專利名稱：玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)及操作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及玻璃化冷凍技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)及操作方法。
背景技術(shù)：
胚胎或細(xì)胞的冷凍保存是人類輔助生殖技術(shù)中的重要環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)的冷凍方法耗時(shí)長，設(shè)備價(jià)格昂貴，且冷凍過程可能會形成冰晶，對細(xì)胞造成損傷，人們在不斷摸索和研究中發(fā)明了玻璃化冷凍技術(shù)。玻璃化冷凍技術(shù)是一種快速冷凍細(xì)胞或組織的方法，可避免凍融過程中細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，最大限度的降低細(xì)胞損傷，方法簡易，設(shè)備簡單，在人類細(xì)胞、胚胎的冷凍保存中取得了不少進(jìn)展。近年來，許多學(xué)者和專家致力于研究玻璃化冷凍技術(shù)在成熟卵母細(xì)胞、未成熟卵母細(xì)胞、精子及胚胎的各個(gè)發(fā)育時(shí)期冷凍保存中的應(yīng)用，并陸續(xù)有健康嬰兒出生的 報(bào)道。自1985年Rail和Fahy發(fā)明了玻璃化冷凍法以來，該方法獲得極大推廣，衍生了多種具有不同承載工具的玻璃化冷凍方法。根據(jù)冷凍過程中的胚胎冷凍主體承載工具的不同，具體可以分為細(xì)管法(一步法、二步法)、微滴法、電子顯微鏡銅網(wǎng)法、開放式拉長塑料細(xì)管法、玻璃微細(xì)管法、半細(xì)管法、封閉式拉長塑料細(xì)管法、固體表面玻璃化法、冷凍環(huán)法、開放式細(xì)管載體cryotop和密閉式細(xì)管載體cryotip等。迄今為止，細(xì)胞的冷凍過程基本上都是手工完成。人在手工作業(yè)時(shí)，可能發(fā)生精神緊張、手部顫抖、視線錯(cuò)覺、疲勞等問題，會出現(xiàn)丟胚胎或細(xì)胞等操作錯(cuò)誤，從而無法保證操作的穩(wěn)定性、及時(shí)性、安全性等。因此，針對上述技術(shù)問題，有必要提供一種玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)及操作方法。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)及操作方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案如下一種玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括計(jì)算機(jī)、XY電機(jī)驅(qū)動工作臺、位于XY電機(jī)驅(qū)動工作臺下的CCD攝像頭、位于XY電機(jī)驅(qū)動工作臺上的玻璃化冷凍器件、位于玻璃化冷凍器件上的倒置顯微鏡、位于玻璃化冷凍器件旁側(cè)的三自由度自動化操作手、以及設(shè)于三自由度自動化操作手上的毛細(xì)管夾持器和玻璃毛細(xì)管，所述系統(tǒng)還包括與計(jì)算機(jī)相連的用于控制毛細(xì)管夾持器和玻璃毛細(xì)管的液壓泵、與計(jì)算機(jī)相連的用于驅(qū)動三自由度自動化操作手的操作手驅(qū)動器以及與計(jì)算機(jī)相連的用于驅(qū)動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，玻璃化冷凍器件包括若干陣列設(shè)置的液池。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，液池設(shè)為6個(gè),分別為液池①、液池②、液池③、液池④、液池⑤和液池⑥。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，液池為方形，且所述液池的四個(gè)側(cè)壁與底面的夾角為鈍角。