)繁量大，獲得的轉(zhuǎn)化愈傷組織通過繼代擴(kuò)繁培養(yǎng)，能夠分化出更多的轉(zhuǎn)化植株；第三，多種組織、器官均可誘導(dǎo)愈傷組織，外植體試材廣泛。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服已有技術(shù)的不足，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，使用葡萄花藥誘導(dǎo)胚性愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，既結(jié)合了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)，又克服了其他轉(zhuǎn)化方法周期長，轉(zhuǎn)化體少的缺點(diǎn)，通過本專利所描述的方法，以gfp為報(bào)告基因快速得到了釀酒葡萄品種雷司令的轉(zhuǎn)基因苗，提聞了匍萄的轉(zhuǎn)基因育種效率。
[0006]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]轉(zhuǎn)基因的方法:利用組織培養(yǎng)誘導(dǎo)釀酒葡萄品種雷司令花藥獲得的愈傷組織，經(jīng)繼代培養(yǎng)篩選獲得胚性愈傷組織，以所獲得胚性愈傷組織作為受體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，利用選擇培養(yǎng)基篩選獲得抗性愈傷組織，再生葡萄植株，經(jīng)分子檢測(cè)及體式熒光顯微鏡觀察，獲得轉(zhuǎn)基因葡萄苗。根據(jù)該轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于共培養(yǎng)前將農(nóng)桿菌加入到抗性誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，可顯著提高轉(zhuǎn)基因效率。0D_ = 1.0的菌液濃度侵染葡萄胚性愈傷組織能獲得較高的抗性愈傷率?？剐哉T導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:5g L—1 +肉浸膏、Ig L—1酵母膏、5g L—1 蛋白胨、5g L—1 蔗糖、4g L-1MgSO4.7H20> 100 μ mo I L4 乙酰丁香酮、50mg I71 卡那霉素、50mg L—1利福平，調(diào)節(jié)pH為5.2。繼代培養(yǎng)20天的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化效率最高。胚性愈傷組織和農(nóng)桿菌在含有100 μ mol L-1乙酰丁香酮的液體共培養(yǎng)基中侵染處理20分鐘，可以順利脫除愈傷組織上附著的根癌農(nóng)桿菌，而不影響胚性愈傷組織的生長，液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg L—1鹽酸硫胺素、0.2mg L—1鹽酸吡口多醇、0.5mg L—1煙酸、150mg L—1肌醇、50mg L—1水解酪蛋白、IOg L—1椰乳、5%鹿糖、100 μ molL-1乙酰丁香酮、Img T1NOAAOg L—1甘露糖醇，pH為5.2。農(nóng)桿菌和愈傷組織共培養(yǎng)溫度為28°C，固體共培養(yǎng)基成分為:MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg L—1鹽酸硫胺素、0.2mg L—1鹽酸批P多醇、0.5mg I71煙酸、150mg L4肌醇、50mg I71水解酪蛋白、IOg I71椰乳、5%蔗糖、100μmoL—1乙酰丁香酮、Img PNOA和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠；共培養(yǎng)三天后使用液體繼代培養(yǎng)基清洗，可顯著降低愈傷組織褐化程度，提高轉(zhuǎn)化效率，液體繼代培養(yǎng)基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg L—1鹽酸硫胺素、0.2mg L—1鹽酸吡哆醇、0.5mgL4煙酸、150mg L4肌醇、50mg I71水解酪蛋白、IOg I71椰乳、5%鹿糖、100 μ mol I71乙酰丁香酮、Img L-1NOAUg L—1頭孢霉素和IOOmg L—1 二硫蘇糖醇；選擇培養(yǎng)基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg L-1鹽酸硫胺素、0.2mg L-1鹽酸吡哆醇、0.5mg L-1煙酸、150mgL 1 肌醇、1.0mg L 1P-CPA,0.20mgL 1TDZ,0.5mg L 1NOA,0.0lmg L 1GA3、SOmg L 1 水解釀蛋白、
