專利名稱：一種家畜精液冷凍稀釋液及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物生殖生理與繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種家畜精液冷凍稀釋液及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
盡管家畜精液冷凍保存研究已經(jīng)開展了 50多年，但是解凍后的精液活力僅在30%-50%左右，人工授精后不返情率和產(chǎn)仔率均顯著低于新鮮和低溫冷藏精液。家畜精液冷·凍過程中，細(xì)胞內(nèi)外形成的冰晶對(duì)動(dòng)物精子造成的機(jī)械損傷直接導(dǎo)致冷凍后精子活力的下降，如何降低冰晶的產(chǎn)生、減少冰晶對(duì)家畜精子的損傷一直是家畜繁殖技術(shù)和低溫生物學(xué)研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。通過改變精液稀釋液的組成成分可以降低冷凍處理對(duì)精子的損傷，目前，滲透性有機(jī)溶劑和糖類已經(jīng)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物精液的冷凍保存研究中，但是有機(jī)溶劑和糖類并不能解決細(xì)胞內(nèi)外冰晶的產(chǎn)生問題。1969年，DeVries和Wohlschlag發(fā)現(xiàn)了一種新型的冰晶抑制劑-抗凍蛋白。抗
凍蛋白通過修飾冰晶性狀和抑制重結(jié)晶等作用方式來減少冰晶對(duì)組織細(xì)胞的機(jī)械損傷。一些研究表明，抗凍蛋白能提高人類和一些哺乳動(dòng)物精液冷凍保存后的頂體完整性和活力。然而，抗凍蛋白的應(yīng)用也存在一定的局限性。首先，作為一種異源蛋白，抗凍蛋白可能導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)生一定的免疫反應(yīng)；其次，目前抗凍蛋白的主要來源是從極地海洋魚類的血液中提取，而且這些技術(shù)和專利主要掌握在歐美國家手中，價(jià)格高昂；最后，抗凍蛋白的純度也存在一定的問題，這可能是導(dǎo)致相關(guān)研究結(jié)果之間差異甚至矛盾的主要原因。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明首次采用化學(xué)來源的冰晶抑制劑——肌醇類化合物來代替抗凍蛋白應(yīng)用于哺乳動(dòng)物精液的冷凍保存，從而避免了與抗凍蛋白應(yīng)用有關(guān)的缺陷，相關(guān)的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明的家畜精液冷凍稀釋液的制備方法，包括以下步驟在適量的超純水中加入三羥甲基氨基甲烷2. 71g、檸檬酸1. 4g、單糖1. 0g、青霉素10萬IU，鏈霉素10萬IU，肌醇類化合物O. 29-6. 97g，任選地加入滲透性保護(hù)劑5-20ml，攪拌均勻，調(diào)整pH值至6. 8-7. 2，加入經(jīng)滅活處理的新鮮蛋黃5-20ml,混合均勻后定容至100ml,于4°C下15000轉(zhuǎn)/分的速率離心I小時(shí)，取上清液用O. 45 ymMillipore濾器過濾即制得。本發(fā)明所述肌醇類化合物為1，3-環(huán)己二醇、1，4-環(huán)己二醇和1，3，5-環(huán)己三醇其中之一。本發(fā)明所述單糖為葡萄糖或果糖。本發(fā)明所述滲透性保護(hù)劑為甘油或乙二醇。本發(fā)明所述冷凍稀釋液分為含滲透性保護(hù)劑和不含滲透性保護(hù)劑兩類。本發(fā)明所述的制備方法，其中新鮮蛋黃經(jīng)56°C、30min的滅活處理。本發(fā)明所述制備方法中，優(yōu)選地采用Tris溶液調(diào)整pH值。
