專利名稱：德欽野生紫花苜蓿組培繁殖方法
德欽野生紫花苜蓿組培繁殖方法所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種德欽野生紫花苜蓿(Medicagaosativa L.)無菌苗組織培養(yǎng)及快速繁殖的方法。
背景技術(shù)：
德欽野生紫花苜猜(Medicago sativa L.)是一種多年生豆科牧草,分布云南省迪慶藏族自治州德欽縣和金沙江流域的干熱河谷地區(qū)，抗干熱性十分突出。德欽野生紫花苜蓿蛋白質(zhì)含量高，營養(yǎng)品質(zhì)好，適于放牧和調(diào)制青干草，牛、馬、豬和羊等牲畜均喜食，是一種優(yōu)質(zhì)的飼草資源。另外該苜蓿較耐貧瘠，在干熱河谷地區(qū)種植可起到保土綠肥的作用。但由于當(dāng)?shù)氐娜藗冮L期不合理地過度利用，野生紫花苜蓿已經(jīng)到了瀕危的狀況。且野生紫花苜蓿的結(jié)實(shí)率很低，種子不易發(fā)芽，自然繁殖率較低。建立組培快繁體系可以從根本上解決這一問題。 迄今，紫花苜蓿組培快繁法大多都選用無菌種子為外植體，通過擬原球莖途徑培養(yǎng)，此類方法存在德欽野生紫花苜蓿種子產(chǎn)量較低，通過原球莖途徑培養(yǎng)造成的周期長的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明旨在提供一種德欽野生紫花苜蓿的組織快繁方法，各階段采用不同的優(yōu)化培養(yǎng)基配方，使之在野生種源缺乏及繁殖率低的情況下能夠快速繁衍，使該物種的優(yōu)良性狀的保存能夠得到保障，同時避免了通過原球莖途徑造成的周期長的缺點(diǎn)，縮短離體培養(yǎng)時間及生產(chǎn)成本，提高生根率和幼苗移栽率，為德欽野生紫花苜蓿的可持續(xù)利用提供了組培種苗繁育基礎(chǔ)。本發(fā)明采用葉片為外植體產(chǎn)生原球莖組培方法顯得更有實(shí)際應(yīng)用價值。本發(fā)明的上述目的是通過下述的技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的德欽野生紫花苜蓿的組培繁殖方法，包括葉片消毒、愈傷組織誘導(dǎo)、分化、壯苗及生根培養(yǎng)以及試管苗移栽步驟，取野生紫花苜蓿的幼嫩葉片進(jìn)行原球莖誘導(dǎo)、分化、壯苗、生根培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度為23-25°C，濕度為30-45%，光照強(qiáng)度為1000-3000LX，光照時間為16h/d ;所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + 2，4-D 2. O mg/1+ 6-BA I. O mg/1 + 3%蔗糖+ O. 8% 瓊脂，分化培養(yǎng)基為 MS + 6-BA O. 5 mg/1 + NAA O. 5 mg/1 + 3% 蔗糖 + O. 8% 瓊月旨，壯苗培養(yǎng)基為MS+IAA1.0 mg/1 +KTO. 5 mg/1 + 0.8%瓊脂培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基為1/2MSmg/Ι + 3%蔗糖+ O. 8%瓊脂培養(yǎng)基。所述的組培繁殖方法中，葉片消毒先用用自來水沖洗3飛遍，70%酒精浸泡30秒，再用10%H202溶液浸泡15分鐘，無菌蒸餾水清洗5遍。所述的組培繁殖方法中，移栽是生根組培苗在培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)20天以后煉苗5天，再移栽于溫室大棚，移栽基質(zhì)為混有滅過菌的營養(yǎng)土(園土 腐殖土 砂土 =2 2 1)和適量珍珠巖，移栽最初的一個星期用塑料薄膜覆蓋裝有基質(zhì)的營養(yǎng)盤，遮陽保濕，使環(huán)境相對濕度保持在80%，并早晚通氣半小時，成活后去除塑料薄膜，使其自然生長，待其長出健壯的莖葉時移入大田。具體地，本發(fā)明的組培繁殖方法為選德欽野生紫花苜蓿的葉片為外植體，將幼嫩葉片用自來水沖洗3飛遍，70%酒精浸泡30 S，再用10%H202溶液浸泡15 min,無菌蒸餾水清洗5遍,然后每一小葉切成5 mmX5 mm的小塊。