專利名稱：一種“妃子笑”荔枝品種離體再生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及‘妃子笑’荔枝品種離體再生的方法，具體的，本發(fā)明涉及‘妃子笑’荔枝品種從愈傷組織誘導(dǎo)經(jīng)體胚發(fā)生途徑，發(fā)育成完整離體再生植株的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
蒸枝(Litchi chinensis Sonn.)是我國(guó)南方主要的熱帶南亞熱帶果樹,在熱帶農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位，是農(nóng)民收入來源的重要組成部分。隨著人們生活水平的日益提高，對(duì)商品價(jià)值的追求也越來越高，加快荔枝育種技術(shù)與新品種培育的需求已迫在眉睫。荔枝童期長(zhǎng)，遺傳組成高度雜合，傳統(tǒng)的育種技術(shù)來改良荔枝性狀及培育新品種費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、困難大，已經(jīng)不能滿足荔枝產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需要。而分子克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)日漸成熟，采用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種有定向改良、擴(kuò)展育種范圍和縮短育種年限等特點(diǎn)。自1983年傅蓮芳等報(bào)道荔枝組織培養(yǎng)獲得完整植株以來，研究者陸續(xù)進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究，但是，進(jìn)展比較緩慢。目前荔枝生物技術(shù)育種的瓶頸在于未能建立起高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，而建立荔枝離體再生體系是高效遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的前提和基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種妃子笑荔枝品種離體再生的方法。該方法通過優(yōu)化愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組分、體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的培養(yǎng)基組分，特別是激素的選擇和濃度，同時(shí)優(yōu)化了培養(yǎng)條件，獲得了很高的愈傷組織誘導(dǎo)率和體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)效率。本發(fā)明所提供的荔枝妃子笑品種離體再生的方法，包括下述步驟I)以荔枝妃子笑品種花藥為外`植體，將外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，篩選得到胚性愈傷組織；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為3mg/L的2，4-D、終濃度為0. 5mg/L的6-BA、終濃度為0. 5mg/L的NAA、終濃度為30g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基或者M(jìn)S培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為lmg/L的2，4-D、終濃度為Img/L的6-BA、終濃度為lmg/L的NAA、終濃度為30g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選為MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為3mg/L的2，4-D、終濃度為0. 5mg/L的6-BA、終濃度為0. 5mg/L的NAA、終濃度為30g/L的蔗糖和終濃度為7g/L的瓊脂，滅菌后，調(diào)節(jié)PH值至5. 8獲得的培養(yǎng)基或者M(jìn)S培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為lmg/L的2，4_D、終濃度為lmg/L的6-BA、終濃度為lmg/L的NAA、終濃度為30g/L的蔗糖和終濃度為7g/L的瓊月旨，滅菌后，調(diào)節(jié)PH值至5. 8獲得的培養(yǎng)基；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件是23-27°C暗培養(yǎng)15-30天。2)對(duì)步驟I)獲得的愈傷組織進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)得到體細(xì)胞胚；所述體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為5mg/L的KT、終濃度為0. lmg/L的NAA、終濃度為100mg/L的肌醇、終濃度為50g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基或者M(jìn)S培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為5mg/L的ZT、終濃度為0. lmg/L的NAA、終濃度為100mg/L的肌醇、終濃度為50g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基；所述體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)選為MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為5mg/L的KT、終濃度為0. lmg/L的NAA+終濃度為100mg/L的肌醇+終濃度為50g/L的蔗糖和終濃度為10g/L的瓊脂，滅菌調(diào)節(jié)pH至5. 