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，每個(gè)液池的容積為75 μ L，深度為2_。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，液池中設(shè)有平衡液，所述平衡液包括ES溶液或VS溶液。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，液池中平衡液的體積設(shè)為20 μ L0相應(yīng)地，一種玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)的操作方法，所述方法包括SI、確定并添加玻璃化冷凍器件上對應(yīng)序號的液池所應(yīng)添加的平衡液； S2、將玻璃化冷凍器件固定在倒置顯微鏡下的XY電機(jī)驅(qū)動工作臺上，在倒置顯微鏡系統(tǒng)坐標(biāo)的基礎(chǔ)上，將玻璃化冷凍器件及液池的三維坐標(biāo)信息輸入計(jì)算機(jī)；S3、通過CXD攝像頭獲取倒置顯微鏡物鏡視野，并通過圖像處理軟件將物鏡下的內(nèi)容顯示在計(jì)算機(jī)上；S4、從保溫箱中取出裝有胚胎的培養(yǎng)皿，放在倒置顯微鏡下；S5、通過計(jì)算機(jī)發(fā)出指令，驅(qū)動三自由度自動化操作手運(yùn)動，從而帶動玻璃毛細(xì)管在XYZ三方向移動，在倒置顯微鏡下觀察玻璃毛細(xì)管尖端處的位置，確定毛細(xì)管尖端相對玻璃化冷凍器件的空間坐標(biāo)信息，并輸入計(jì)算機(jī)；S6、將培養(yǎng)皿放置在玻璃化冷凍器件旁，使用移液管將胚胎從培養(yǎng)皿中移到液池中；S7、控制三自由度自動化操作手，使得玻璃毛細(xì)管抓取、移動和釋放胚胎，使得胚胎在每個(gè)液池中完成相應(yīng)的冷凍步驟；S8、將胚胎裝載到密閉式細(xì)管載體中進(jìn)行熱封，并放入液氮中保存。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，液池設(shè)為6個(gè)，分別為液池①、液池②、液池③、液池④、液池⑤和液池⑥，所述液池②設(shè)有ES溶液，液池③、液池④、液池⑤和液池⑥中設(shè)有VS溶液。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟S7具體為通過計(jì)算機(jī)給三自由度自動化操作手輸入適當(dāng)步進(jìn)量，移動玻璃毛細(xì)管至液池①上方，驅(qū)動三自由度自動化操作手在Z方向運(yùn)動，通過液壓泵將胚胎吸入玻璃毛細(xì)管端部；驅(qū)動三自由度自動化操作手移動玻璃毛細(xì)管，同時(shí)移動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺，使玻璃毛細(xì)管處于液池②上部，玻璃毛細(xì)管下降，將胚胎吐到液池②中ES溶液頂部，使胚胎在液池②中自由下降，進(jìn)行平衡；在玻璃毛細(xì)管中吸入適量ES溶液，再將胚胎吸入玻璃毛細(xì)管尖端，尖端上升，移動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺，使玻璃毛細(xì)管處于液池③上部，玻璃毛細(xì)管下降，將胚胎吐到液池③中VS溶液頂部，使胚胎在液池③中自由下降，進(jìn)行平衡；將胚胎吸入玻璃毛細(xì)管尖端，尖端上升，移動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺，使玻璃毛細(xì)管處于液池④上部，玻璃毛細(xì)管下降，將胚胎吐到液池④中VS溶液頂部，使胚胎在液池④中自由下降，進(jìn)行平衡；將胚胎吸入玻璃毛細(xì)管尖端，尖端上升，移動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺，使玻璃毛細(xì)管處于液池⑤上部，玻璃毛細(xì)管下降，將胚胎吐到液池⑤中VS溶液頂部，使胚胎在液池⑤中自由下降，進(jìn)行平衡；將胚胎吸入玻璃毛細(xì)管尖端，尖端上升，移動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺，使玻璃毛細(xì)管處于液池⑥上部，玻璃毛細(xì)管下降，將胚胎吐到液池⑥中VS溶液頂部，使胚胎在液池⑥中自由下降，進(jìn)行平衡。