專利名稱：一種黑芥小孢子培養(yǎng)獲得再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黑芥小孢子組織培養(yǎng)獲得再生植株的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
單倍體是指僅攜有配子染色體數(shù)目的個(gè)體，在作物育種實(shí)踐和遺傳育種理論研究中均具有重要意義。游離小孢子培養(yǎng)作為人工誘導(dǎo)單倍體的有效途徑，具有實(shí)用性。在育種實(shí)踐中，對(duì)單倍體進(jìn)行染色體加倍當(dāng)代就可以獲得純系即雙單倍體群體，比采用傳統(tǒng)的自交純化方法省時(shí)約3-5年，大大提高育種效率，縮短了育種周期。在遺傳育種理論研究中，雙單倍體在遺傳上具有絕對(duì)的純合性，是進(jìn)行AFLP、RFLP和SSR等分子標(biāo)記、遺傳圖譜繪制及重要抗性基因定位研究的良好材料，也是進(jìn)行物種進(jìn)化研究、遺傳分析和植物基因克隆篩選的理想材料。黑芥(Ara1S1Sica nigra, BB)是十字花科蕓薹屬3個(gè)基本種之一,多為野生分布。已有研究表明，黑芥所在的BB基因組中存在對(duì)黑腐病主要致病生理小種I和4的抗性，對(duì)根腫病的高抗性，以及對(duì)黑脛病的全生育期抗性。而向蕓薹屬蔬菜，特別是受這三種病害影響較為嚴(yán)重的甘藍(lán)和白菜中轉(zhuǎn)移這些優(yōu)良抗性基因，將對(duì)培育多抗、優(yōu)質(zhì)蔬菜新品種具有重要意義。但目前黑芥的抗病研究只局限于對(duì)材料各種生育期的抗病性鑒定，進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究相對(duì)滯后，進(jìn)展緩慢。特別是對(duì)相關(guān)遺傳圖譜的繪制及重要抗性基因的定位研究極少，原因之一是缺少遺傳上純合、表現(xiàn)型一致的研究群體，而小孢子培養(yǎng)技術(shù)為獲得此群體提供了一條快捷、有效的途徑。黑芥是十字花科作物中最不容易進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)的材料之一，盡管在蕓薹屬很多作物中已實(shí)現(xiàn)通過(guò)小孢子培養(yǎng)成功獲得單倍體。有關(guān)黑芥游離小孢子培養(yǎng)研究，目前國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，國(guó)外也僅 見(jiàn)早期的一篇報(bào)道，并且其出胚率低，再生株獲得數(shù)量很有限(Lichter 1989)。本研究通過(guò)對(duì)黑芥游離小孢子進(jìn)行培養(yǎng)，并成功獲得一定數(shù)量的雙單倍體再生植株，為開(kāi)展黑芥種質(zhì)資源的遺傳研究，建立高效簡(jiǎn)便的育種方法提供重要的理論與技術(shù)指導(dǎo)，同時(shí)為相關(guān)遺傳圖譜繪制、重要抗性基因定位及物種進(jìn)化研究等提供良好的研究材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，針對(duì)黑芥是十字花科作物中不易進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，從而也難以獲得遺傳上純合、表現(xiàn)型一致的雙單倍體再生植株材料的缺陷，提供一種使能批量獲得遺傳上純合、表現(xiàn)型一致雙單倍體再生植株材料的黑芥小孢子培養(yǎng)獲得再生植株的方法，以建立黑芥小孢子培養(yǎng)再生體系，加快黑芥的育種進(jìn)程與效率；同時(shí)可為黑芥遺傳圖譜繪制及抗性基因的精確定位、克隆和轉(zhuǎn)基因等研究提供材料。本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)。—種黑芥小孢子培養(yǎng)獲得再生植株的方法，該方法按如下步驟進(jìn)行(I)培養(yǎng)基的配制包括小孢子培養(yǎng)各階段的培養(yǎng)基，它們的組分與各組分在每升培養(yǎng)基中的重量為
1)胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基NLN-13液體培養(yǎng)基+蔗糖130g/L, pH 5. 6飛.0，過(guò)濾滅菌；
2)胚狀體分化培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基 + ZT O. 5^2. O mg/L + NAA O. θΓθ.1 mg/L + BAP
O.5 2· O mg/L +鹿糖20 30 g/L +瓊脂7 9 g/L, pH 5. 6 6· O,高溫滅菌；
3)萌發(fā)、生根培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基+NAA O. 05 O.1 mg/L +蔗糖30 g/L +瓊脂8 g/L,pH 5. 8,高溫滅菌；
(2)供體植株、花蕾的選擇與預(yù)處理
