專利名稱：一種增強(qiáng)基因表達(dá)的ubi1內(nèi)含子序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種增強(qiáng)基因表達(dá)的ubil內(nèi)含子序列。本發(fā)明還涉及該ubil 內(nèi)含子的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大多數(shù)真核基因都被一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子所間隔，這些間隔序列可以轉(zhuǎn)錄成pre-mRNA，這些轉(zhuǎn)錄本只有在細(xì)胞核中經(jīng)剪接復(fù)合體的作用去除內(nèi)含子片段后，才能形成成熟mRNA，然后穿過核孔轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯。真核pre-mRNA的剪接是一個(gè)在細(xì)胞核中完成的、嚴(yán)格保守的化學(xué)反應(yīng)，該過程包括剪接體識(shí)別外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)段，通過兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)切除內(nèi)含子并使相鄰的外顯子連接。內(nèi)含子雖然是基因中只被轉(zhuǎn)錄而不被翻譯的序列，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子并不是基因上的一段冗余序列，相反，內(nèi)含子在基因表達(dá)方面起著重要的調(diào)控作用。這種由內(nèi)含子介導(dǎo)的使基因表達(dá)活性增強(qiáng)的效應(yīng)叫做內(nèi)含子增強(qiáng)效應(yīng)(intron-mediatedenhancement, IME) (Callis et al. ,Genes Development, 1987,1:1183-1200)。真核 mRNA內(nèi)含子已成為提高轉(zhuǎn)基因生物外源基因表達(dá)的重要元件之一。單子葉植物的內(nèi)含子增強(qiáng)效應(yīng)高于雙子葉植物，雙子葉植物內(nèi)含子增強(qiáng)效應(yīng)一般在 2-5 倍，而單子葉植物可達(dá) 10-100 倍(Simpson 和 Filipowicz, Plant Mol. Biol.，1996，32 :1-41)。雙子葉植物內(nèi)含子可以提高單子葉植物基因的表達(dá)，而由于單子葉植物內(nèi)含子與外顯子AU的平均含量為59%和44%，雙子葉植物的分別為74%和55%，高AU含量可以使內(nèi)含子更易形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)從而有利于剪接，因此，單子葉植物內(nèi)含子通常不會(huì)提高雙子葉植物基因的表達(dá)(Vain et al.，Plant cell R印，1996，15:489-494)。Ueki 等將 PLD、Cat 和Ubi (玉米u(yù)biquitin第一個(gè)內(nèi)含子)內(nèi)含子與不同啟動(dòng)子連接,分別轉(zhuǎn)化玉米和煙草的原生質(zhì)體，驗(yàn)證各個(gè)載體表達(dá)特點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有內(nèi)含子載體的報(bào)告基因表達(dá)水平在玉米原生質(zhì)體中普遍高于同樣載體的煙草原生質(zhì)體的表達(dá)水平，內(nèi)含子載體增強(qiáng)效應(yīng)與啟動(dòng)子、內(nèi)含子和報(bào)告基因等緊密相關(guān)(Ueki et al.，Plant Biotech, 2004, 21 (I) :15_24)。泛素(ubiquitin)是一種存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中的由76個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的蛋白質(zhì)。1992年，Christensen等從玉米中克隆出了編碼泛素蛋白的Ubi-I和Ubi-2基因，并準(zhǔn)確定位了 Ubi-I的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、5’側(cè)翼序列處的0. 9kb轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和完整的5’非編碼區(qū)，并構(gòu)建pUBI-CAT載體，在玉米和其它單子葉植物的原生質(zhì)體中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Ubi-I啟動(dòng)子比CaMV35S具有更高的增強(qiáng)基因表達(dá)的效應(yīng)(Christensen etal.,Plant Mol Biol，1992，18 :675-689)。Vain等通過比較發(fā)現(xiàn)，ubil內(nèi)含子與側(cè)翼外顯子的41nt所構(gòu)建的載體(p35Subi⑶S)在玉米懸浮細(xì)胞中的增強(qiáng)效應(yīng)高于其它載體，增強(qiáng)效應(yīng)可提高71倍(Vainet al. ,Plant cell R印，1996，15 :489_494)。王悅冰比較了玉米泛素蛋白基因的第一內(nèi)含子(ubil)、水稻肌動(dòng)蛋白基因的第一內(nèi)含子(actl)、玉米乙醇脫氫酶基因的第一內(nèi)含子(adhl)和馬鈴薯高賴氨酸基因SBgLR基因的第二內(nèi)含子(SBgLR2)對(duì)基因表達(dá)的增強(qiáng)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ubil增強(qiáng)報(bào)告基因的表達(dá)能力最強(qiáng)；盡管已知并不是內(nèi)含子中所有序列為提高基因表達(dá)所必需，但尚未見到有關(guān)通過缺失分析對(duì)Ubil內(nèi)含子改造研究的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是對(duì)來源于玉米 泛素蛋白基因ubil內(nèi)含子進(jìn)行缺失分析，提供一種可以增強(qiáng)基因表達(dá)的內(nèi)含子，通過構(gòu)建該改造的泛素蛋白內(nèi)含子的植物表達(dá)載體，將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物的培育中，可以提高其他基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。