本發(fā)明所述家畜精液冷凍稀釋液在應(yīng)用上可分為一步法和兩步法冷凍。一步法冷凍保存方法，其步驟是，將家畜精液和本發(fā)明所述的含有滲透性保護(hù)劑的冷凍稀釋液按照1:4的比例混合均勻，而后分裝于O. 25ml塑料細(xì)管內(nèi)，先緩慢降溫至5°C，而后迅速移入液氮?dú)庀嘀醒?min，最后將細(xì)管投入液氮冷凍保存。兩步法冷凍保存方法，其步驟是，將家畜精液和本發(fā)明所述的不含滲透性保護(hù)劑的冷凍稀釋液按照1:4的比例混合均勻，而后分裝于2ml凍存管內(nèi)，緩慢降溫至5°C，而后將凍存管中的溶液和本發(fā)明所述的含有滲透性保護(hù)劑的冷凍稀釋液按照1:1的比例混合均勻，用移液器吸取O. 2ml滴于干冰預(yù)凍，最后將冷凍顆粒投入液氮冷凍保存。本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述三羥甲基氨基甲烷為緩沖物質(zhì)，檸檬酸為溶質(zhì)，可能也參與糖酵解作用，所述果糖或葡萄糖為精子代謝底物，所述蛋黃為低溫休克質(zhì)膜保護(hù)劑，所述甘油或乙二醇為滲透性保護(hù)劑，所述青霉素和鏈霉素為抗生素，所述肌醇類化合物為冰晶抑制劑。 本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明針對(duì)目前家畜精液冷凍保存研究中存在的主要問題，首次將肌醇類化合物作為冰晶抑制劑代替天然的抗凍蛋白應(yīng)用于家畜精液的冷凍保存研究中。肌醇類化合物能有效降低精液冷凍過程中冰晶的形成量，減少冰晶對(duì)精子的機(jī)械性損傷，最終提高哺乳動(dòng)物冷凍精液的活率、活力、頂體完整性和質(zhì)膜完整性等技術(shù)指標(biāo)。大量實(shí)驗(yàn)表明，通過應(yīng)用本發(fā)明的家畜精液冷凍稀釋液進(jìn)行冷凍保存的家畜精液，解凍后精子的活率在75%左右，活力在50%以上，頂體完整性在60%左右，質(zhì)膜完整性在50%左右，人工授精后不返情率達(dá)到70%以上。本發(fā)明中使用的肌醇類化合物是一類常見的化學(xué)原料，來源方便、成本低廉、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，使用肌醇類化合物作為精液冷凍稀釋液的冰晶抑制齊U，具有不會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)、純度有保證、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本發(fā)明的技術(shù)方案不以實(shí)施例為限。實(shí)施例1 :采用電刺激法采集云南半細(xì)毛羊精液，而后進(jìn)行精液品質(zhì)檢測(cè)。用于冷凍保存的綿羊精液指標(biāo)必須滿足活力大于70%，精子密度高于3 X 109/ml，精液量為O. 75-2ml。配制精液冷凍稀釋液，其步驟為，分別稱取三羥甲基氨基甲烷2. 71g、檸檬酸1. 4g、葡萄糖1. 0g、甘油5ml、青霉素10萬IU、鏈霉素10萬IU、1,3_環(huán)己二醇1. 16g,溶于超純水，攪拌均勻，采用Tris溶液調(diào)整pH值至6. 8-7. 2，使用前加入56°C 30min滅活處理的新鮮蛋黃10ml，混合均勻后定容至100ml，于4°C下15000轉(zhuǎn)/分的速率離心I小時(shí)，取上清液用O. 45 μ mMi 11 ipore濾器過濾備用。將符合冷凍要求的綿羊精液和冷凍稀釋液按照1:4的比例混合均勻，而后分裝于
O.25ml塑料細(xì)管內(nèi)，先緩慢降溫至5°C，而后迅速移入液氮?dú)庀嘀醒?min，最后投入液氮冷凍保存。該方法冷凍保存的家畜精液，解凍后精子的活率在75%左右，活力在50%以上，頂體完整性在60%左右，質(zhì)膜完整性在50%左右，人工授精后不返情率達(dá)到70%以上。實(shí)施例2