將切好的幼嫩葉片接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS + 2,4-D 2.0 mg/1+ 6-BA 1.0 mg/1 + 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂中，培養(yǎng)條件為溫度24°C，光照16h，光照強(qiáng)度1000LX，培養(yǎng)45 d左右。把經(jīng)過篩選具有胚性的質(zhì)地致密或顆粒狀或具有綠色芽點(diǎn)，體積適中的愈傷組織塊進(jìn)行分割，使愈傷組織塊大小均一，盡量將由同一塊愈傷組織塊分割得到的小愈傷組織塊轉(zhuǎn)入同一分化培養(yǎng)基MS + 6-BA 0.5 mg/1+ NAA 0.5 mg/1 + 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂中，進(jìn)行體細(xì)胞胚生長和發(fā)育的培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度24°C，光照強(qiáng)度3000LX，光照16h，培養(yǎng)45 d左右。將在分化培養(yǎng)基生成的叢生芽轉(zhuǎn)到壯苗培養(yǎng)基MS+IAA1.0 mg/1 +ΚΤ0. 5 mg/1 + 0.8%瓊脂進(jìn)行壯苗培養(yǎng)基使其快速生長，形成大的叢生苗并伸長，培養(yǎng)10天左右。將生成的無根小苗(2 3cm高)在節(jié)間下部I mm處切下，移入生根培養(yǎng)基1/2MS+ 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂。培養(yǎng)條件為溫度24°C，光照強(qiáng)度 3000LX,光照16h。IOd左右即可生根，當(dāng)試管苗出現(xiàn)3飛條粗根，長約2 3cm，苗高5cm以上時準(zhǔn)備移栽。先打開封瓶膜，經(jīng):T5d鍛煉，移入混有滅過菌的營養(yǎng)土(園土 腐殖土 砂土=2 2 1)和適量珍珠巖的培養(yǎng)盤內(nèi)，最初的一個星期用塑料薄膜覆蓋，遮陽保濕，使環(huán)境相對濕度保持在80%，并早晚通氣半小時，成活后去除塑料薄膜，使其自然生長，待其長出健壯的莖葉時移入大田。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的組培方法的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明方法在培養(yǎng)不同階段采用了不同配方的培養(yǎng)基，以適應(yīng)植物在不同時期對營養(yǎng)物質(zhì)的需求，通過本發(fā)明的方法培養(yǎng)，野生紫花苜蓿的出愈率為97. 85%，分化率為79. 07%，生根率為98. 42%，移栽成活率為94. 55%，在一月內(nèi)可增殖系數(shù)為10，極大地提高了野生紫花苜蓿的繁殖系數(shù)，阻止了由于野外植株少缺乏種子及種子成活率低，導(dǎo)致該物種瀕臨滅絕的危險，為該物種的保存和可持續(xù)利用提供了非常有效的繁殖方法。本發(fā)明建立了有效的工廠化野生紫花苜蓿組培快繁方法，解決了傳統(tǒng)野生種子繁殖困難，繁殖受阻的狀況。通過本發(fā)明組培快繁得到的幼苗，成苗一致性強(qiáng)，生長健壯，葉色濃綠，病蟲害較少，易于管理。不受季節(jié)限制，任何時候都可以進(jìn)行組培?？梢员３治锓N特性，使該品種能夠延續(xù)和可持續(xù)利用。節(jié)約了生產(chǎn)成本，且生產(chǎn)過程中分化率高，繁殖速度快。本發(fā)明通過不斷的探索實(shí)驗(yàn)，形成了一套專門的野生紫花苜蓿組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)體系，克服了之前專利培養(yǎng)基成分復(fù)雜，培養(yǎng)過程繁瑣，無實(shí)際工廠化繁殖經(jīng)驗(yàn)，為規(guī)?