8獲得的培養(yǎng)基或者即MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為5mg/L的ZT、終濃度為0. lmg/L的NAA、終濃度為100mg/L的肌醇、終濃度為50g/L的蔗糖和終濃度為10g/L的瓊脂；所述體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件是23-27°C暗培養(yǎng)30-45天；3)對(duì)步驟2)獲得的體細(xì)胞胚進(jìn)行成熟培養(yǎng)獲得成熟的細(xì)胞胚；所述成熟培養(yǎng)的培養(yǎng)基為50ml/L的椰乳、終濃度為60g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基；所述成熟培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)選為50ml/L的椰乳、終濃度為60g/L的蔗糖和終濃度為10g/L瓊脂，滅菌，調(diào)pH至5. 8獲得的培養(yǎng)基；所述成熟培養(yǎng)的條件為溫度23-27°C，光照培養(yǎng)。椰乳(或者椰汁)為新鮮椰子倒出的經(jīng)雙層紗布過濾后得到的椰子水。4)對(duì)步驟3)獲得的成熟的細(xì)胞胚進(jìn)行再生培養(yǎng)，再生培養(yǎng)的培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為30g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基，優(yōu)選為在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為30g/L的蔗糖和終濃度為7g瓊脂，滅菌，調(diào)pH至5. 8獲得的培養(yǎng)基；再生培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度23-27°C，光照培養(yǎng)。
所述方法中，所述步驟I)中所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為15-30天；所述步驟2)中所述體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為30-45天；所述步驟3)中所述成熟培養(yǎng)的時(shí)間為25-35天，優(yōu)選30天。所述步驟4)中所述再生培養(yǎng)的時(shí)間為55-65天，優(yōu)選為60天。所述的方法中，所述步驟3)和步驟4)中所述光照培養(yǎng)的光照強(qiáng)度均為1800-2500Lx, 15-17 小時(shí) / 天，優(yōu)選為 2000Lx, 16 小時(shí) / 天。所述方法中，所述步驟I)中還包括將得到的胚性愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)的方法是將胚性愈傷組織接種在繼代培養(yǎng)基I和繼代培養(yǎng)基II上交替培養(yǎng)，每隔20-25d繼代一次；繼代培養(yǎng)條件為是23-27°C，暗培養(yǎng)；其中，繼代培養(yǎng)基I為在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為lmg/L的2，4_D、終濃度為30g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基；優(yōu)選為在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為lmg/L的2，4-D、終濃度為30g/L的蔗糖和終濃度為7g/L的瓊脂，滅菌，調(diào)pH值至5. 8獲得的培養(yǎng)基；繼代培養(yǎng)基II為MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為lmg/L的2，4-D、終濃度為0. 5mg/L的KT、終濃度為5mg/L的AgNO3、終濃度為30g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基，優(yōu)選為為MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為lmg/L的2，4-D、終濃度為0. 5mg/L的K T、終濃度為5mg/L的AgNO3、終濃度為30g/L的蔗糖和終濃度為7g/L的瓊脂，滅菌，調(diào)pH值至5. 8獲得的培養(yǎng)基。所述繼代培養(yǎng)的次數(shù)為2-4次，要挑選淡黃色、松散型胚性愈傷組織進(jìn)行繼代。本發(fā)明的上述技術(shù)方案獲得了優(yōu)異的效果。本發(fā)明的通過優(yōu)化愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組分、體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的培養(yǎng)基組分，特別是激素的選擇和濃度，同時(shí)優(yōu)化了培養(yǎng)條件，獲得了很高的愈傷組織誘導(dǎo)率和體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)效率。選取荔枝品種‘妃子笑’花藥為外植體接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+3mg/L 2,4-D+O. 5mg/L BA+0. 5mg/L NAA+30g/L 糖+7g/L瓊脂)上進(jìn)行暗培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到92. 