專利名稱：一種東北紅豆杉試管內(nèi)一步成苗方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物種植技術，即東北紅豆杉試管內(nèi)一步成苗方法。
背景技術：
在現(xiàn)有技術中，東北紅豆杉ijaxus cuspidata Sieb. et Zucc.)又稱紫杉、赤板松，紅豆杉科紅豆杉屬常綠喬木，該種在長白山區(qū)數(shù)量稀少，分布區(qū)域十分狹窄，僅在吉林省石湖自然保護區(qū)內(nèi)有較大的種群面積，其他區(qū)域僅有零星分布。被《國家重點保護野生植物名錄(第一批)》定為國家一級重點保護植物。被《中國物種紅色名錄》定為易危種(VU)。在《吉林省野生動植物保護管理暫行條例》一文中被定為省級一類重點保護植物。東北紅豆杉不僅是材用植物，也是重要的藥用植物，其莖、枝、葉和根可入藥，主要成分含紫杉醇、紫杉堿、雙萜類化合物。有抗癌功能，并有抑制糖尿病及治療心臟病的效用。此外種子還可以榨油等。也可作東北及華北地區(qū)的綠化及造林樹種。東北紅豆杉通常以插條扦插或種子繁殖為主，但其果實成熟后，種子中的種胚處于心形胚后期或子葉胚初期階段，種子播種后當年不萌發(fā)，加之種皮堅硬，種胚成熟后很難破殼發(fā)芽，2 3年后僅極少數(shù)萌發(fā)；所以，插條扦插繁殖不僅生根率和移栽成活率極低，而且導致野生資源受到滅絕性威脅。因此，大規(guī)模人工栽培、開發(fā)和利用受到極大限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述不足而提供一種東北紅豆杉試管內(nèi)高效、一步成苗的東北紅豆杉試管內(nèi)一步成苗方法。 本發(fā)明的技術解決方案是一種東北紅豆杉試管內(nèi)一步成苗方法，其步驟如下
(1)取東北紅豆杉野生實生苗主干上的新發(fā)主莖，切割成段作為外植體備用；
(2)莖段生根同時腋芽萌發(fā)生長培養(yǎng)基成分和含量培養(yǎng)基+吲哚乙酸IAA(O.03 O. 04 mg · L O + 蔡乙酸 NAA(O. 02 O. 03 mg · L O + 激動素 KT (O. 11 O. 12 mg · L O +赤霉素 GA3 (2. 60 2. 80 mg .171);培養(yǎng)基:110. O mg *L_1 (NH4) 2S04, 560. O mg ^L-1KNO3,40. 5mg · L-1CaCl2 · 2H20,1. 20 mg · L-1MgSO4 · 7H20,95. 0 mg · L-1KH2PO4,1. 00 mg · L-1ZnSO4 · 7H20,
0.2 mg · L-1KLO. 4 mg · [1H3BO3 ；4. 64 mg · L-1FeSO4 · 7H20，6. 22 mg · L-1Na2 · EDTA · 2H20 ；3. 70 mg · L 1MnSO4 · 4H20 ；0. 3 mg · L 1 煙酸，0. 5 mg · L 1 鹽酸批口多醇(VB6),1. 50 mg · L 1 甘氨酸；添加瓊脂粉8.0 g ·Ι^，添加蔗糖20. O g 調(diào)節(jié)pH值至5. 6，嫩莖段在光照周期
6h · Cf1、光照強度700 Ix和溫度20 ±2°C條件下培養(yǎng)。在步驟(2)之后將種苗植株栽植到腐熟草炭土、腐爛松針和珍珠巖基質(zhì)中，混合比例3: 2:1，溫度控制在20±2°C，保持相對濕度在70%，自然光照8 h · Cf1。
本發(fā)明的優(yōu)點是1、本發(fā)明利用植物組織培養(yǎng)技術，采用東北紅豆杉野生實生苗主干上的新發(fā)莖尖為材料，在試管內(nèi)調(diào)控莖段生根同時腋芽萌發(fā)生長，以達到莖節(jié)增殖的一步快繁目標，解決了種子繁殖困難和扦插繁殖生根率低、移栽成活率及野生資源受滅絕性威脅等問題。本發(fā)明為進一步人工規(guī)模化繁殖和栽培東北紅豆杉提供優(yōu)質(zhì)種苗。2、當種苗擴繁到一定數(shù)量后，進行煉苗移栽，小植株成活率可達到95. 2%以上。下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方式作進一步詳細描述。
具體實施例方式I材料與方法
1.1材料及處理