2.0mg L4甘氨酸、.1Og L—1椰乳、200mg L4頭孢霉素、50mg I71卡那霉素、5%鹿糖和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠，pH6.2 ;分化培養(yǎng)基配方為MS大量兀素、MS微量兀素、MS鐵鹽、0.5mg L 1鹽酸硫胺素、0.2mg I/1 鹽酸批P多醇、0.5mg L4煙酸、150mg L-1 肌醇、1.0mg L-1P-CPA, 0.20mgL-1TDZ, 0.5mg L-1NOA, 0.0lmg L_1GA3>5mg I/1 的天冬氨酸、2.0mg I/1 甘氨酸、1OgL-1 椰乳、5%蔗糖和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠，pH6.2 ;所述生根培養(yǎng)基成分為1/2MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.1mg I/1鹽酸硫胺素、0.8mg I71鹽酸批P多醇、0.5mg L—1煙酸、IOOmg L4肌醇、0.5mg L—1 α -萘乙酸鈉、0.5mg L-1NOA>50mg I71水解酪蛋白、2.0mg I71甘氨酸、3%葡萄糖和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠，pH6.2。
[0008]進(jìn)一步的，該方法按照以下步驟進(jìn)行:
[0009](I)根癌農(nóng)桿菌活化:含有綠色熒光蛋白基因gfp的根癌農(nóng)桿菌菌株在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽性表達(dá)的菌斑加入到抗性誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28°C，250rpm培養(yǎng)至OD6tltl = 1.0,將菌液5000rpm離心10分鐘，棄上清，加入液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基重懸，用作農(nóng)桿菌懸浮侵染液，所述抗性誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:5g L—1牛肉浸膏、lgL—1酵母膏、5g L—1 蛋白胨、5g L—1 蔗糖、4g L-11MgSO4.7Η20、100 μ molL—1 乙酰丁香酮、50mg L—1 卡那霉素、50mg L-1利福平，調(diào)節(jié)pH為5.2，所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg I/1鹽酸硫胺素、0.2mg L4鹽酸吡哆醇、0.5mg L4煙酸、150mg L4肌醇、50mgL—1水解酪蛋白、IOg L—1椰乳、5%蔗糖、100 μ mol L—1乙酰丁香酮、Img L—1奈氧乙酸、90gL-1甘露糖醇，PH為5.2 ;
[0010](2)取繼代培養(yǎng)后20天、生長狀態(tài)良好的葡萄胚性愈傷組織，放入制備好的農(nóng)桿菌懸浮侵染液，侵染20分鐘，過程中間每隔5分鐘搖動(dòng)培養(yǎng)皿一次，然后倒出菌液，用滅過菌的吸水紙吸干愈傷組織表面菌液，轉(zhuǎn)入固體共培養(yǎng)基中，28°C黑暗條件下倒置培養(yǎng)。三天后使用液體繼代培養(yǎng)基清洗，所述固體共培養(yǎng)基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg I/1鹽酸硫胺素、0.2mg L4鹽酸吡卩多醇、0.5mg I71煙酸、150mg L4肌醇、50mg L-1水解酪蛋白、IOg L—1椰乳、5%蔗糖、100 μ mol L-1乙酰丁香酮、Img T1NOA和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠；所述液體繼代培養(yǎng)基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mgL-1鹽酸硫胺素、0.2mg L4鹽酸吡卩多醇、0.5mg L4煙酸、150mg L4肌醇、50mg L4水解酪蛋白、IOgL4椰乳、5%鹿糖、100 μ mol L—1乙酰丁香酮、Img L-1N0A、lg L4頭孢霉素和IOOmg L—1 二硫蘇
糖醇；
[0011](3)抗性愈傷組織的篩選:清洗后的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上，每10天繼代培養(yǎng)一次。所述選擇培養(yǎng)基配方為MS大量兀素、MS微量兀素、MS鐵鹽、0.5mg L 1鹽酸硫胺素、0.2mg L4 鹽酸吡卩多醇、0.5mg I71 煙酸、150mg L-1 肌醇、1.0mg L-1P-CPA, 0.20mgL-1TDZ, 0.5mg L-1NOA, 0.0lmg L-1GA3>50mg L-1 水解酪蛋白、2.0mg L-1 甘氨酸、IOg L-1 椰乳、200mg L-1頭孢霉素、50mg L-1卡那霉素、5%鹿糖和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠，pH6.2 ；
[0012](4)陽性表達(dá)愈傷組織的鑒定:挑去選擇培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3-4次仍然存活的愈傷組織于倒置激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察；同時(shí)提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR初步驗(yàn)證；