；斯しN植德欽野生紫花苜蓿提供了保障，現(xiàn)階段已使用本發(fā)明工廠化生產(chǎn)德欽野生紫花苜蓿瓶苗3年之久，生產(chǎn)過程中問題少，分化率高，繁殖速度快，繼代代數(shù)多，營養(yǎng)成分與德欽野生紫花苜蓿相當(dāng)，證明了該繁殖技術(shù)是目前為止適合工廠化生產(chǎn)的組培方法。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容。根據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案和實(shí)施例的描述，也許同領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上還可以對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行一些修改和改進(jìn)。因此，在不偏離本發(fā)明主要技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的修改和改進(jìn)，均應(yīng)屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例I :以德欽野生紫花苜猜(Medicagao sativa L.)的葉片為外植體，將幼嫩葉片用自來水沖洗3遍，70%酒精浸泡30 S，再用10%H202溶液浸泡15min，無菌蒸餾水清洗5次，然后每一小葉切成5 mmX5 mm的小塊。將切好的幼嫩葉片接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS +
2.4-D2.0 mg/1+ 6-BA 1.0 mg/1 + 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂中，培養(yǎng)條件為溫度24°C，光照16h，光照強(qiáng)度1000 LX，培養(yǎng)45天。把經(jīng)過篩選具有胚性的質(zhì)地致密或顆粒狀或具有綠色芽點(diǎn)，體積適中的愈傷組織塊進(jìn)行分割，使愈傷組織塊大小均一，盡量將由同一塊愈傷組織塊分割得到的小愈傷組織塊轉(zhuǎn)入同一分化培養(yǎng)基MS + 6-BA 0.5 mg/1 + NAA 0.5 mg/I + 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂中，進(jìn)行體細(xì)胞胚生長和發(fā)育的培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫 度24°C，光照強(qiáng)度3000LX，光照16h。45天左右，將在分化培養(yǎng)基生成的叢生芽轉(zhuǎn)到MS+IAA1. O mg/1+ΚΤ0. 5 mg/1 + 0.8%瓊脂壯苗培養(yǎng)基使其快速生長，形成大的叢生苗并伸長。將生成的無根小苗(2cm高)在節(jié)間下部Imm處切下，移入生根培養(yǎng)基1/2MS+ 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂，培養(yǎng)條件為溫度24°C，光照16h，光照強(qiáng)度3000LX。10天左右即可生根，當(dāng)試管苗出現(xiàn)3條粗根，長2cm，苗高5cm以上時準(zhǔn)備移栽。先打開封瓶膜，經(jīng)3天鍛煉，移入混有滅過菌的營養(yǎng)土(園土 腐殖土 砂土 =2:2:1)和適量珍珠巖的培養(yǎng)盤內(nèi)，最初的一個星期用塑料薄膜覆蓋，遮陽保濕，使環(huán)境相對濕度保持在80%，并早晚通氣半小時，成活后去除塑料薄膜，使其自然生長，待其長出健壯的莖葉時移入大田。實(shí)施例2:以德欽野生紫花苜猜(Medicagao sativa L.)的葉片為外植體，將幼嫩葉片用自來水沖洗5遍，70%酒精浸泡30 S，再用10%H202溶液浸泡15min，無菌蒸餾水清洗5次，然后每一小葉切成5 mmX5 mm的小塊。將切好的幼嫩葉片接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS +
