專利名稱：以藻泥作為添加劑生產(chǎn)促生生物有機肥的工藝及產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種以藻泥作為添加劑生產(chǎn)促生生物有機肥的工藝及產(chǎn)品，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)，該生物有機肥富含大量促進作物生長功能菌，同時含有游離氨基酸，能夠顯著促進農(nóng)作物生長。
背景技術(shù)：
近年來，國內(nèi)外各大湖泊相繼出現(xiàn)藍藻水華暴發(fā)的現(xiàn)象，湖泊富營養(yǎng)化問題日益得到人們的關(guān)注。每年夏、秋季，我國巢湖、滇池、太湖、東湖等各大湖泊由于水體富營養(yǎng)化嚴重，頻頻暴發(fā)水華，給城市居民用水帶來嚴重危機。清除藍藻的方法很多，直接清除水體中藍藻，并移出水體，即打撈藍藻法，這是目前非常有效的和學術(shù)界沒有爭議的一種方法。由于撈藻含水量較大，達到98%，占地較多，藍藻作為一種生物質(zhì)資源，探索其資源化利用較有意義。通過對藍藻資源利用的可行性研究，試圖尋找出一種有效的藍藻利用途徑，從 而為從太湖打撈出來的大量藍藻尋找出一種有效的處理途徑，這將可能實現(xiàn)太湖藍藻的利用，減少撈藻的二次污染，使其變廢為寶，化害為利。打撈藻泥的含水量在86-89%之間，藻泥干物質(zhì)全N含量為7. 5-8. 5 %，全P含量為O. 44 %，全K含量為O. 5 % ;有機質(zhì)含量大于70%。(I、沈銀武，劉永定，吳國樵，等.富營養(yǎng)化湖泊滇池水華藍藻的機械清除[J].水生生物學報，2004，25 (2) :131-136. 2、藍藻快速好氧堆肥的研究江南大學碩士論文2009第2頁)。但原料藍藻里面含毒素、蛋白等大分子物質(zhì)，不經(jīng)過處理會二次污染環(huán)境(氮、磷、藻毒素)，而且養(yǎng)分不能直接被植物所利用(杜靜，《太湖水華藍藻資源化技術(shù)研究》D，南京農(nóng)業(yè)大學，2008，碩士學位論文；韓志國，武寶王，鄭解生，等.淡水水體中的藍藻毒素研究進展(綜述KJ].暨南大學學報自然科學版，2001，22 (3) :129-134 ;楊海麟，李克朗，張玲，等.藍藻資源無害化利用技術(shù)的研究[J].生物技術(shù)，2008，18 ￠) :95-98)。本專利從打撈藻泥富含的豐富植物蛋白、多糖出發(fā)，利用該類資源與普通腐熟牛糞堆肥二次固體發(fā)酵根際促生芽孢桿菌，研發(fā)出了作物促生生物有機肥。生物有機肥是指特定功能微生物與主要以動植物殘體(如畜禽糞便、農(nóng)作物秸桿等)為來源并經(jīng)無害化處理、腐熟的有機物料復合而成的一類兼具微生物肥料和有機肥效應(yīng)的肥料。其本質(zhì)特征是含有特定功能的、表現(xiàn)出一定肥料效應(yīng)的微生物，這些功能微生物的生命活動是生物有機肥優(yōu)于其它肥料的關(guān)鍵因素。生物有機肥發(fā)揮作用的關(guān)鍵在于肥料中有益微生物的數(shù)量，因此研究不同的配方和二次固體發(fā)酵工藝確保肥料中活菌數(shù)達到最高變得尤為重要。目前提高生物有機肥中功能微生物數(shù)量，常用的方法是在二次固體發(fā)酵過程中加入大量的外源氨基酸。該類氨基酸的種類很多，如菜餅、豆餅等，但此類氨基酸成本很高，尤其是豆餅，因此目前市場上的生物有機肥產(chǎn)品主要集中在蔬菜、果樹等附加值較高的經(jīng)濟作物上，糧食作物上鮮有該類高端肥料的應(yīng)用。探求和開發(fā)出新型低成本氨基酸，大幅度降低生物有機肥的成本，從而將生物有機肥應(yīng)用于糧食作物上去，進一步提高我國糧食作物的產(chǎn)量，變得意義尤為重大。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明目的在于針對生物有機肥生產(chǎn)成本昂貴的問題，開發(fā)出一種利用藻泥為生物有機肥配方中的添加劑，研制低成本生物有機肥的配方和工藝。技術(shù)方案下面為本發(fā)明的主要內(nèi)容所用菌株為根際促生芽孢桿菌SQR9，分離自黃瓜根際土壤，該菌株革蘭氏染色為陽性，保藏于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCNO. 5808，根據(jù)形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA序列分析鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。SQR9菌株在培養(yǎng)溫度為30°C,初始pH為7. O 8. O,碳源為葡萄糖或蔗糖，氮源為蛋白胨或酵母膏時可達到最大的生長量。幼齡培養(yǎng)物形態(tài)均為桿狀、具有運動性，產(chǎn)芽孢、芽孢形狀呈橢圓形，孢囊膨大，菌落不規(guī)則、干燥、不透明。