7月上旬，采取東北紅豆杉野生實生苗主干上的新發(fā)主莖(2. O 3. O cm)，并將主莖剪成段(長度為O. 5 cm)后，摘去嫩針葉及短小葉柄，用70%乙醇(體積分數(shù))涮洗40 S，移至飽和次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸鈉毒傷的組織后切割成段作為外植體備用。1. 2東北紅豆杉莖段生根同時腋芽萌發(fā)生長、植株快速再生體系建立和栽培
培養(yǎng)基成分和含量110. O mg · I^1(NH4)2SO4JeO. O mg · L-1KNO3,40. 5mg · L-1CaCl2 · 2H 20,1. 20 mg · L-1MgSO4 · 7H20,95. 0 mg · L-1KH2PO4,1. 00 mg · L-1ZnSO4 · 7H20,0. 2 mg · L-1KLO. 4 mg · [1H3BO3 ；4. 64 mg · L-1FeSO4 · 7H20，6. 22 mg · L-1Na2 · EDTA · 2H20 ；3. 70 mg .L-1MnSO4 ·4Η20 ；0. 3 mg *L_1 煙酸,0. 5 mg *L_1 鹽酸卩比卩多醇(VB6),1. 50 mg *L_1 甘氨酸。培養(yǎng)基中附加吲哚乙酸IAA (O. 07 O. 12 mg .171)、萘乙酸NAA (O. 05 O. 10 mg .171)、激動素 KT (O. 03 O. 08 mg · L-1)和赤霉素 GA3 (1. 30 2. 40 mg · L—1)，瓊脂粉 8. O g · L-1，添加蔗糖20. O g · L—1，調(diào)節(jié)pH值至5. 6，嫩莖段在光照周期6 h · cf1、光照強度700 Ix和溫度(20±2) °C條件下培養(yǎng)。為提高東北紅豆杉嫩莖段生根的速度及生根率和腋芽萌發(fā)生長速度，通過均勻設計法設計實驗，選用U12 (124)均勻表，每個處理接種10個嫩莖段，重復3次，篩選確定影響東北紅豆杉莖段生根同時腋芽萌發(fā)生長的吲哚乙酸、萘乙酸、激動素和赤霉素最佳濃度配比。莖段培養(yǎng)45 d統(tǒng)計生根率和長度，以均出現(xiàn)莖段生根和腋芽萌發(fā)生長的苗為準。生根率=(生根的莖段數(shù)/接種的莖段總數(shù))X 100%，生長率=(苗總長度-O. 5) /苗總長度X 100%，莖段腋芽長度為I個培養(yǎng)周期過程中，莖段腋芽萌發(fā)生長后的腋芽長度(不包括原莖段長度)。莖段生根后腋芽萌發(fā)生長至2. 00 cm，腋芽發(fā)出10 12片針葉時，在無菌條件下打開培養(yǎng)瓶，將莖段留2葉剪下苗干，并將苗干切割成I 2葉I段(O. 5 cm左右)，再次將小莖段轉(zhuǎn)接到莖段生根同時腋芽萌發(fā)生長培養(yǎng)基中，計算出每個莖段生根同時腋芽萌發(fā)生長的每瓶增殖倍數(shù)和周期。當種苗擴繁到需要數(shù)量后，且小植株長至1. 50 cm時，將小植株從培養(yǎng)瓶中取出，放在殺毒礬溶液(濃度為2 mg · L-1)中洗凈根上的瓊脂，將小植株栽植到經(jīng)殺毒礬(100倍液)消毒過的腐熟草炭土、腐爛松針和珍珠巖(3: 2:1)的基質(zhì)中，覆蓋塑料薄膜(透性好)進行保溫保濕，溫度控制在(20±2) °C，保持相對濕度在70%，自然光照8 h · Cf1，溫度升高時，適當通風換氣。2結(jié)果與分析
2.1吲哚乙酸、萘乙酸、激動素和赤霉素對東北紅豆杉莖段生根的影響
數(shù)據(jù)(表I)經(jīng)均勻設計軟件分析處理后可得回歸方程為7=111 - 275^ - 33ΖΤ2 +288為，顯著性水平a = ο. 05，復相關系數(shù)TP= O. 9795，剩余標準差S=1.8800，檢驗值=63. 05 >臨界值/Vo5，3，8) = 4. 066，回歸方程具有顯著性，吲哚乙酸、萘乙酸和激動素對莖段的生根影響具有顯著性，赤霉素對莖段的生根影響不顯著。通過計算吲哚乙酸、萘乙酸和激動素對生根的貢獻值和貢獻率可知，U1 = 290，UJU = 43. 4% 'U2 = 305，UjU = 45. 7% ；U, = 209，UJU= 31. 4%，但從數(shù)值來看，吲哚乙酸、萘乙酸和激動素三者對生根率的貢獻差距不大，說明吲哚乙酸、萘乙酸和激動素均在東北紅豆杉莖段生根起同等不可缺少的重要作用。因激動素與生根率呈正相關，而吲哚乙酸和萘乙酸與生根率呈負相關。由此推測，激動素質(zhì)量濃度高于O. 