[0013](5)植株再生:將陽性表達(dá)的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，再生成苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，所述分化培養(yǎng)基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg.l-1鹽酸硫胺素、0.2mg L4 鹽酸吡卩多醇、0.5mg I71 煙酸、150mg L-1 肌醇、1.0mg L-1P-CPA, 0.20mgL-1TDZ,0.5mg L-1NOA,0.0lmg L-1GA3>5mg L—1 的天冬氨酸、2.0mg L-1 甘氨酸、IOg I71 椰乳、5%蔗糖和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠，pH6.2 ;所述生根培養(yǎng)基成分為1/2MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.1mg L-1鹽酸硫胺素、0.8mg L-1鹽酸批卩多醇、0.5mg L-1煙酸、IOOmg L-1肌醇、0.5mg L-1C1-萘乙酸鈉、0.5mg L-1NOA,50mg L—1水解酪蛋白、2.0mg L—1甘氨酸、3%葡萄糖和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠，pH6.2 ；
[0014](6)轉(zhuǎn)基因苗的鑒定及轉(zhuǎn)基因植株的獲得:提取轉(zhuǎn)基因苗的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證；將PCR驗(yàn)證得到的陽性表達(dá)葡萄苗放置立體熒光顯微鏡下觀察。
[0015]本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0016]1、利用胚性愈傷組織作為侵染受體，能夠大幅度提高葡萄轉(zhuǎn)基因效率。
[0017]2、轉(zhuǎn)化周期大大縮短，本發(fā)明可以在7個(gè)月內(nèi)獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化體大幅度增加，轉(zhuǎn)化率達(dá)到63%。建立了較為高效的轉(zhuǎn)基因體系，從而能夠?qū)⒏嗟墓δ芑虿迦肫咸鸦蚪M，為葡萄功能基因組的研究提供技術(shù)平臺(tái)。
[0018]3、利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)葡萄胚性愈傷組織能夠快速得到多個(gè)轉(zhuǎn)化體，與基因槍法和花粉管介導(dǎo)法相比，減輕了工作量，提高了工作效率。
[0019]4、利用配方為5g L—1牛肉浸膏、IgL—1酵母膏、SgL—1蛋白胨、SgL—1鹿糖、4gL-1MgS04.7Η20>100 μ mo IL-1乙酰丁香酮、50mg L-1卡那霉素、50mg廠1利福平的抗性誘導(dǎo)培養(yǎng)基活化菌液，共培養(yǎng)基中添加lOOymolL—1乙酰丁香酮促進(jìn)了轉(zhuǎn)化效率的提高；利用配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg L—1鹽酸硫胺素、0.2mg L—1鹽酸吡哆醇、0.5mgL4煙酸、150mg L4肌醇、50mg I71水解酪蛋白、IOg I71椰乳、5%鹿糖、100 μ mol I71乙酰丁香酮、Img T1NOAAOg L—1甘露糖醇的液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基重懸菌液，可以有效地提高農(nóng)桿菌活性；配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg L—1鹽酸硫胺素、0.2mgL_1鹽酸吡哆醇、0.5mgL_1煙酸、ISOmgL4肌醇、SOmgL4水解酪蛋白、IOgL4椰乳、5%鹿糖、100 μ moll/1乙酰丁香酮、Img T1NOA和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠的固體共培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)，3天后采用含有IgL—1頭孢霉素和IOOmg L-1 二硫蘇糖醇的液體繼代培養(yǎng)基清洗愈傷組織可以達(dá)到很好的清除農(nóng)桿菌的效果，而不影響胚性愈傷組織的正常生長，該方法既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保。配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg L-1鹽酸硫胺素、0.2mg L-1鹽酸批哆醇、0.5mgL_1煙酸、150mg L1 肌醇、1.0mg L 1P-CPA, 0.2mgL 1TDZ, 0.5mg L 1NOA, 0.0lmg L 1GA3,5Omg L1水解酪蛋白、2.0mg L4甘氨酸、IOg L4椰乳、ZOOmgI/1頭孢霉素、50mg L4卡那霉素、5%鹿糖和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠的選擇培養(yǎng)基可以很好地篩選抗性愈傷組織；分化培養(yǎng)基中較高濃度的鹽酸硫胺素和肌醇以及附加的椰乳有利于愈傷組織的分化和胚狀體的形成，高濃度(5%)的蔗糖有利于胚狀體的發(fā)育，微量的赤霉素GA3有利于胚狀體的生長；生根培養(yǎng)基與普通MS培養(yǎng)基相比含有較高濃度的鹽酸吡哆醇(8% )，有利于根系的生長；本發(fā)明采用0.28%脫乙酰吉蘭糖膠作為固化劑，與瓊脂相比，脫乙酰吉蘭糖膠透明度高，透氣性好，凝固點(diǎn)低，含Ca、Mg等雜質(zhì)成分少，有利于培養(yǎng)基中所含營養(yǎng)物質(zhì)被植物吸收，具有較高的利用價(jià)值。使用上述培養(yǎng)基培育篩選效果好，可以快速進(jìn)行雷司令轉(zhuǎn)基因葡萄植株的再生，再生率達(dá)到81 %，轉(zhuǎn)化周期短，轉(zhuǎn)化效果好。