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，胚胎在液池②ES溶液中平衡的時(shí)間設(shè)為5_15min，胚胎在液池③和液池④VS溶液中平衡的時(shí)間設(shè)為5s，胚胎在液池⑤VS溶液中平衡的時(shí)間設(shè)為 10s。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明使用玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)及操作方法來代替人工作業(yè)，用液池來取代人工操作時(shí)所需的培養(yǎng)皿，將過程集中化，降低了操作的復(fù)雜性，可以大大提升工作效率，保證了操作的穩(wěn)定性、及時(shí)性和安全性。


為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明中記載的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖I為本發(fā)明玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)的示意圖；圖2為本發(fā)明玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)中玻璃化冷凍器件的示意圖；圖3為本發(fā)明玻璃化冷凍自動化操作方法的流程圖；圖4為本發(fā)明一實(shí)施方式中胚胎從培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移到玻璃化冷凍器件中的示意圖；圖5為本發(fā)明一實(shí)施方式中玻璃毛細(xì)管從液池①中吸取胚胎的示意圖；圖6為本發(fā)明一實(shí)施方式中胚胎從液池①轉(zhuǎn)移至液池②的示意圖；圖7為本發(fā)明一實(shí)施方式中玻璃毛細(xì)管吐出胚胎至液池②的示意圖；圖8為本發(fā)明一實(shí)施方式中胚胎從液池②轉(zhuǎn)移至液池③的示意圖；圖9為本發(fā)明一實(shí)施方式中玻璃毛細(xì)管吐出胚胎至液池③的示意圖；圖10為本發(fā)明一實(shí)施方式中玻璃毛細(xì)管從液池③中吸取胚胎的示意圖；圖11為本發(fā)明一實(shí)施方式中胚胎從液池③轉(zhuǎn)移至液池④的示意圖；圖12為本發(fā)明一實(shí)施方式中玻璃毛細(xì)管吐出胚胎至液池④的示意圖；圖13為本發(fā)明一實(shí)施方式中胚胎從液池④轉(zhuǎn)移至液池⑤的示意圖；圖14為本發(fā)明一實(shí)施方式中玻璃毛細(xì)管吐出胚胎至液池⑤的示意圖；圖15為本發(fā)明一實(shí)施方式中胚胎從液池⑤轉(zhuǎn)移至液池⑥的示意圖；圖16為本發(fā)明一實(shí)施方式中玻璃毛細(xì)管吐出胚胎至液池⑥的示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括計(jì)算機(jī)、XY電機(jī)驅(qū)動工作臺、位于XY電機(jī)驅(qū)動工作臺下的CXD攝像頭、位于XY電機(jī)驅(qū)動工作臺上的玻璃化冷凍器件、位于玻璃化冷凍器件上的倒置顯微鏡、位于玻璃化冷凍器件旁側(cè)的三自由度自動化操作手、以及設(shè)于三自由度自動化操作手上的毛細(xì)管夾持器和玻璃毛細(xì)管，系統(tǒng)還包括與計(jì)算機(jī)相連的用于控制毛細(xì)管夾持器和玻璃毛細(xì)管的液壓泵、與計(jì)算機(jī)相連的用于驅(qū)動三自由度自動化操作手的操作手驅(qū)動器以及與計(jì)算機(jī)相連的用于驅(qū)動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器。