2.4-D2.0 mg/1+ 6-BA 1.0 mg/1 + 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂中，培養(yǎng)條件為溫度24°C，光照16h，光照強(qiáng)度1000 LX，培養(yǎng)45天左右。把經(jīng)過篩選具有胚性的質(zhì)地致密或顆粒狀或具有綠色芽點(diǎn)，體積適中的愈傷組織塊進(jìn)行分割，使愈傷組織塊大小均一，盡量將由同一塊愈傷組織塊分割得到的小愈傷組織塊轉(zhuǎn)入同一分化培養(yǎng)基MS + 6-BA 0.5 mg/1 + NAA 0.5 mg/I + 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂中，進(jìn)行體細(xì)胞胚生長和發(fā)育的培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度24°C，光照強(qiáng)度3000LX，光照16h。45天左右，將在分化培養(yǎng)基生成的叢生芽轉(zhuǎn)到MS+IAA1. O mg/1+ΚΤ0. 5 mg/1 + 0.8%瓊脂壯苗培養(yǎng)基使其快速生長，形成大的叢生苗并伸長。將生成的無根小苗(3cm高)在節(jié)間下部Imm處切下，移入生根培養(yǎng)基1/2MS+ 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂，培養(yǎng)條件為溫度24°C，光照16h，光照強(qiáng)度3000LX。10天左右即可生根，當(dāng)試管苗出現(xiàn):Γ5條粗根，長2 3cm，苗高5cm以上時準(zhǔn)備移栽。先打開封瓶膜，經(jīng)5天鍛煉，移入混有滅過菌的營養(yǎng)土(園土 腐殖土 砂土 =2:2:1)和適量珍珠巖的培養(yǎng)盤內(nèi)，最初的一個星期用塑料薄膜覆蓋，遮陽保濕，使環(huán)境相對濕度保持在80%，并早晚通氣半小時，成活后去除塑料薄膜，使其自然生長，待其長出健壯的莖葉時移入大田。通過本發(fā)明上述方法的培養(yǎng)，野生紫花苜蓿的出愈率為97.85%，分化率為79. 07%，生根率為98. 42%，移栽成活率為94. 55%，在一月內(nèi)可增殖系數(shù)為10，極大地提高了野生紫花苜蓿的繁殖系數(shù)，阻止了由于野外植株少缺乏種子及種子成活率低，導(dǎo)致該物種瀕臨滅絕的危險，為該物種的保存和可持續(xù)利用提供了非常有效的繁殖方法。解決了傳統(tǒng)野生 種子繁殖困難，繁殖受阻的狀況。通過本發(fā)明組培快繁得到的幼苗，成苗一致性強(qiáng)，生長健壯，葉色濃綠，病蟲害較少，易于管理。不受季節(jié)限制，任何時候都可以進(jìn)行組培。可以保持物種特性，使該品種能夠延續(xù)和可持續(xù)利用。節(jié)約了生產(chǎn)成本，且生產(chǎn)過程中分化率高，繁殖速度快。
權(quán)利要求
1.德欽野生紫花苜蓿的組培繁殖方法，取野生紫花苜蓿的幼嫩葉片消毒后，順序在愈傷組織誘導(dǎo)、分化、壯苗、生根培養(yǎng)基中進(jìn)行原球莖愈傷組織誘導(dǎo)、分化、壯苗、生根培養(yǎng)，然后進(jìn)行試管苗移栽，所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + 2,4-D 2.0 mg/1+ 6-BA 1.0 mg/I + 3% 蔗糖 + O. 8% 瓊脂，分化培養(yǎng)基為 MS + 6-BA O. 5 mg/1 + NAA O. 5 mg/1 + 3% 蔗糖+ 0.8%瓊脂，壯苗培養(yǎng)基為MS+IAA1.0 mg/1 +ΚΤ0. 5 mg/1 + 0.8%瓊脂培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基為1/2MS mg/Ι + 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂培養(yǎng)基；誘導(dǎo)、分化、壯苗、生根培養(yǎng)的溫度為23-25°C，濕度為30-45%，光照強(qiáng)度為1000-3000LX，光照時間為16h/d。