以藻泥作為添加劑生產(chǎn)促生生物有機肥的工藝，包括 I)將保藏號CGMCC NO. 5808的根際促生解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) SQR9接種到PDA培養(yǎng)液中，進行液體發(fā)酵生產(chǎn),發(fā)酵生產(chǎn)的條件為pH生長范圍自然，培養(yǎng)溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵中后期形成芽孢，使發(fā)酵液中含菌或芽孢量> IXlO9個/ml。所用PDA培養(yǎng)液配制方法為，以配制IL培養(yǎng)基為例用200g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，經(jīng)過濾后濾液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值調(diào)至7. 0-7. 6，121°C滅菌20min。2)將腐熟后的牛糞堆肥和藻泥按干重比9. 5 0.5進行均勻混合；3)將促生菌接種入藻泥和腐熟后的牛糞堆肥混合物進行固體發(fā)酵，每噸固體有機物料中加入促生菌液50L，固體發(fā)酵過程中每天翻堆I次，使固體發(fā)酵溫度不超過50°C，發(fā)酵6-7天后結(jié)束，促生菌含量可達到2X 107CFU/g(肥料干重)以上，最后在溫度不超過60°C的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發(fā)至30%以下，包裝出廠即為成品促生生物有機肥。所用腐熟后的牛糞堆肥其發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機質(zhì)質(zhì)量比含量> 45%，有機氮質(zhì)量比含量為2-3%，含水量質(zhì)量比為25-30%。用上述配方工藝生產(chǎn)的促生生物有機肥中有益活菌數(shù)超過2X107CFU/g(肥料干重)，全氮含量為1.2-2%，總氮磷鉀養(yǎng)分> 5 %、有機質(zhì)含量> 45 %。該產(chǎn)品中微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg。有益效果本發(fā)明提供一種利用藻泥作為添加劑和腐熟牛糞發(fā)酵根際促生芽孢桿菌研制低成本促生生物有機肥的配方及工藝。使用該發(fā)明生產(chǎn)的促生生物有機肥具有生產(chǎn)成本低，使用方便，促生效果好的優(yōu)點，適合糧食作物、蔬菜、果樹等種植區(qū)域大面積使用。本發(fā)明對于保護生態(tài)環(huán)境，保護人民的身體健康，提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值具有重要的意義。產(chǎn)品與目前市場上的產(chǎn)品相比具有如下優(yōu)點I)本專利太湖打撈藻泥和腐熟牛糞普通肥作為配方，二次固體發(fā)酵根際促生Bacillus amyloliquefaciens SQR9,研制出了低成本促生生物有機肥,該配方及工藝能夠大幅度降低生物有機肥的成本，生產(chǎn)的產(chǎn)品不僅能夠應(yīng)用于高附加經(jīng)濟作物，同時能夠應(yīng)用與糧食作物，同時通過微生物的作用，藍藻里的大分子藻蛋白能夠被分解成小分子的氨基酸，可供植物直接利用，藻毒素能夠被大幅度降低，具有很強的市場競爭力。2)藻泥中蛋白含量可高達50%以上，氨基酸組份比較齊全，肥料產(chǎn)品中含有豐富的可溶性有機碳氮和種類齊全的游離氨基酸，能給功能菌提供十分優(yōu)越的生長環(huán)境，肥料中高效菌株的含量大于2X 107CFU/g (肥料干重)以上，施入土壤后能形成優(yōu)勢群，并在土壤中存活下來，大地提高了促生菌在土壤中的定殖和發(fā)揮功能的能力。3)采用液相色譜法測定生物有機肥中藻毒素LR和RR的含量，結(jié)果表明微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4 ug/kg (肥料干重)，而我們測得原料純藻泥中微囊藻毒素LR和RR(microcystin_LR 和 microcystin-RR)的含量分別為 3. lmg/kg (藻泥鮮重)和 62. 16mg/kg (藻泥鮮重)，因此放置兩月的藻泥再利用本專利技術(shù)固體發(fā)酵后能夠?qū)⒃宥舅豅R和RR的含量降低到4ug/kg (肥料干重)以下，目前國內(nèi)外還沒有肥料中藻毒素的標準，僅僅有地下水中的標準，低于lug/kg。4)同時肥料中豐富的氨基酸資源能夠促進作物生長，試驗結(jié)果表明，在糧食作物和蔬菜苗期上上施用本產(chǎn)品后，能顯著促進作物的生長。
四

圖I不同含量藻泥固體發(fā)酵促生菌的數(shù)量圖25%藻泥固體發(fā)酵促生菌的數(shù)量圖3低成本生物有機肥游離氨基酸的含量圖4黃瓜促生5爺子促生圖生物保藏根際促生芽孢桿菌SQR9，2012年2月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC NO. 5808。分類命名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