同時(shí)本發(fā)明還公開了一種應(yīng)用玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)的操作方法，該方法包括SI、確定并添加玻璃化冷凍器件上對應(yīng)序號的液池所應(yīng)添加的液體；S2、將玻璃化冷凍器件固定在倒置顯微鏡下的XY電機(jī)驅(qū)動工作臺上，在倒置顯微鏡系統(tǒng)坐標(biāo)的基礎(chǔ)上，將玻璃化冷凍器件及液池的三維坐標(biāo)信息輸入計(jì)算機(jī)；S3、通過CXD攝像頭獲取倒置顯微鏡物鏡視野，并通過圖像處理軟件將物鏡下的內(nèi)容顯示在計(jì)算機(jī)上；

S4、從保溫箱中取出裝有胚胎的培養(yǎng)皿，放在倒置顯微鏡下；S5、通過計(jì)算機(jī)發(fā)出指令，驅(qū)動三自由度自動化操作手運(yùn)動，從而帶動玻璃毛細(xì)管在XYZ三方向移動，在倒置顯微鏡下觀察玻璃毛細(xì)管尖端處的位置，確定毛細(xì)管尖端相對玻璃化冷凍器件的空間坐標(biāo)信息，并輸入計(jì)算機(jī)；S6、將培養(yǎng)皿放置在玻璃化冷凍器件旁，使用移液管將胚胎從培養(yǎng)皿中移到液池中；S7、控制三自由度自動化操作手，使得玻璃毛細(xì)管抓取、移動和釋放胚胎，使得胚胎在每個(gè)液池中完成相應(yīng)的冷凍步驟；S8、將胚胎裝載到密閉式細(xì)管載體中進(jìn)行熱封，并放入液氮中保存。本發(fā)明使用玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)及操作方法來代替人工作業(yè)，將過程集中化，降低了操作的復(fù)雜性，可以大大提升工作效率。為了使本技術(shù)領(lǐng)域的人員更好地理解本發(fā)明中的技術(shù)方案，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。參圖I所示，本發(fā)明的一種玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括計(jì)算機(jī)5 ；XY電機(jī)驅(qū)動工作臺9 ；位于XY電機(jī)驅(qū)動工作臺9下的CXD攝像頭2 ；位于XY電機(jī)驅(qū)動工作臺9上的玻璃化冷凍器件8 ；位于玻璃化冷凍器件8上的倒置顯微鏡6 ；位于玻璃化冷凍器件8旁側(cè)的三自由度自動化操作手4 ；設(shè)于三自由度自動化操作手4上的毛細(xì)管夾持器3和玻璃毛細(xì)管7 ；與計(jì)算機(jī)5相連的用于控制毛細(xì)管夾持器和3玻璃毛細(xì)管7的液壓泵I ;與計(jì)算機(jī)5相連的用于驅(qū)動三自由度自動化操作手4的操作手驅(qū)動器10 ；以及與計(jì)算機(jī)5相連的用于驅(qū)動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺9的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器11。本發(fā)明中自動化操作系統(tǒng)的玻璃化冷凍器件8是由醫(yī)用聚碳酸酯材料注塑制成，此種材料無色透明，適合在顯微鏡下操作，且獲FDA許可和達(dá)到IS010999標(biāo)準(zhǔn)Part I關(guān)于生物相容性要求，可以用來作為胚胎的冷凍器件。
玻璃化冷凍器件8包括若干陣列設(shè)置的液池，每個(gè)液池有對應(yīng)的序號，倒入不同的平衡液、冷凍保護(hù)劑等，操作時(shí)按照序號依次自動進(jìn)行，這樣可以用液池來取代人工操作時(shí)所需的培養(yǎng)皿，將過程集中化，降低了操作的復(fù)雜性，可以大大提升工作效率。參圖2所示，在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方式中液池?cái)?shù)量設(shè)為6個(gè)，呈3*2矩陣設(shè)置，每個(gè)液池上有各自的編號，分別為液池①81、液池②82、液池③83、液池④84、液池⑤85、液池⑥86，液池為方形，且液池的四個(gè)側(cè)壁與底面的夾角為鈍角。優(yōu)選地，每個(gè)液池的容積為75 μ L，深度為2mm。液池中設(shè)有ES溶液或VS溶液，液池中ES溶液或VS溶液的體積設(shè)為 20 μ L。參圖3所示，本發(fā)明的一種應(yīng)用玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)的操作方法，該方法包括SI、確定并添加玻璃化冷凍器件上對應(yīng)序號的液池所應(yīng)添加的液體；