2.如權(quán)利要求I所述的德欽野生紫花苜蓿的組培繁殖方法，其特征在于所述的葉片消毒先用自來水沖洗3飛遍，70%酒精浸泡30秒，再用10%H202溶液浸泡15分鐘，無菌蒸餾水清洗5遍。
3.如權(quán)利要求I所述的德欽野生紫花苜蓿的組培繁殖方法，其特征在于所述的試管苗移栽是生根組培苗在培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)20天后，煉苗5天再移栽于溫室大棚，移栽基質(zhì)為混有滅過菌的營養(yǎng)土即園土 腐殖土 砂土 =2:2:1和適量珍珠巖，移栽7天內(nèi)用塑料薄膜覆蓋裝有基質(zhì)的營養(yǎng)盤，遮陽保濕，使環(huán)境相對濕度保持在80%，早晚通氣半小時，成活后去除塑料薄膜，待組培苗長出健壯的莖葉時移入大田。
4.如權(quán)利要求I所述的德欽野生紫花苜蓿的組培繁殖方法，其特征在于選德欽野生紫花苜蓿的葉片為外植體，將幼嫩葉片用自來水沖洗3飛遍，70%酒精浸泡30 S，再用10%H202溶液浸泡15 min，無菌蒸餾水清洗5遍，然后每一小葉切成5 mm X 5 mm的小塊，將切好的幼嫩葉片接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS + 2，4-D 2. O mg/1+ 6-BA I. O mg/1 + 3%蔗糖+.O.8%瓊脂中，培養(yǎng)條件為溫度24°C，光照16h，光照強(qiáng)度1000LX，培養(yǎng)45 d，把經(jīng)過篩選具有胚性的質(zhì)地致密或顆粒狀或具有綠色芽點(diǎn)，體積適中的愈傷組織塊進(jìn)行分割，使愈傷組織塊大小均一，將由同一塊愈傷組織塊分割得到的小愈傷組織塊轉(zhuǎn)入同一分化培養(yǎng)基MS +6-BA 0.5 mg/1 + NAA 0.5 mg/1 + 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂中，進(jìn)行體細(xì)胞胚生長和發(fā)育的培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度24°C，光照強(qiáng)度3000LX，光照16h，培養(yǎng)45 d ;將在分化培養(yǎng)基生成的叢生芽轉(zhuǎn)到壯苗培養(yǎng)基MS+IM1. O mg/1 +ΚΤ0. 5 mg/1 + O. 8%瓊脂進(jìn)行壯苗培養(yǎng)基使其快速生長，形成大的叢生苗并伸長，培養(yǎng)10天，將生成2 3cm高的無根小苗在節(jié)間下部Imm處切下，移入生根培養(yǎng)基1/2MS+ 3%蔗糖+ 0.8%瓊脂，培養(yǎng)條件為溫度24°C，光照強(qiáng)度3000LX,光照16h，IOd后生根，當(dāng)試管苗出現(xiàn)3飛條粗根，長2 3cm，苗高5cm以上時移栽，先打開封瓶膜，經(jīng):T5d鍛煉，移入混有滅過菌的營養(yǎng)土即園土 腐殖土 砂土 =2:2:1和適量珍珠巖的培養(yǎng)盤內(nèi)，最初7天用塑料薄膜覆蓋，遮陽保濕，使環(huán)境相對濕度保持在80%，并早晚通氣半小時，成活后去除塑料薄膜，使其自然生長，待其長出健壯的莖葉時移入大田。
全文摘要
德欽野生紫花苜蓿(Medicagao sativa L.)無菌苗組織培養(yǎng)及快速繁殖的方法，取野生紫花苜蓿的幼嫩葉片進(jìn)行原球莖誘導(dǎo)、分化、壯苗、生根培養(yǎng)。通過本發(fā)明方法，繁育的野生紫花苜蓿在一月內(nèi)可增殖系數(shù)為10，平均生根率為98%，平均移栽成活率為95%，極大地提高了野生紫花苜蓿的繁殖系數(shù)，阻止了由于野外植株少缺乏種子及種子成活率低，導(dǎo)致該物種瀕臨滅絕的危險，為該物種的保存和可持續(xù)利用提供了非常有效的繁殖方法。
文檔編號A01H4/00GK102907326SQ20121044008
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月7日
發(fā)明者畢玉芬, 姜華, 何承剛, 馬向麗, 趙雁, 申亞楠 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)