昆明易興恒畜牧科技有限責(zé)任公司養(yǎng)殖基地內(nèi)采用假陰道采集云嶺黑山羊精液，而后進(jìn)行精液品質(zhì)檢測(cè)。用于冷凍保存的綿羊精液指標(biāo)必須滿足活力大于70%，精子密度高于3 X IOVml，精液量為O. 75-2ml。配制精液冷凍稀釋液，其步驟為，分別稱取三羥甲基氨基甲烷2. 71g、檸檬酸1. 4g、果糖1. Og、甘油5ml、青霉素10萬IU、鏈霉素10萬IU、1,4_環(huán)己二醇O. 697g,溶于超純水，攪拌均勻，采用Tris溶液調(diào)整pH值至6. 8-7. 2，使用前加入56°C 30min滅活處理的新鮮蛋黃20ml，混合均勻后定容至100ml，于4°C下15000轉(zhuǎn)/分的速率離心I小時(shí)，取上清液用O. 45 μ mMi 11 ipore濾器過濾備用。將符合冷凍要求的綿羊精液和冷凍稀釋液按照1:4的比例混合均勻，而后分裝于 0.25ml塑料細(xì)管內(nèi)，先緩慢降溫至5°C，而后迅速移入液氮?dú)庀嘀醒?min，最后投入液氮冷凍保存。該方法冷凍保存的家畜精液，解凍后精子的活率在75%左右，活力在50%以上，頂體完整性在60%左右，質(zhì)膜完整性在50%左右，人工授精后不返情率達(dá)到70%以上。實(shí)施例3 昆明易興恒畜牧科技有限責(zé)任公司養(yǎng)殖基地內(nèi)采用電刺激法采集無角陶賽特公羊精液，而后馬上進(jìn)行精液品質(zhì)檢測(cè)。用于冷凍保存的綿羊精液指標(biāo)必須滿足活力大于70%，精子密度高于3 X 109/ml，精液量為O. 75-2ml。配制不含滲透性保護(hù)劑的冷凍稀釋液，其制備方法為，分別稱取三羥甲基氨基甲烷2. 71g、檸檬酸1.4g、葡萄糖l.Og、青霉素10萬IU、鏈霉素10萬IU、1，3，5-環(huán)己六醇
1.25g，溶于超純水，攪拌均勻，采用Tris溶液調(diào)整pH值至6. 8-7. 2，使用前加入56°C 30min滅活處理的新鮮蛋黃15ml，混合均勻后定容至100ml，于4°C下15000轉(zhuǎn)/分的速率離心I小時(shí)，取上清液用O. 45 μ mMi 11 ipore濾器過濾備用。配置含滲透性保護(hù)劑的冷凍稀釋液，其步驟為，分別稱取三羥甲基氨基甲烷2.71g、檸檬酸1.4g、果糖l.Og、乙二醇10ml、青霉素10萬IU、鏈霉素10萬IU、1，3_環(huán)己二醇1. 16g，溶于超純水，攪拌均勻，采用Tris溶液調(diào)整pH值至6. 8-7. 2，使用前加入56°C 30min滅活處理的新鮮蛋黃15ml,混合均勻后定容至100ml,于4°C下15000轉(zhuǎn)/分的速率離心I小時(shí)，取上清液用0. 45 μ mMi 11 ipore濾器過濾備用。將符合冷凍要求的精液和不含滲透性保護(hù)劑的冷凍稀釋液按照1:4的比例混合均勻，而后分裝于2ml凍存管內(nèi)，先緩慢降溫至5°C，而后將上述懸浮液和含滲透性保護(hù)劑的冷凍稀釋液按照1:1的比例混合均勻，用移液器吸取0. 2ml滴于干冰預(yù)凍，最后將冷凍顆粒投入液氮冷凍保存。該方法冷凍保存的家畜精液，解凍后精子的活率在70%左右，活力在60%左右，頂體完整性在70%左右，質(zhì)膜完整性在60%左右。上述實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍不構(gòu)成任何限制。以上對(duì)本發(fā)明所提供的精液冷凍稀釋液配方以及冷凍程序進(jìn)行了詳細(xì)介紹。本文通過具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的原理和實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種家畜精液冷凍稀釋液的制備方法，包括以下步驟在適量的超純水中加入三羥甲基氨基甲烷2. 71g、檸檬酸1. 4g、單糖1. Og、青霉素10萬IU，鏈霉素10萬IU，肌醇類化合物0. 29-6. 