S2、將玻璃化冷凍器件固定在倒置顯微鏡下的XY電機(jī)驅(qū)動工作臺上，在倒置顯微鏡系統(tǒng)坐標(biāo)的基礎(chǔ)上，將玻璃化冷凍器件及液池的三維坐標(biāo)信息輸入計(jì)算機(jī)；S3、通過CXD攝像頭獲取倒置顯微鏡物鏡視野，并通過圖像處理軟件將物鏡下的內(nèi)容顯示在計(jì)算機(jī)上；S4、從保溫箱中取出裝有胚胎的培養(yǎng)皿，放在倒置顯微鏡下；S5、通過計(jì)算機(jī)發(fā)出指令，驅(qū)動三自由度自動化操作手運(yùn)動，從而帶動玻璃毛細(xì)管在XYZ三方向移動，在倒置顯微鏡下觀察玻璃毛細(xì)管尖端處的位置，確定毛細(xì)管尖端相對玻璃化冷凍器件的空間坐標(biāo)信息，并輸入計(jì)算機(jī)；S6、將培養(yǎng)皿放置在玻璃化冷凍器件旁，使用移液管將胚胎從培養(yǎng)皿中移到液池中；S7、控制三自由度自動化操作手，使得玻璃毛細(xì)管抓取、移動和釋放胚胎，使得胚胎在每個(gè)液池中完成相應(yīng)的冷凍步驟；S8、將胚胎裝載到密閉式細(xì)管載體中進(jìn)行熱封，并放入液氮中保存。下面以自制的玻璃化冷凍器件為基礎(chǔ)，具體介紹玻璃化冷凍的自動化操作過程。操作環(huán)境要求室溫(20-27° C)，操作過程中顯微鏡平臺不能過熱，細(xì)胞在ES和VS溶液中平衡時(shí)，胚胎的曝光量要盡量小。具體步驟如下確定并添加玻璃化冷凍器件上對應(yīng)序號的液池所應(yīng)添加的液體，并給密閉式細(xì)管載體Cryotip標(biāo)注必要信息；將玻璃化冷凍器件固定在倒置顯微鏡下的XY電機(jī)驅(qū)動工作臺上，在倒置顯微鏡系統(tǒng)坐標(biāo)的基礎(chǔ)上，將玻璃化冷凍器件及液池的三維坐標(biāo)信息輸入計(jì)算機(jī)；輕輕顛倒ES和VS溶液瓶兩次使溶液混合，在液池②82中滴有20 μ L的ES液滴，在液池③83、液池④84、液池⑤85、液池⑥86中各滴有20 μ L的VS溶液，分別為VSl溶液、VS2溶液、VS3溶液和VS4溶液；通過CXD攝像頭獲取倒置顯微鏡物鏡視野，并通過圖像處理軟件將物鏡下的內(nèi)容顯示在計(jì)算機(jī)上；從保溫箱中取出裝有胚胎的培養(yǎng)皿，放在倒置顯微鏡下，并在計(jì)算機(jī)屏幕上檢查胚胎質(zhì)量，選擇質(zhì)量最好的胚胎來進(jìn)行玻璃化冷凍；通過計(jì)算機(jī)發(fā)出指令，驅(qū)動三自由度自動化操作手運(yùn)動，從而帶動玻璃毛細(xì)管在XYZ三方向移動，在倒置顯微鏡下觀察玻璃毛細(xì)管尖端處的位置，確定毛細(xì)管尖端相對玻璃化冷凍器件的空間坐標(biāo)信息，并輸入計(jì)算機(jī)；將培養(yǎng)皿20放置在玻璃化冷凍器件8旁，使用移液管30將胚胎40從培養(yǎng)皿20中移到液池①81中(參圖4所示)；調(diào)節(jié)XY電機(jī)驅(qū)動工作臺及倒置顯微鏡，使胚胎在計(jì)算機(jī)屏幕上可以清晰地顯示，控制三自由度自動化操作手，使得玻璃毛細(xì)管抓取、移動和釋放胚胎，使得胚胎在每個(gè)液池中完成相應(yīng)的冷凍步驟。參圖5-16并結(jié)合圖I所示，自動化操作步驟具體如下參圖5所示，通過計(jì)算機(jī)給三自由度自動化操作手輸入適當(dāng)步進(jìn)量，移動玻璃毛細(xì)管7在水平方向上靠近液池①81，在移動過程中，使玻璃毛細(xì)管7的尖端在豎直方向上明顯高于玻璃化冷凍器件8，以防發(fā)生碰撞；