86% ;將篩選的胚性愈傷組織接種在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+0. lmg/L NAA+5mg/L KT+100mg/L 肌醇 +50g/L 蔗糖 +10g/L 瓊脂)上暗培養(yǎng)30d左右，可獲得高分化率的球形胚(每鮮克愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚達(dá)489個(gè))。挑選形態(tài)大小基本一致、白色體細(xì)胞胚接種至成熟培養(yǎng)基(MS+50ml/L椰乳+60g/L蔗糖+10g/L瓊月旨，光照培養(yǎng)；將成熟后的白色體細(xì)胞胚接種于植株再生培養(yǎng)基(MS+30g/L蔗糖+7g瓊脂)光照培養(yǎng)60d左右，可獲得完整離體再生植株。本發(fā)明建立了 ‘妃子笑’荔枝品種從愈傷組織誘導(dǎo)經(jīng)體胚發(fā)生途徑，發(fā)育成完整離體再生植株的方法，攻克了荔枝離體再生體系難建立的問題，并獲得了很高的誘導(dǎo)率，提高了生產(chǎn)效率,降低了成本,為荔枝品種改良和生物技術(shù)育種奠定了良好的基礎(chǔ)。


圖1為‘妃子笑’荔枝品種離體再生體系建立過程中初始誘導(dǎo)的愈傷組織(a);篩選的胚性愈傷組織(b);誘導(dǎo)的體細(xì)胞胚(C);成熟的體細(xì)胞胚(d);離體再生植株(e);移栽的再生植株(f)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。下述實(shí)施例中使用的材料2，4-D :購自上海源聚生物科技有限公司，批號(hào)081223，(2，4-二氯苯氧乙酸)6-BA:購自上海伯奧生物科技有限公司，批號(hào)090601，(6_芐氨基嘌呤)KT :購自上海伯奧生物科技有限公司，批號(hào)080623，(6糠氨基嘌呤)NAA:購自上海伯 奧生物科技有限公司，批號(hào)090219，(a_萘乙酸)ZT:購自上海源聚生物科技有限公司，批號(hào)091016，(反玉米素)TDZ :購自上海源聚生物科技有限公司，批號(hào)100312，(噻苯隆)實(shí)施例1、荔枝品種‘妃子笑’離體再生的方法及其效果一、外值體的制備和接種材料荔枝品種‘妃子笑’露白點(diǎn)期花蕾，2009年12月取自海南省儋州市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所荔枝種質(zhì)圃內(nèi)。方法自來水沖洗摘取的花蕾30min，在無菌操作臺(tái)上將預(yù)處理過的花蕾用70%酒精浸泡消毒30s,后放入0.1 % HgCl2溶液中消毒8min,最后用高壓滅菌無菌水沖洗5_6次，獲得無菌材料。用手術(shù)刀和尖頭鑷子將花藥從花蕾里輕輕撥出后作為外植體，該外植體用于接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)。二、愈傷組織誘導(dǎo)與篩選
1、組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的制備愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，采用正交法設(shè)計(jì)，添加2，4-D (終濃度為 0、1、2 或 3mg/L)、6-BA(終濃度為 0,0. 2,0. 5 或 lmg/L)、KT(終濃度為 0,0. 5、I 或 2mg/L)、NAA(終濃度為0、0. 2,0. 5或lmg/L)、終濃度為30g/L的蔗糖和終濃度為7g/L的瓊脂，培養(yǎng)基PH值為5. 8 (其中，四種激素具體終濃度組合如表I所示)。其中，MS培養(yǎng)基為常用培養(yǎng)基，可以商業(yè)途徑購買，也可以按照以下成分及濃度，自己配制MS基本培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基的組成成分及其濃度如下大量元素1900mg/L 硝酸鉀(KNO3)，1650mg/L 硝酸銨(NH4NO3)，170mg/L 磷酸二氫鉀(KH2PO4)，370mg/L 七水硫酸鎂(MgS04 7H20), 440mg/L 二水氯化鈣(CaCl2 2H20);微量元素0. 83mg/L 碘化鉀(KI)，6. 2mg/L 硼酸(H3BO3)，22. 3mg/L 四水硫酸錳(MnS04 4H20)，8. 6mg/L 七水硫酸鋅(ZnS04 7H20), 0. 25mg/L 鑰酸鈉(Na2Mo04 2H20), 0. 025mg/L 五水硫酸銅(CuSO4 5H20)，
0.025mg/L 六水氯化鈷(CoCl2 6H20);鐵鹽37. 25mg/L 乙二胺四乙酸二鈉(Na2 EDTA)，27. 85mg/L七水硫酸亞鐵(FeSO4 7H20);有機(jī)成分100mg/L肌醇，2mg/L甘氨酸，0. lmg/L鹽酸硫胺素(VBl)，0. 5mg/L鹽酸吡哆醇(VB6)，0. 5mg/L煙酸(VB3或VPP)組成。MS基本培養(yǎng)基溶劑為水。2、誘導(dǎo)培養(yǎng)方法將步驟一獲得的妃子笑荔枝品種花藥(外植體)接種上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在溫度為25±2°C條件下，暗培養(yǎng)15-30天，誘導(dǎo)出愈傷組織(圖1中a)。計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率，研究不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合及濃度對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果如表I所示。由表I可以看出，愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3mg/L 2，4-D+O. 5mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂(即在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為3mg/L的2，4-D、終濃度為0. 