【專利附圖】

【附圖說明】:[0020]附圖1:本發(fā)明由花藥誘導(dǎo)產(chǎn)生的葡萄胚性愈傷組織；
[0021]附圖2:本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因愈傷組織細(xì)胞在激光掃描共聚焦顯微鏡(LCSM，NikonD-ECLIPSE C I ；Nikon, Tokyo, Japan)下瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果；
[0022]附圖3:本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因愈傷組織細(xì)胞團(tuán)在奧林巴斯體視熒光顯微鏡下觀察；
[0023]附圖4:本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因葡萄苗；
[0024]附圖5:本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因苗PCR檢測(cè)結(jié)果；圖中，I =Marker (DL2000) ；2陰性對(duì)照；3:轉(zhuǎn)化愈傷組織克隆
[0025]附圖6:本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因葡萄葉片在奧林巴斯體視熒光顯微鏡下觀察；
【具體實(shí)施方式】:
[0026]1、根癌農(nóng)桿菌活化:含有綠色熒光蛋白基因(GFP)的根癌農(nóng)桿菌菌株在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽性表達(dá)的菌斑加入到抗性誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(抗性誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:5g L—1牛肉浸膏、Ig L—1酵母膏、5g L—1蛋白胨、SgL—1鹿糖、4gL_1MgS04.7Η20> 100 μ mol L4 乙酰丁香酮、50mg L4 卡那霉素、50mg L4 利福平,調(diào)節(jié) pH 為
5.2)，28°C，250rpm培養(yǎng)至OD600 = 1.0。將菌液5000rpm離心10分鐘，棄上清，加入液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基重懸(液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為MS大量兀素、MS微量兀素、MS鐵鹽、0.5mgL_1鹽酸硫胺素、0.2mg L4鹽酸卩比卩多醇、0.5mg I71煙酸、150mg L4肌醇、50mg I71水解酪蛋白、1Og L—1 椰乳、5%鹿糖、100 μ mol L—1 乙酰丁香酮、Img L-1N0A、90g L—1 甘露糖醇,pH 為 5.2),用作侵染液。
[0027]2、取繼代培養(yǎng)后20天、生長狀態(tài)良好的葡萄胚性愈傷組織，放入制備好的農(nóng)桿菌懸浮侵染液，侵染20分鐘，過程中間每隔5分鐘搖動(dòng)培養(yǎng)皿一次，然后倒出菌液，用滅過菌的吸水紙吸干愈傷組織表明菌液，轉(zhuǎn)入固體共培養(yǎng)基中(固體共培養(yǎng)基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg L—1鹽酸硫胺素、0.2mg L—1鹽酸吡哆醇、0.SmgL—1煙酸、150mgL—1肌醇、50mg L—1水解酪蛋白、IOg L—1椰乳、5%鹿糖、100 μ mol L—1乙酰丁香酮、Img L-1NOA和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠)，28°C黑暗條件下倒置培養(yǎng)。三天后使用附加Ig L—1頭孢霉素和IOOmg L-1 二硫蘇糖醇的液體繼代培養(yǎng)基清洗。[0028]3、抗性材料的篩選:清洗后的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上(選擇培養(yǎng)基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg L—1鹽酸硫胺素、0.2mg L—1鹽酸吡哆醇、0.5mgL 1 煙酸、150mg L 1 肌醇、1.0mg L 1P-CPA, 0.20mg L 1TDZ, 0.5mg L 1NOA, 0.0lmg L 1GA3SOmgL4水解酪蛋白、2.0mg L4甘氨酸、IOg L1椰乳、200mg L4頭孢霉素、50mg L4卡那霉素、5%蔗糖和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠，pH6.2)，每10天繼代培養(yǎng)一次。
[0029]4、陽性表達(dá)愈傷組織的鑒定:挑取選擇培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3-4次仍然存活的愈傷組織倒置激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察；同時(shí)提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR初步驗(yàn)證。