當(dāng)玻璃毛細(xì)管7尖端到達(dá)液池①81上部時(shí)，驅(qū)動三自由度自動化操作手在Z方向運(yùn)動，讓玻璃毛細(xì)管7下降。當(dāng)尖端在屏幕上變得清晰時(shí)，說明尖端到達(dá)細(xì)胞位置；打開液壓泵控制界面，輸入所需負(fù)壓參數(shù)，使玻璃毛細(xì)管尖端產(chǎn)生負(fù)壓，將胚胎吸入玻璃毛細(xì)管端部。參圖6所示，驅(qū)動三自由度自動化操作手將玻璃毛細(xì)管7垂直上升5mm，然后沿著液池分布方向，以設(shè)定好的相鄰兩個(gè)液池之間的距離，向左移動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺，使玻璃毛細(xì)管處于液池②82上部，此時(shí)液池②82底部處于倒置顯微鏡焦點(diǎn)。參圖7所示，玻璃毛細(xì)管下降，尖端靠近ES溶液表面，增大壓力液壓泵，將胚胎吐到ES頂部，關(guān)閉液壓泵。再將玻璃毛細(xì)管退回到原來高度，胚胎在ES液滴中自由下降。開始計(jì)時(shí),讓胚胎在ES溶液中平衡5_15min。接下來的后續(xù)所有步驟要在90-110S內(nèi)完成。平衡結(jié)束后，玻璃毛細(xì)管以小步進(jìn)量接近液池底部，當(dāng)尖端也變得清晰時(shí)，可以認(rèn)為尖端與胚胎已處在統(tǒng)一水平面上，在XY方向上移動玻璃毛細(xì)管使尖端靠近胚胎。參圖8所示，打開液壓泵，產(chǎn)生負(fù)壓，在玻璃毛細(xì)管中吸入適量ES溶液，再將胚胎吸入玻璃毛細(xì)管尖立而；尖端上升，然后沿著液池分布方向，向左移動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺，使玻璃毛細(xì)管處于液池③83上部，此時(shí)液池③83底部處于倒置顯微鏡焦點(diǎn)。參圖9所示，增加玻璃毛細(xì)管中壓力，將胚胎吐出在VSl溶液中，卸去玻璃毛細(xì)管中壓力，玻璃毛細(xì)管尖端位置不動，讓胚胎在VSl溶液中保持5s。參圖10、11所示，玻璃毛細(xì)管中產(chǎn)生負(fù)壓，將胚胎吸入尖端，再上升3mm (圖10)，驅(qū)動工作臺XY方向電機(jī)，使工作臺先向后移動一個(gè)液池距離，再向右移動兩個(gè)液池距離，使玻璃毛細(xì)管處于液池④84上部(圖11)，此時(shí)液池④84底部處于倒置顯微鏡焦點(diǎn)。參圖12所示，玻璃毛細(xì)管尖端下降3mm，增加玻璃毛細(xì)管中壓力，將胚胎吐出在VS2溶液中，卸去壓力，玻璃毛細(xì)管尖端位置不動，讓胚胎在VS2溶液中保持5s。參圖13所示，玻璃毛細(xì)管中產(chǎn)生負(fù)壓，將胚胎吸入尖端，再上升3mm，然后沿著液池分布方向，向左移動工作臺，使玻璃毛細(xì)管處于液池⑤85上部，此時(shí)液池⑤85底部處于倒置顯微鏡焦點(diǎn)。參圖14所示，玻璃毛細(xì)管尖端下降3mm，增加玻璃毛細(xì)管中壓力，將胚胎吐出在VS3溶液中，卸去玻璃毛細(xì)管中壓力，玻璃毛細(xì)管尖端位置不動，讓胚胎在VS3溶液中保持IOs0參圖15所示，玻璃毛細(xì)管中產(chǎn)生負(fù)壓，將胚胎吸入尖端，再上升3mm，然后沿著液池分布方向，向左移動工作臺，使玻璃毛細(xì)管處于液池⑥86上部，此時(shí)液池⑥86底部處于倒置顯微鏡焦點(diǎn)。參圖16所示，玻璃毛細(xì)管尖端下降，當(dāng)尖端清晰時(shí)增加壓力將胚胎吐出在VS4溶液底部。最后將胚胎裝載到準(zhǔn)備好的密閉式細(xì)管載體Cryotip中并進(jìn)行熱封，并將密閉式細(xì)管載體Cryotip投入液氮保存。由上述技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明使用玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)及操作方法來代替人工作業(yè)，用液池來取代人工操作時(shí)所需的培養(yǎng)皿，將過程集中化，降低了操作的復(fù)雜性，可以大大提升工作效率，保證了操作的穩(wěn)定性、及時(shí)性和安全性。 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。不應(yīng)將權(quán)利要求中的任何附圖標(biāo)記視為限制所涉及的權(quán)利要求。此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。