O供體植株、花蕾的選擇選擇生長(zhǎng)健康的黑芥作為供體植株；并從中選擇花瓣與花藥長(zhǎng)度比在O. 7^1. O之間，處于單核中晚期的花蕾為供體花蕾；
2)花蕾滅菌先用純凈水清洗花蕾3次后，將其放入由O.1% HgCl2 + O. 1%吐溫20配成的滅菌液中，搖床按50-80 rpm輕微搖晃12分鐘進(jìn)行表面消毒后，再在超凈臺(tái)上用無(wú)菌水清洗4次，備用；
3)花蕾小孢子的分離、混配與分裝在超凈臺(tái)上將滅菌后花蕾置于無(wú)菌燒杯中，加入ImL胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基后用平頭玻棒壓碎花蕾、再加入9 mL相同培養(yǎng)基并攪成懸浮液；用40Mm無(wú)菌尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾于離心管中，IOOOrpm離心4分鐘，棄上清液；加入胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基至平均每4mL培養(yǎng)基中含1. O個(gè)花蕾所含的小孢子量后，再將該液中的培養(yǎng)基與由NLN-13液體培養(yǎng)基+ lg/L活性炭、經(jīng)高溫滅菌的活性炭混合液按體積O. 05 mL / 4mL比例混配成小孢子懸浮液；并分裝于直徑為6 cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,加蓋后用parafilm膜封口，備用； (3)小孢子胚狀體的誘導(dǎo)培養(yǎng)將上述培養(yǎng)皿置于31-33°C培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)24-48小時(shí)；后置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)15-20天至胚狀體出現(xiàn)；再在25°C黑暗下50rpm振蕩培養(yǎng)7-10天，至子葉胚狀體形成；
(4)再生植株的分化與萌發(fā)培養(yǎng)將子葉胚狀體平放于胚狀體分化培養(yǎng)基上，25°C每天光照16小時(shí)培養(yǎng)15 20天至胚狀體膨大并再生出新植株；
(5)再生植株的生根培養(yǎng)與移栽切取萌發(fā)有正常生長(zhǎng)點(diǎn)的再生植株插于生根培養(yǎng)基中，25°C每天光照16小時(shí)培養(yǎng)至生根；將生根再生植株移入由泥炭與珍珠巖按體積2 I配制的基質(zhì)中，澆透水，覆蓋塑料膜后在25°C下培養(yǎng)I周；
(6)再生植株的倍性檢測(cè)取移栽成活再生植株的嫩葉，用德國(guó)Partec公司生產(chǎn)的partec PA倍性分析儀檢測(cè)該再生植株的DNA倍性。本發(fā)明的有益效果是1、本發(fā)明對(duì)黑芥的小孢子進(jìn)行培養(yǎng)，能批量獲得遺傳上純合、表現(xiàn)型一致的雙單倍體再生植株材料，以建立黑芥小孢子培養(yǎng)再生體系，加快黑芥的育種進(jìn)程與效率；同時(shí)可為黑芥遺傳圖譜繪制及抗性基因的精確定位、克隆和轉(zhuǎn)基因等研究提供材料。2、本發(fā)明黑芥小孢子培養(yǎng)的出胚率，最高可達(dá)15個(gè)胚/蕾；
3、本發(fā)明胚狀體的出苗率，平均達(dá)50%。
具體實(shí)施例方式通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例1 :(黑芥小孢子培養(yǎng)再生植株的方法I)(1)培養(yǎng)基的配制包括小孢子培養(yǎng)各階段的培養(yǎng)基，它們的組分與各組分在每升培養(yǎng)基中的重量為
I)胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基NLN-13液體培養(yǎng)基+蔗糖130 g/L, pH 6.0，過(guò)濾滅菌(其中NLN-13培養(yǎng)基配方見(jiàn)表I) ; 2)胚狀體分化培養(yǎng)基=B5培養(yǎng)基+ ZT 1.5 mg/L + NAA
O.05 mg/L + BAP O. 8 mg/L + 蔗糖 20 g/L + 瓊脂 7 g/L, pH 6. 0，高溫滅菌，(其中 B5 培養(yǎng)基配方見(jiàn)表I);
3)萌發(fā)、生根培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基+ NAA O. 08 mg/L +蔗糖30 g/L +瓊脂7g/L，pH
5.8，高溫滅菌(其中MS培養(yǎng)基配方見(jiàn)表I)；
表i Xm-13、B;和MS培養(yǎng)基配方
權(quán)利要求