97g，任選地加入滲透性保護(hù)劑5-20ml，攪拌均勻，調(diào)整pH值至6. 8-7. 2，加入經(jīng)滅活處理的新鮮蛋黃5-20ml，混合均勻后定容至100ml，于4°C下15000轉(zhuǎn)/分的速率離心I小時(shí)，取上清液用0. 45 V- mMiIIipore濾器過濾即制得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中所述肌醇類化合物為1，3_環(huán)己二醇、1，4_環(huán)己二醇和I, 3，5-環(huán)己三醇其中之一。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中所述單糖為葡萄糖或果糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中所述滲透性保護(hù)劑為甘油或乙二醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中新鮮蛋黃經(jīng)56°C、30min的滅活處理。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的制備方法制得的含有滲透性保護(hù)劑的冷凍稀釋液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的制備方法制得的不含滲透性保護(hù)劑的冷凍稀釋液
8.一種家畜精液冷凍保存方法，其步驟是，將家畜精液和權(quán)利要求6所述的含有滲透性保護(hù)劑的冷凍稀釋液按照1:4的比例混合均勻，而后分裝于0. 25ml塑料細(xì)管內(nèi)，先緩慢降溫至5°C，而后迅速移入液氮?dú)庀嘀醒?min，最后將細(xì)管投入液氮冷凍保存。
9.一種家畜精液冷凍保存方法，其步驟是，將家畜精液和權(quán)利要求7所述的不含滲透性保護(hù)劑的冷凍稀釋液按照1:4的比例混合均勻，而后分裝于2ml凍存管內(nèi)，緩慢降溫至5°C，而后將凍存管中的溶液和權(quán)利要求7所述的含有滲透性保護(hù)劑的冷凍稀釋液按照1:1的比例混合均勻，用移液器吸取0. 2ml滴于干冰預(yù)凍，最后將冷凍顆粒投入液氮冷凍保存。
10.權(quán)利要求5或6所述的冷凍稀釋液在家畜精液冷凍保存中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種家畜精液冷凍稀釋液及其制備方法和應(yīng)用，在適量的超純水中加入三羥甲基氨基甲烷2.71g、檸檬酸1.4g、單糖1.0g、青霉素10萬IU,鏈霉素10萬IU，肌醇類化合物0.29-6.97g，任選地加入滲透性保護(hù)劑5-20ml，攪拌均勻，調(diào)整pH值至6.8-7.2，加入經(jīng)滅活處理的新鮮蛋黃5-20ml，混合均勻后定容至100ml，低溫離心1小時(shí)，取上清液過濾即制得。由于肌醇類化合物能有效抑制冰晶的產(chǎn)生，降低了冰晶對(duì)精子的機(jī)械性損傷，解凍后精子的活率在75%左右，活力在50%以上，頂體完整性在60%左右，質(zhì)膜完整性在50%左右，人工授精后不返情率達(dá)到70%以上。使用肌醇類化合物作為精液冷凍稀釋液的冰晶抑制劑，具有不會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)、純度有保證、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01N1/02GK103004750SQ201210491289
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月27日
發(fā)明者洪瓊花, 權(quán)國波, 楊紅遠(yuǎn), 李東江, 呂春榮 申請(qǐng)人:云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院, 昆明易興恒畜牧科技有限責(zé)任公司