五具體實施例方式I、藻泥的提供由太湖周邊打撈站免費提供，放置藻泥儲存池2個月。2、功能菌菌劑的生產(chǎn)將促生菌SQR9接種到PDA培養(yǎng)液中，進行液體發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)的條件為pH生長范圍自然，培養(yǎng)溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵中后期形成芽孢，使發(fā)酵液中含菌或芽孢量> I X IO9個/ml。所用PDA培養(yǎng)液配制方法為，以配制IL培養(yǎng)基為例用200g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，經(jīng)過濾后濾液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml, pH值調(diào)至7. 0-7. 6，121°C滅菌20min。3、固體發(fā)酵生成生物有機肥3. I固體發(fā)酵配方的獲得首先將藻泥以不同梯度加入腐熟牛糞堆肥中，進行固體發(fā)酵，每噸固體有機物料中加入促生菌液50L，固體發(fā)酵過程中每天翻堆I次，使固體發(fā)酵溫度不超過50°C，發(fā)酵6天后結(jié)束。發(fā)酵完后測定各處理中的功能菌的數(shù)量，結(jié)果如圖，表明加入5% (干重)藻泥的堆肥為藻泥梯度中的最佳處理，功能菌數(shù)量達到5X 107CFU/g (干重)。再進行殘留藻毒素的檢測，方法如下向IOOg肥料中加入100mL5%的乙酸，在-70和常溫下反復凍融多次后，12000r/min離心lOmin，分別取出上清液(I)和沉淀；將沉淀用100mL80%甲醇溶液震蕩提取4h，離心15min，得上清液(II);將上清液(I)與上清液(II)充分混合后得上清液
(III)，將上清液(III)用稀鹽酸將PH調(diào)至3，靜置過夜后離心，棄殘渣，得上清液(IV)，將上清液(IV)用稀氨水將pH調(diào)至7后，40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除甲醇，將剩余樣品過O. 45μπι濾膜得藻毒素粗提液。依次用20mL100%甲醇、20mL超純水活化C18固相萃取柱(500mg/6ml),將藻毒素粗提液通過固相萃取柱進行富集濃縮，再分別用20mL10%以及20ml20%甲醇溶液淋洗固定相，最后用10mL80%甲醇溶液(加入O. 05%三氟乙酸)將吸附在固定相上的微囊藻毒素洗脫下來，將純化后的微囊藻毒素通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇得MCs儲備液，將儲備液冷凍干燥后，用20%甲醇定容到2ml，液體供HPLC上機檢測。采用液相色譜法測定生物有機肥中藻毒素LR和RR的含量，結(jié)果表明微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg (肥料干重)，而我們測得原料純藻泥中微囊藻毒素LR和RR(microcystin-LR 和 microcystin-RR)的含量分別為 3. lmg/kg (藻泥鮮重)和 62. 16mg/kg (藻泥鮮重)，因此放置兩月的藻泥再利用本專利技術(shù)固體發(fā)酵后能夠?qū)⒃宥舅豅R和RR的含量降低到4ug/kg以下，目前國內(nèi)外還沒有肥料中藻毒素的標準，僅僅有地下水中的標 準，低于lug/kg。3. 2固體大堆發(fā)酵生成成品有機肥根據(jù)上述配方和工藝，將腐熟后的牛糞堆肥和藻泥(干重比，9. 5 0.5)進行均勻混合，將促生菌SQR9接入混合堆，每噸固體有機物料中加入促生菌液50L進行固體發(fā)酵，每天翻堆I次，使固體發(fā)酵溫度不超過50°C，發(fā)酵6天后結(jié)束；設(shè)計牛糞腐熟有機肥作為對照。發(fā)酵結(jié)束后新型生物有機肥中促生菌數(shù)量達到6X 107CFU/g (干重)(圖2)，超過牛糞腐熟有機肥I個數(shù)量級。所用腐熟后的牛糞堆肥其發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機質(zhì)質(zhì)量比含量彡45%，有含水量質(zhì)量比25-30%。研制成的低成本促生生物有機肥含有6 X IO7CFU/g (干重)以上的促生菌SQR-9、全氮含量為I. 2-2.0% (90%以上為有機氮)，總氮磷鉀養(yǎng)分彡5%、有機質(zhì)含量大于45%。以上結(jié)果表明所研制配方和工藝完全能夠最大化的發(fā)酵生產(chǎn)新型生物有機肥，且該生物有機肥完全能夠符合國家標準。3. 3生物有機肥中的氨基酸含量和成分利用茚三酮比色法測定所研制的低成本生物有機肥中游離氨基酸的含量，結(jié)果見圖3，發(fā)酵完成后，添加藻泥發(fā)酵而成的低成本生物有機肥(BIO)中游離氨基酸的含量(I. 69g/kg)遠遠超過對照牛糞(OF)的含量(O. 32g/kg)。