5mg/L的6-BA、終濃度為0. 5mg/L的NAA、終濃度為30g/L的蔗糖和終濃度為7g/L的瓊脂，調(diào)節(jié)PH值至5. 8獲得的培養(yǎng)基，滅菌)，誘導(dǎo)率達(dá)92. 86% o 其次是 MS+lmg/L 2,4-D+lmg/L 6-BA+lmg/L NAA+30g/L 蔗糖+7g/L 瓊脂(即在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為lmg/L的2，4-D、終濃度為lmg/L的6-BA、終濃度為Img/L的NAA、終濃度為30g/L的蔗糖和終濃度為7g/L的瓊脂，調(diào)節(jié)PH值至5. 8獲得的培養(yǎng)基，滅菌)，誘導(dǎo)率達(dá)88. 24%。3、繼代培養(yǎng)將步驟2誘導(dǎo)的愈傷組織經(jīng)篩選(挑選淡黃色、松散型胚性愈傷組織)，獲得淡黃色、松散型胚性愈傷組織(圖1中b)。將篩選得到的淡黃色、松散型胚性愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代方法為接種在繼代培養(yǎng)基I和繼代培養(yǎng)基II上交替培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與步驟2所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)相同，每隔20-25d繼代一次，繼代2-4次，篩選獲得淡黃色、生長(zhǎng)旺盛、顆粒細(xì)小且松散型胚性愈傷組織。

繼代培養(yǎng)基I為在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為lmg/L的2，4_D、終濃度為30g/L的蔗糖和終濃度為7g/L的瓊脂，滅菌，調(diào)pH值至5. 8。繼代培養(yǎng)基II為MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為lmg/L的2，4_D、終濃度為
0.5mg/L的K T、終濃度為5mg/L的AgNO3、終濃度為30g/L的蔗糖和終濃度為7g/L的瓊脂，滅菌，調(diào)pH值至5.8。表I不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合及濃度對(duì)‘妃子笑’荔枝花藥誘導(dǎo)愈傷組織影響
權(quán)利要求
1.荔枝妃子笑品種離體再生的方法，包括下述步驟 1)以荔枝妃子笑品種花藥為外植體，將外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，篩選獲得胚性愈傷組織；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為3mg/L的2，4-D、終濃度為0. 5mg/L的6-BA、終濃度為0. 5mg/L的NAA、終濃度為30g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基或者M(jìn)S培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為lmg/L的2，4-D、終濃度為lmg/L的6-BA、終濃度為lmg/L的NAA、終濃度為30g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件是23-27°C暗培養(yǎng)15-30天； 2)對(duì)步驟I)獲得的胚性愈傷組織進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)得到體細(xì)胞胚；所述體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為5mg/L的KT、終濃度為0. lmg/L的NAA、終濃度為100mg/L的肌醇、終濃度為50g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基或者M(jìn)S培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為5mg/L的ZT、終濃度為0. lmg/L的NAA、終濃度為100mg/L的肌醇、終濃度為50g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基；所述體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件是23-27°C暗培養(yǎng)30-45天； 3)對(duì)步驟2)獲得的體細(xì)胞胚進(jìn)行成熟培養(yǎng)獲得成熟的細(xì)胞胚；所述成熟培養(yǎng)的培養(yǎng)基為50ml/L的椰乳、終濃度為60g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基；所述成熟培養(yǎng)的條件為溫度23-27°C，光照培養(yǎng)； 4)對(duì)步驟3)獲得的成熟的細(xì)胞胚進(jìn)行再生培養(yǎng)，再生培養(yǎng)的培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為30g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基；再生培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度23-27°C，光照培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟I)中所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為15-30天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中所述體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為30-45天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟3)中所述成熟培養(yǎng)的時(shí)間為25-35天，優(yōu)選30天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟4)中所述再生培養(yǎng)的時(shí)間為55-65天，優(yōu)選為60天。