08 mg · L-1的，吲哚乙酸和萘乙酸質(zhì)量濃度分別低于O. 07 mg · Γ1和O. 05 mg · L—1可能有更高的生根率。為驗證此推測，又以激動素為O. 08、0. 09、0. 10、0. 11、O. 12,0. 13,0. 14 和 O. 15 mg · Λ 吲哚乙酸質(zhì)量濃度為 O. 07,0. 06,0. 05,0. 04,0. 03,0. 02、O. 01 和 O. 00 mg .Γ1，萘乙酸質(zhì)量濃度為 O. 05,0. 04,0. 03,0. 02,0. 01 和 O. 00 mg .171 開展8個水平的補充試驗，重復3次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吲哚乙酸質(zhì)量濃度為(O. 03 O. 06 mg Γ1)、萘乙酸質(zhì)量濃度為(O. 02 O. 04 mg · Γ1)和激動素質(zhì)量濃度為(O. 10 O. 13 mg · Γ1)時，東北紅豆杉嫩莖段生根率最高，平均生根率達99. 3%以上。均高于表I所列12個處理的生根率。表I影響東北紅豆杉嫩莖段生根和腋芽生長的因素篩選U12 (124)試驗設計與結(jié)果
權利要求
1.一種東北紅豆杉試管內(nèi)一步成苗方法，其特征在于步驟如下(1)取東北紅豆杉野生實生苗主干上的新發(fā)主莖，切割成段作為外植體備用；(2)莖段生根同時腋芽萌發(fā)生長培養(yǎng)基成分和含量培養(yǎng)基+吲哚乙酸IAAO. 03 O.04 mg *L 1 +蔡乙酸 NAA O. 02 O. 03 mg *L 1 + 激動素 KT O. 11 O. 12 mg *L 1 +赤霉素 GA3 2. 60 2. 80 mg · L-1 ;培養(yǎng)基:110.0 mg · L-1 (NH4) 2S04, 560. O mg · L-1KNO3,40. 5 mg · L-1CaCl2 · 2H20,1. 20 mg · L-1MgSO4 · 7H20,95. 0 mg · L-1KH2PO4,1. 00 mg · L-1ZnSO4 · 7H20,0.2 mg · L-1KLO. 4 mg · [1H3BO3 ；4. 64 mg · L-1FeSO4 · 7H20，6. 22 mg · L-1Na2 · EDTA · 2H20 ； 3. 70 mg · L 1MnSO4 · 4H20 ；0. 3 mg · L 1 煙酸，0. 5 mg · L 1 鹽酸批口多醇(VB6),1. 50 mg · L 1 甘氨酸；添加瓊脂粉8.0 g ·Ι^，添加蔗糖20. O g 調(diào)節(jié)pH值至5. 6，嫩莖段在光照周期 6 h · Cf1、光照強度700 Ix和溫度20 ±2°C條件下培養(yǎng)。
2.按照權利要求1所述的東北紅豆杉試管內(nèi)一步成苗方法，其特征在于在步驟(2)之后將種苗植株栽植到腐熟草炭土、腐爛松針和珍珠巖基質(zhì)中，混合比例3: 2: 1，溫度控制在20 ±2 °C，保持相對濕度在70%，自然光照8 h · Cf1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物種植技術，即東北紅豆杉試管內(nèi)一步成苗方法。其步驟如下(1)取東北紅豆杉野生實生苗主干上的新發(fā)主莖，切割成段作為外植體備用；(2)莖段生根同時腋芽萌發(fā)生長培養(yǎng)基成分和含量培養(yǎng)基＋吲哚乙酸IAA(0.03～0.04mg·L-1)＋萘乙酸NAA(0.02～0.03mg·L-1)＋激動素KT(0.11～0.12mg·L-1)＋赤霉素GA3(2.60～2.80mg·L-1)；添加瓊脂粉8.0g·L-1，添加蔗糖20.0g·L-1，調(diào)節(jié)pH值至5.6，嫩莖段在光照周期6h·d-1、光照強度700lx和溫度20±2℃條件下培養(yǎng)。本發(fā)明為進一步人工規(guī)?；敝澈驮耘鄸|北紅豆杉提供優(yōu)質(zhì)種苗。煉苗移栽成活率可達到95.2%以上。
文檔編號A01H4/00GK103039365SQ20131001895
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月18日 優(yōu)先權日2013年1月18日
發(fā)明者朱俊義, 顧地周, 顧川岳, 姜云天, 楊麗娟, 郭志欣, 梁宇, 潘雨, 張學士 申請人:通化師范學院