4、溫室促生試驗4. I促生有機肥在黃瓜上的應(yīng)用效果共設(shè)一個對照一個處理，處理添加本專利研制的低成本生物有機肥(BIO)，對照為普通牛糞有機肥(OF)。每個處理12盆，每盆裝IOkg 土，肥料的添加量為2%。肥料與土充分混合均勻，常規(guī)管理。定期測定黃瓜生長指數(shù)。結(jié)果如圖5(B0F1 :0F處理；B0F7 :ΒΙ0處理)、表一、表二、表三、和表四，促生有機肥的施用能夠顯著增加黃瓜植株的株高、地上部鮮重、地上部鮮重和干重、地下部鮮重和地下部干重。株高在移苗30天后達到顯著性差異，莖粗一直未見顯著性差異，葉地上部鮮重和干重、地下部鮮重和地下部干重30天后即達到顯著性差異。表一不同有機肥對黃瓜株高的影響單位cm
權(quán)利要求
1.以藻泥作為添加劑生產(chǎn)促生生物有機肥的工藝，包括 1)將保藏號CGMCCNO. 5808的根際促生解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) SQR9接種到PDA培養(yǎng)液中，進行液體發(fā)酵生產(chǎn),發(fā)酵生產(chǎn)的條件為pH生長范圍自然，培養(yǎng)溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵中后期形成芽孢，使發(fā)酵液中含菌或芽孢量> I X IO9個/ml ;所用PDA培養(yǎng)液配制方法為，以配制IL培養(yǎng)基為例用200g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，經(jīng)過濾后濾液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值調(diào)至7· 0-7·6，12 滅菌20min ； 2)將腐熟后的牛糞堆肥和藻泥按干重比9.5 O. 5進行均勻混合； 3)將促生菌接種入藻泥和腐熟后的牛糞堆肥混合物進行固體發(fā)酵，每噸固體有機物料中加入促生菌液50L，固體發(fā)酵過程中每天翻堆I次，使固體發(fā)酵溫度不超過50°C，發(fā)酵6-7天后結(jié)束，促生菌含量可達到2X107CFU/g肥料干重以上，最后在溫度不超過60°C的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發(fā)至30%以下，包裝出廠即為成品促生有機肥；所用腐熟后的牛糞堆肥其發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機質(zhì)質(zhì)量比含量> 45%，有機氮質(zhì)量比含量為2-3%，含水量質(zhì)量比為25-30%。
2.權(quán)利要求I所述工藝生產(chǎn)的促生有機肥產(chǎn)品，該產(chǎn)品中微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促生生物有機肥產(chǎn)品，該產(chǎn)品中促生菌SQR9活菌數(shù)>2X107CFU/g肥料干重，全氮含量為I. 2-2%，總氮磷鉀養(yǎng)分彡5%、有機質(zhì)含量彡45%。
4.權(quán)利要求2和3所述促生生物有機肥產(chǎn)品的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以藻泥作為添加劑生產(chǎn)的低成本促生生物有機肥及其生產(chǎn)工藝，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)。所用配方為腐熟牛糞普通肥(95％，重量比，下同)和藻泥(5％干重)；所用菌株為促生解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensSQR-9；工藝流程為將原料以上述最優(yōu)配方混合，5％接入促生菌，條垛式發(fā)酵，每天翻拋1次，發(fā)酵6-7天。所生產(chǎn)的肥料有益活菌數(shù)大于2×107CFU/g(肥料干重)，全氮含量為1.2-2.0％，總氮磷鉀養(yǎng)分≥5％，有機質(zhì)含量超過45％，微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg。富含有益氨基酸，生產(chǎn)成本低、促生效果好、可應(yīng)用于糧食作物、蔬菜等。
文檔編號C05F17/00GK102898197SQ201210436388
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月1日
發(fā)明者沈其榮, 李 榮, 張苗, 曹亮亮, 施娟娟, 黃炎, 劉紅軍, 楊興明 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學, 江蘇新天地生物肥料工程中心有限公司