本發(fā)明通過如下工作達(dá)到了上述發(fā)明目的I、內(nèi)含子缺失載體的構(gòu)建策略本發(fā)明以u(píng)biquitin基因第一內(nèi)含子序列(SEQ ID N0:1)為目標(biāo)序列。在此序列中，有下劃線部分表示缺失備選位點(diǎn)。SEQ ID NO: II GTACGCCGCT CGTCCTCCCC CCCCCCCCCT CTCTACCTTC TCTAGATCGG CGTTCCGGTC61 CATGGTTAGG GCCCGGTAGT TCTACTTCTG TTCATGTTTG TGTTAGATCC GTGTTTGTGT121TAGATCCGTG CTGCTAGCGT TCGTACACGG ATGCGACCTG TACGTCAGAC ACGTTCTGAT181TGCTAACTTG CCAGTGTTTC TCTTTGGGGA ATCCTGGGAT GGCTCTAGCC GTTCCGCAGA241CGGGATCGAT TTCATGATTT TTTTTGTTTC GTTGCATAGG GTTTGGTTTG CCCTTTTCCT301TTATTTCAAT ATATGCCGTG CACTTGTTTG TCGGGTCATC TTTTCATGCT TTTTTTTGTC361TTGGTTGTGA TGATGTGGTC TGGTTGGGCG GTCGTTCTAG ATCGGAGTAG AATTAATTCT421GTTTCAAACT ACCTGGTGGA TTTATTAATT TTGGATCTGT ATGTGTGTGC CATACATATT481CATAGTTACG AATTGAAGAT GATGGATGGA AATATCGATC TAGGATAGGT ATACATGTTG541ATGCGGGTTT TACTGATGCA TATACAGAGA TGCTTTTTGT TCGCTTGGTT GTGATGATGT601 GGTGTGGTTG GGCGGTCGTT CATTCGTTCT AGATCGGAGT AGAATACTGT TTCAAACTAC661 CTGGTGTATT TATTAATTTT GGAACTGTAT GTGTGTGTCA TACATCTTCA TAGTTACGAG721 TTTAAGATGG ATGGAAATAT CGATCTAGGA TAGGTATACA TGTTGATGTG GGTTTTACTG781 ATGCATATAC ATGATGGCAT ATGCAGCATC TATTCATATG CTCTAACCTT GAGTACCTAT841 CTATTATAAT AAACAAGTAT GTTTTATAAT TATTTTGATC TTGATATACT TGGATGATGG901 CATATGCAGC AGCTATATGT GGATTTTTTT AGCCCTGCCT TCATACGCTA TTTATTTGCT961 TGGTACTGTT TCTTTTGTCG ATGCTCACCC TGTTGTTTGG TGTTACTTCT GCAG采用以下方法對(duì)上述序列進(jìn)行改造首先，米用來自 “http: //korf lab, ucdavis. edu/CRi-bin/web-imeter. pi，，的應(yīng)用檢索軟件對(duì)玉米u(yù)bil序列(1014bp)進(jìn)行IME (intron-mediated enhancement)基序檢索，并得到內(nèi)含子的得分值。由于該軟件所得的內(nèi)含子分析數(shù)據(jù)來源于擬南芥和水稻基因組的序列信息，只針對(duì)擬南芥和水稻?？紤]到玉米和水稻同屬于單子葉植物，所以本發(fā)明選用水稻物種的信息，通過生物信息學(xué)分析獲得內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的初級(jí)信息。其次，根據(jù)內(nèi)含子左右邊界序列特點(diǎn)(5’迎……M3’)，保證邊界序列不被破壞從而可以正確剪接，依據(jù)GT、AG位置篩選缺失序列。在選擇位置時(shí)，固定一端位置不變，從另一端選擇待缺失位點(diǎn)，以此獲得單一末端缺失序列。5’端GT序列待選位置52，96，110，143,231,281 (SEQ ID NO: I 劃線處)，3’ 端 AG 序列備選位置639，713，748，806，857 (SEQID NO: I劃線處)，同時(shí)分析缺失片段的AT含量及獲得的內(nèi)含子序列分值。結(jié)果如表I和表2。表中“得分”為所得的內(nèi)含子分值，分值越高，意味著增強(qiáng)基因表達(dá)的能力越強(qiáng)；“AT含量”表示在SEQ ID NOl中A堿基和T堿基的個(gè)數(shù)占總堿基個(gè)數(shù)的百分比。表Iubil內(nèi)含子3’末端缺失序列分析
權(quán)利要求
1.一種可以提聞基因表達(dá)的內(nèi)含子序列，其特征是具有SEQ ID NO :2所不的核昔酸序列。
2.權(quán)利要求I所述的內(nèi)含子序列在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
3.一種提高ubil內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)水平的方法，其特征是對(duì)ubil內(nèi)含子進(jìn)行特定位置的缺失。
4.權(quán)利要求3所述的方法，所述內(nèi)含子是泛素蛋白內(nèi)含子，所述缺失是將SEQID NOI中l(wèi)_142bp進(jìn)行缺失。
5.一種植物表達(dá)載體，其特征是含有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求5所述的載體在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明對(duì)來源于玉米u(yù)biquitin第一內(nèi)含子進(jìn)行缺失分析，獲得了可以增強(qiáng)外源基因表達(dá)的新型內(nèi)含子序列，該內(nèi)含子序列長(zhǎng)為872bp，AT含量為61.0%，可以提高基因表達(dá)13倍，與全長(zhǎng)的ubiquitin第一內(nèi)含子相比，提高外源基因表達(dá)能力增加30%。本發(fā)明獲得的內(nèi)含子可以用于高效植物表達(dá)載體的構(gòu)建，提高轉(zhuǎn)基因植物外源基因表達(dá)水平。本發(fā)明通過構(gòu)建含該改造的內(nèi)含子的植物表達(dá)載體，將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物的培育中，可以提高其他基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102747081SQ20121026298
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月26日
發(fā)明者朱莉, 潘陽陽, 郎志宏, 黃大昉 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所