1. 一種黑芥小孢子培養(yǎng)獲得再生植株的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行 (I)培養(yǎng)基的配制包括小孢子培養(yǎng)各階段的培養(yǎng)基，它們的組分與各組分在每升培養(yǎng)基中的重量為 1)胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基NLN-13液體培養(yǎng)基+蔗糖130g/L, pH 5. 6飛.0，過(guò)濾滅菌； 2)胚狀體分化培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基 + ZT O. 5^2. O mg/L + NAA O. θΓθ.1 mg/L + BAPO.5 2· O mg/L +鹿糖20 30 g/L +瓊脂7 9 g/L, pH 5. 6 6· O,高溫滅菌； 3)萌發(fā)、生根培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基+NAA O. 05 O.1 mg/L +蔗糖30 g/L +瓊脂8 g/L,pH 5. 8,高溫滅菌； (2)供體植株、花蕾的選擇與預(yù)處理 O供體植株、花蕾的選擇選擇生長(zhǎng)健康的黑芥作為供體植株；并從中選擇花瓣與花藥長(zhǎng)度比在O. 7^1. O之間，處于單核中晚期的花蕾為供體花蕾； 2)花蕾滅菌先用純凈水清洗花蕾3次后，將其放入由O.1% HgCl2 + O. 1%吐溫20配成的滅菌液中，搖床按50-80 rpm輕微搖晃12分鐘進(jìn)行表面消毒后，再在超凈臺(tái)上用無(wú)菌水清洗4次，備用； 3)花蕾小孢子的分離、混配與分裝在超凈臺(tái)上將滅菌后花蕾置于無(wú)菌燒杯中，加入ImL胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基后用平頭玻棒壓碎花蕾、再加入9 mL相同培養(yǎng)基并攪成懸浮液；用40Mm無(wú)菌尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾于離心管中，IOOOrpm離心4分鐘，棄上清液；加入胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基至平均每4mL培養(yǎng)基中含1. O個(gè)花蕾所含的小孢子量后，再將該液中的培養(yǎng)基與由NLN-13液體培養(yǎng)基+ lg/L活性炭、經(jīng)高溫滅菌的活性炭混合液按體積O. 05 mL / 4mL比例混配成小孢子懸浮液；并分裝于直徑為6 cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,加蓋后用parafilm膜封口，備用； (3)小孢子胚狀體的誘導(dǎo)培養(yǎng)將上述培養(yǎng)皿置于31-33°C培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)24-48小時(shí)；后置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)15-20天至胚狀體出現(xiàn)；再在25°C黑暗下50rpm振蕩培養(yǎng)7-10天，至子葉胚狀體形成； (4)再生植株的分化與萌發(fā)培養(yǎng)將子葉胚狀體平放于胚狀體分化培養(yǎng)基上，25°C每天光照16小時(shí)培養(yǎng)15 20天至胚狀體膨大并再生出新植株； (5)再生植株的生根培養(yǎng)與移栽切取萌發(fā)有正常生長(zhǎng)點(diǎn)的再生植株插于生根培養(yǎng)基中，25°C每天光照16小時(shí)培養(yǎng)至生根；將生根再生植株移入由泥炭與珍珠巖按體積2 1配制的基質(zhì)中，澆透水，覆蓋塑料膜后在25 °C下培養(yǎng)I周； (6)再生植株的倍性檢測(cè)取移栽成活再生植株的嫩葉，用德國(guó)Partec公司生產(chǎn)的partec PA倍性分析儀檢測(cè)該再生植株的DNA倍性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種黑芥小孢子培養(yǎng)獲得再生植株的方法，屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。方法包括(1)培養(yǎng)基的配制；(2)供體植株、花蕾的選擇與預(yù)處理；(3)小孢子胚狀體的誘導(dǎo)培養(yǎng)；(4)再生植株的分化與萌發(fā)培養(yǎng)；(5)再生植株的生根培養(yǎng)與移栽；(6)再生植株的倍性檢測(cè)等步驟。本發(fā)明對(duì)黑芥的小孢子進(jìn)行培養(yǎng)，其出胚率最高達(dá)15個(gè)胚/蕾，出苗率平均達(dá)50%，能批量獲得遺傳上純合、表現(xiàn)型一致的雙單倍體再生植株材料。本發(fā)明可在黑芥育種、遺傳圖譜、抗性基因定位、克隆及轉(zhuǎn)基因等研究領(lǐng)域中推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103053424SQ20131001392
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者盛小光, 顧宏輝, 虞慧芳, 趙振卿, 王建升, 許映君 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院