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟3)和步驟4)中所述光照培養(yǎng)的光照強(qiáng)度均為1800-2500LX, 15-17小時(shí)/天，優(yōu)選為2000Lx, 16小時(shí)/天。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟I)中還包括將得到的胚性愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)的方法是將胚性愈傷組織接種在繼代培養(yǎng)基I和繼代培養(yǎng)基II上交替培養(yǎng)，每隔20-25d繼代一次；繼代培養(yǎng)條件為是23-27°C，暗培養(yǎng)； 其中，繼代培養(yǎng)基I為在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為lmg/L的2，4-D、終濃度為30g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基；繼代培養(yǎng)基II為MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為lmg/L的2，4-D、終濃度為0. 5mg/L的K T、終濃度為5mg/L的AgNO3、終濃度為30g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述繼代培養(yǎng)的次數(shù)為2-4次。
9.荔枝妃子笑品種離體再生的專用配套培養(yǎng)基，包括愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為3mg/L的2，4-D、終濃度為0. 5mg/L的6-BA、終濃度為0. 5mg/L的NAA、終濃度為30g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基或者M(jìn)S培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為lmg/L的2，4-D、終濃度為lmg/L的6-BA、終濃度為lmg/L的NAA、終濃度為30g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基； 所述體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為5mg/L的KT、終濃度為.0.lmg/L的NAA、終濃度為100mg/L的肌醇、終濃度為50g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基或者M(jìn)S培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為5mg/L的ZT、終濃度為0. lmg/L的NAA、終濃度為100mg/L的肌醇、終濃度為50g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的配套培養(yǎng)基，其特征在于所述配套培養(yǎng)基中還包括成熟培養(yǎng)用培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)用培養(yǎng)基； 所述成熟培養(yǎng)用培養(yǎng)基為50ml/L的椰乳、終濃度為60g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基；所述再生培養(yǎng)用培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為30g/L的蔗糖的固體培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了荔枝妃子笑品種離體再生的方法。該方法，包括下述步驟1)以荔枝妃子笑品種花藥為外植體，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，篩選獲得胚性愈傷組織；培養(yǎng)基為MS+3mg/L 2，4-D+0.5mg/L BA+0.5mg/L NAA+30g/L糖；2)對(duì)胚性愈傷組織進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)得到體細(xì)胞胚；培養(yǎng)基為MS+0.1mg/L NAA+5mg/L KT+100mg/L肌醇+50g/L蔗糖；3)對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行成熟培養(yǎng)獲得成熟的細(xì)胞胚，培養(yǎng)基為MS+50ml/L椰乳+60g/L蔗糖；4)對(duì)成熟的細(xì)胞胚進(jìn)行再生培養(yǎng)，培養(yǎng)基為MS+30g/L蔗糖+7g瓊脂。本發(fā)明建立了‘妃子笑’荔枝品種離體再生植株的方法，并獲得了很高的誘導(dǎo)率，提高了生產(chǎn)效率，降低了成本，為荔枝品種改良和生物技術(shù)育種奠定了良好的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103053420SQ20131000188
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月5日
發(fā)明者李煥苓, 王果, 王家保, 張新春, 孫進(jìn)華 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所