[0030]5、植株再生:將胚狀體轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)(分化培養(yǎng)基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg L—1鹽酸硫胺素、0.2mg L—1鹽酸吡哆醇、0.5mg -1煙酸、150mg L 1 肌醇、1.0mg L 1P-CPA, 0.20mgL 1TDZ, 0.5mgL 1NOA, 0.0lmgL 1GA3JmgL 1 的天冬氛酸、2.0mgL—1甘氨酸、lOgL—1椰乳、5%蔗糖和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠，pH6.2)，再生成苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中(生根培養(yǎng)基成分為1/2MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.1mg -1鹽酸硫胺素、0.8mg L—1鹽酸吡卩多醇、0.5mg L—1煙酸、IOOmgL-1肌醇、0.5mg L—1 α -萘乙酸鈉、
0.5mg L-1NOAjOmg L—1水解酪蛋白、2.0mg L—1甘氨酸、3%葡萄糖和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠，pH6.2)。
[0031]6、轉(zhuǎn)基因苗的鑒定及轉(zhuǎn)基因植株的獲得:提取轉(zhuǎn)基因苗的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證；將PCR驗(yàn)證得到的陽性表達(dá)葡萄葉片放置立體熒光顯微鏡下觀察。
[0032]利用上述方法，本發(fā)明已經(jīng)成功將報(bào)告基因gfp轉(zhuǎn)入釀酒葡萄雷司令，建立了一種高效的葡萄轉(zhuǎn)基因體系。使用上述培養(yǎng)基培育篩選效果好，可以快速進(jìn)行雷司令轉(zhuǎn)基因葡萄植株的再生，轉(zhuǎn)化周期短，轉(zhuǎn)化效果好。植株的再生率達(dá)到81 %，在7個(gè)月內(nèi)即可以獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化體大幅度增加，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到63%。
[0033]受體材料狀態(tài)的選擇:
[0034]愈傷組織的生長狀態(tài)對(duì)于葡萄高效的轉(zhuǎn)化非常重要?？偟膩碚f是生長和細(xì)胞分裂旺盛的外植體易于接受外源DNA，因而對(duì)根癌農(nóng)桿菌的侵染最為敏感，容易獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。選擇生長較一致，狀態(tài)良好淡黃色顆粒狀疏松的胚性愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，當(dāng)繼代培養(yǎng)20天時(shí)，愈傷組織的生長速度最快，轉(zhuǎn)化效率也最高(表I)。
[0035]表I繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胚性愈傷組織瞬時(shí)表達(dá)效率的影響
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種快速建立葡萄遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的方法，其特征在于:利用組織培養(yǎng)誘導(dǎo)葡萄品種雷司令花藥獲得的愈傷組織，經(jīng)繼代培養(yǎng)篩選獲得胚性愈傷組織，以所獲得胚性愈傷組織作為受體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，利用選擇培養(yǎng)基篩選獲得抗性愈傷組織，再生葡萄植株，經(jīng)分子檢測(cè)及體式熒光顯微鏡觀察，獲得轉(zhuǎn)基因葡萄苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速建立葡萄遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的方法，其特征在于，所述方法按照以下步驟進(jìn)行: (1)根癌農(nóng)桿菌活化:含有綠色熒光蛋白基因gfp的根癌農(nóng)桿菌菌株在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽性表達(dá)的菌斑加入到抗性誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28°C，.250rpm培養(yǎng)至0D_ = 1.0，將菌液5000rpm離心10分鐘，棄上清，加入液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基重懸，用作農(nóng)桿菌懸浮侵染液，所述抗性誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:5g