權(quán)利要求
1.一種玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括計(jì)算機(jī)、XY電機(jī)驅(qū)動工作臺、位于XY電機(jī)驅(qū)動工作臺下的CXD攝像頭、位于XY電機(jī)驅(qū)動工作臺上的玻璃化冷凍器件、位于玻璃化冷凍器件上的倒置顯微鏡、位于玻璃化冷凍器件旁側(cè)的三自由度自動化操作手、以及設(shè)于三自由度自動化操作手上的毛細(xì)管夾持器和玻璃毛細(xì)管，所述系統(tǒng)還包括與計(jì)算機(jī)相連的用于控制毛細(xì)管夾持器和玻璃毛細(xì)管的液壓泵、與計(jì)算機(jī)相連的用于驅(qū)動三自由度自動化操作手的操作手驅(qū)動器以及與計(jì)算機(jī)相連的用于驅(qū)動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)，其特征在于，所述玻璃化冷凍器件包括若干陣列設(shè)置的液池。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)，其特征在于，所述液池設(shè)為6個(gè)，分別為液池①、液池②、液池③、液池④、液池⑤和液池⑥。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)，其特征在于，所述液池為方形，且所述液池的四個(gè)側(cè)壁與底面的夾角為鈍角。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)，其特征在于，所述每個(gè)液池的容積為75 μ L,深度為2mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)，其特征在于，所述液池中設(shè)有平衡液，所述平衡液包括ES溶液或VS溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)，其特征在于，所述液池中平衡液的體積設(shè)為20 μ L0
8.一種應(yīng)用權(quán)利要求I所述玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)的操作方法，其特征在于，所述方法包括 51、確定并添加玻璃化冷凍器件上對應(yīng)序號的液池所應(yīng)添加的平衡液； 52、將玻璃化冷凍器件固定在倒置顯微鏡下的XY電機(jī)驅(qū)動工作臺上，在倒置顯微鏡系統(tǒng)坐標(biāo)的基礎(chǔ)上，將玻璃化冷凍器件及液池的三維坐標(biāo)信息輸入計(jì)算機(jī)； 53、通過CXD攝像頭獲取倒置顯微鏡物鏡視野，并通過圖像處理軟件將物鏡下的內(nèi)容顯示在計(jì)算機(jī)上； 54、從保溫箱中取出裝有胚胎的培養(yǎng)皿，放在倒置顯微鏡下； 55、通過計(jì)算機(jī)發(fā)出指令，驅(qū)動三自由度自動化操作手運(yùn)動，從而帶動玻璃毛細(xì)管在XYZ三方向移動，在倒置顯微鏡下觀察玻璃毛細(xì)管尖端處的位置，確定毛細(xì)管尖端相對玻璃化冷凍器件的空間坐標(biāo)信息，并輸入計(jì)算機(jī)； 56、將培養(yǎng)皿放置在玻璃化冷凍器件旁，使用移液管將胚胎從培養(yǎng)皿中移到液池中； 57、控制三自由度自動化操作手，使得玻璃毛細(xì)管抓取、移動和釋放胚胎，使得胚胎在每個(gè)液池中完成相應(yīng)的冷凍步驟； 