L—1牛肉浸膏、Ig L—1酵母膏、.5g L—1 蛋白胨、5g L—1 鹿糖、4g I-1MgSO4.7Η20、100 μ molL—1 乙酰丁香酮、50mg L—1 卡那霉素、.50mg 1利福平，調(diào)節(jié)pH為5.2，所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg I/1鹽酸硫胺素、0.2mg L4鹽酸批卩多醇、0.5mg L4煙酸、150mg L4肌醇、50mgL—1水解酪蛋白、IOg L—1椰乳、5%蔗糖、100 μ mo I L—1乙酰丁香酮、Img L—1奈氧乙酸、9(-171甘露糖醇，PH為5.2 ; (2)取繼代培養(yǎng)后20天、生長狀態(tài)良好的葡萄胚性愈傷組織，放入制備好的農(nóng)桿菌懸浮侵染液，侵染20分鐘，過程中間每隔5分鐘搖動(dòng)培養(yǎng)皿一次，然后倒出菌液，用滅過菌的吸水紙吸干愈傷組織表面菌液，轉(zhuǎn)入固體共培養(yǎng)基中，28°C黑暗條件下倒置培養(yǎng)。三天后使用液體繼代培養(yǎng)基清洗，所述固體共培養(yǎng)基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、.0.5mg I71鹽酸硫胺素、0.2mg L4鹽酸卩比卩多醇、0.5mg L4煙酸、150mg L4肌醇、50mg L4水解酪蛋白、IOg L—1椰乳、5%蔗糖、100 μ mo I L-1乙酰丁香酮、Img T1NOA和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠；所述液體繼代培養(yǎng)基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg 1鹽酸硫胺素、0.2mg L—1鹽酸批P多醇、0.5mg I71煙酸、150mg L4肌醇、50mg L—1水解酪蛋白、IOg L—1椰乳、5%鹿糖、100 μ mol L—1乙酰丁香酮、Img L-1N0A、lg L4頭孢霉素和IOOmg L—1 二硫蘇糖醇； (3)抗性愈傷組織的篩選:清洗后的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上，每10天繼代培養(yǎng)一次。所述選擇培養(yǎng)基配方為MS大量兀素、MS微量兀素、MS鐵鹽、0.5mg L 1鹽酸硫胺素、0.2mg L—1 鹽酸吡哆醇、0.5mg -1 煙酸、150mg L-1 肌醇、1.0mg L-1P-CPA, 0.20mg T1TDZ,.0.5mg L-1NOA, 0.0lmg L-1GA3>50mg L4水解酪蛋白、2.0mg L-1 甘氨酸、IOg 廠1 椰乳、200mg L-1頭孢霉素、50mg L-1卡那霉素、5%鹿糖和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠，pH6.2 ； (4)陽性表達(dá)愈傷組織的鑒定:挑去選擇培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3-4次仍然存活的愈傷組織于倒置激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察；同時(shí)提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR初步驗(yàn)證； (5)植株再生:將陽性表達(dá)的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，再生成苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，所述分化培養(yǎng)基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg -1鹽酸硫胺素、0.2mg L-1 鹽酸吡哆醇、0.Smgr1 煙酸、lSOmgL—1 肌醇、1.0mgr1P-CPA70.20mgr1TDZ,.0.5mgL_1N0A,0.0ImgL-1GA3>5mgL_1 的天冬氨酸、2.0mg I71 甘氨酸、IOg I71 椰乳、5%鹿糖和.0.28%脫乙酰吉蘭糖膠，pH6.2 ;所述生根培養(yǎng)基成分為1/2MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.1mg L—1鹽酸硫胺素、0.8mg L—1鹽酸批P多醇、0.5mg L—1煙酸、IOOmg L—1肌醇、0.5mg.17、-萘乙酸鈉、0.5mg L-1NOAjOmg L—1水解酪蛋白、2.0mg L—1甘氨酸、3%葡萄糖和0.28%脫乙酰吉蘭糖膠，pH6.2; (6)轉(zhuǎn)基因苗的鑒定及轉(zhuǎn)基因植株的獲得:提取轉(zhuǎn)基因苗的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證；將PCR驗(yàn)證得到的陽性表達(dá)葡萄苗放置立體熒光顯微鏡下觀察。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103444524SQ201310031683
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月8日
【發(fā)明者】趙鳳霞, 高相彬, 王正平, 宋學(xué)立, 朱景偉 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所