58、將胚胎裝載到密閉式細(xì)管載體中進(jìn)行熱封，并放入液氮中保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的玻璃化冷凍自動化操作方法，其特征在于，所述液池設(shè)為6個(gè)，分別為液池①、液池②、液池③、液池④、液池⑤和液池⑥，所述液池②設(shè)有ES溶液，液池③、液池④、液池⑤和液池⑥中設(shè)有VS溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的玻璃化冷凍自動化操作方法，其特征在于，所述步驟S7具體為通過計(jì)算機(jī)給三自由度自動化操作手輸入適當(dāng)步進(jìn)量，移動玻璃毛細(xì)管至液池①上方，驅(qū)動三自由度自動化操作手在Z方向運(yùn)動，通過液壓泵將胚胎吸入玻璃毛細(xì)管端部；驅(qū)動三自由度自動化操作手移動玻璃毛細(xì)管，同時(shí)移動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺，使玻璃毛細(xì)管處于液池②上部，玻璃毛細(xì)管下降，將胚胎吐到液池②中ES溶液頂部，使胚胎在液池②中自由下降，進(jìn)行平衡； 在玻璃毛細(xì)管中吸入適量ES溶液，再將胚胎吸入玻璃毛細(xì)管尖端，尖端上升，移動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺，使玻璃毛細(xì)管處于液池③上部，玻璃毛細(xì)管下降，將胚胎吐到液池③中VS溶液頂部，使胚胎在液池③中自由下降，進(jìn)行平衡； 將胚胎吸入玻璃毛細(xì)管尖端，尖端上升，移動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺，使玻璃毛細(xì)管處于液池④上部，玻璃毛細(xì)管下降，將胚胎吐到液池④中VS溶液頂部，使胚胎在液池④中自由下降，進(jìn)行平衡； 將胚胎吸入玻璃毛細(xì)管尖端，尖端上升，移動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺，使玻璃毛細(xì)管處于液池⑤上部，玻璃毛細(xì)管下降，將胚胎吐到液池⑤中VS溶液頂部，使胚胎在液池⑤中自由下降，進(jìn)行平衡； 將胚胎吸入玻璃毛細(xì)管尖端，尖端上升，移動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺，使玻璃毛細(xì)管處于液池⑥上部，玻璃毛細(xì)管下降，將胚胎吐到液池⑥中VS溶液頂部，使胚胎在液池⑥中自由下降，進(jìn)行平衡。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的玻璃化冷凍自動化操作方法，其特征在于，所述胚胎在液池②ES溶液中平衡的時(shí)間設(shè)為5-15min，胚胎在液池③和液池④VS溶液中平衡的時(shí)間設(shè)為5s，胚胎在液池⑤VS溶液中平衡的時(shí)間設(shè)為10s。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)及操作方法，系統(tǒng)包括計(jì)算機(jī)、XY電機(jī)驅(qū)動工作臺、位于XY電機(jī)驅(qū)動工作臺下的CCD攝像頭、位于XY電機(jī)驅(qū)動工作臺上的玻璃化冷凍器件、位于玻璃化冷凍器件上的倒置顯微鏡、位于玻璃化冷凍器件旁側(cè)的三自由度自動化操作手、以及設(shè)于三自由度自動化操作手上的毛細(xì)管夾持器和玻璃毛細(xì)管，還包括與計(jì)算機(jī)相連的用于控制毛細(xì)管夾持器和玻璃毛細(xì)管的液壓泵、與計(jì)算機(jī)相連的用于驅(qū)動三自由度自動化操作手的操作手驅(qū)動器以及與計(jì)算機(jī)相連的用于驅(qū)動XY電機(jī)驅(qū)動工作臺的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器。本發(fā)明使用玻璃化冷凍自動化操作系統(tǒng)及操作方法來代替人工作業(yè)，將過程集中化，降低了操作的復(fù)雜性，可以大大提升工作效率。
文檔編號A01N1/02GK102835389SQ20121033401
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者汝長海, 朱玉龍, 皋龍成 申請人:蘇州大學(xué)