專利名稱：一種雜合抗菌肽畢赤酵母工程菌制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地說是一種雜合抗菌肽基因轉化畢赤酵母工程菌制備方法及應用。
背景技術：
抗菌妝(antibacterialpeptides),又稱抗微生物妝(peptide antibiotics),是生物體在抵抗病原微生物的防御反應過程中產(chǎn)生的一種具有抗微生物小分子多肽，廣泛存在于植物、細菌、無脊椎動物及脊椎動物體內，是生物先天免疫的重要效應分子。自瑞典科
學家Boman等人于1981年首次從古比天蠶(Hyalophora cecropin)中發(fā)現(xiàn)抗菌肽-天
蠶素(CeCiOpin)A和B以來，目前已從昆蟲、甲殼類、鳥類、兩棲動物、哺乳動物體內成功分離出幾百種抗菌肽?？咕某司哂袕V譜的抗菌活性外，還具有抗原蟲、抗真菌、抗病毒和抑制或殺傷腫瘤細胞等作用?？咕挠兄c青霉素等傳統(tǒng)抗生素完全不同的作用機制，病原菌不易產(chǎn)生對抗菌肽的耐藥性，此外，抗菌肽一般情況下只作用于原核細胞和發(fā)生病變的真核細胞，而對正常的真核細胞無影響。在畜牧業(yè)養(yǎng)殖生產(chǎn)及飼料中長期添加抗生素的做法受到嚴格檢查和廣泛質疑的背景之下，抗菌肽獨特的殺菌機制和理化性質使其作為無毒無害無殘留的抗微生物添加劑在飼料中有著廣泛的應用前景。作為一種廣譜、高效、無殘留的新型抗微生物藥物，抗菌肽應用于飼料中具有明顯的優(yōu)勢:(1)動物抗菌肽具有熱穩(wěn)定性，可耐受飼料制粒時的高溫而不導致動物抗菌肽失活；(2)動物抗菌肽具備抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力，添加在飼料中可經(jīng)消化道完整吸收而發(fā)揮作用；(3)動物抗菌肽殺菌機理獨特，病原菌不易對動物抗菌肽產(chǎn)生耐藥性，并且無殘留；(4)通過基因工程方法生產(chǎn)抗菌肽，可大規(guī)模生產(chǎn)，周期短，成本低且不易受外在因素的影響。
蜂毒肽是意大利蜂(Apismellifera)毒液的主要活性成分，由20個氨基酸組成，一級結構為:GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2，蜂毒肽能夠形成兩親性的α -螺旋結構，5個堿性氨基酸中的4個集中在肽鏈的C端(KRKR)，是典型的陽離子抗菌肽。牛乳鐵蛋白肽Lfcin B是所有牛乳鐵蛋白中活性最高的，抑菌效果是牛乳鐵蛋白400倍，能在胃腸道中發(fā)揮更重要的作用。根據(jù)抗菌肽牛乳鐵蛋白肽(Lfcin B)與富含甘氨酸的蜂毒肽(Melittin)的核心功能序列，將Lfcin B (1-25)和Magainin (12-26) 二者連接起來,設計一種新型雜合抗菌肽LFB-Mel，該抗菌肽分子N端形成親水脂的兩個反向β折疊結構，中間形成雙親性的α螺旋結構，C端的連續(xù)四個堿性氨基酸使得抗菌肽分子帶有正電荷，能夠與帶負電荷的細胞膜結合，雜合抗菌肽摒棄了蜂毒肽的溶血活性，其抗菌活性和穩(wěn)定性均優(yōu)于單一抗菌肽分子。將該雜合抗菌肽基因轉化畢赤酵母工程菌，進行高密度發(fā)酵和誘導表達，制成抗菌肽產(chǎn)品，該產(chǎn)品經(jīng)豬養(yǎng)殖試驗表明，能夠完全代替抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的使用，具有抗病、促進生長、提高免疫力、降低料肉比和提高繁殖能力等功能，具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的雜合抗菌肽LFB_Mel和編碼該蛋白的基因LfcinB_Mel。本發(fā)明的另一個目的在于提供該抗菌肽制品的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的進一步目的在于提供該抗菌肽在飼料添加劑中的應用?？咕淖鳛轱暳咸砑觿┰谛竽翗I(yè)生產(chǎn)中有其獨特的優(yōu)勢，抗菌肽能耐受飼料制粒時的高溫，規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽時經(jīng)高溫濃縮工序，可充分殺滅酵母菌體而不導致抗菌肽失活，產(chǎn)品在推廣應用后不會出現(xiàn)工程菌的擴散而導致環(huán)境生態(tài)問題。以基因工程方法制備工程菌，并用工程菌產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽，其生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低，且不受季節(jié)和氣候變化等外在環(huán)境的影響，可大規(guī)模生產(chǎn)?？咕漠a(chǎn)品具廣譜抗菌作用，對畜禽具有促生長、保健和治療疾病的功能，是很好的抗生素替代品，能有效地解決人和動物藥殘和病原菌耐藥性的問題，屬無毒副作用、無殘留、無耐藥性的一類環(huán)保型綠色飼料添加劑。


圖1是分段引物PCR互補合成雜合抗菌肽基因Lfcin B_Mel流程圖。圖2是電泳檢測PCR互補合成的雜合抗菌肽基因圖。圖3是質粒載體pPICZaA物理圖譜。圖4是雜合抗菌肽基因畢赤酵母重組菌株構建的流程圖。

圖5是SDS-PAGE檢測雜合抗菌肽的誘導表達，I為Protein Marker，2為空載體轉化畢赤酵母菌后誘導表達的對照，3為雜合抗菌肽畢赤酵母工程菌誘導表達檢測。圖6是誘導表達的發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌和尿腸球菌的抗菌實驗結果，圖中:金黃色葡萄球菌:1表示氨芐青霉素的抗菌活性；2、3、4、5、6、7為畢赤酵母工程菌表達抗菌肽發(fā)酵液的抗菌活性；尿腸球菌(耐藥菌):1表示氨芐青霉素的抗菌活性；2為H20的抗菌活性，3、4、5為畢赤酵母工程菌表達抗菌肽發(fā)酵液的抗菌活性。
具體實施例方式實施例1雜合抗菌肽畢赤酵母工程菌的構建1.雜合抗菌肽基因Lfcin B_Mel的合成:對抗菌妝基因Lfcin B_Mel進行優(yōu)化設計，分別合成Primerl、Primer2和Primer3三段引物，采用設計互補引物進行分段互補PCR合成與擴增的方法，直接由PCR合成基因Lfcin B_Mel。合成抗菌肽基因Lfcin B_Mel流程圖如圖1所示。合成后的引物用ddH20稀釋成ΙΟμπιοΙ/L溶液，-20°C保存。引物序列如下(陰影部分為Xho I酶切位點，下劃線部分為Xba I酶切位點):Primerl:CATG CTCGAGAAAAGATTT AAGTGT AGA AGATGG CAATGGAGA ATG AAG AAGTTGGGT GCTCCAPrimer2:AAG TTG GGT GCT CCA TCT ATT ACT TGT GTT AGA AGA GCT TTC GGTTTGCCAGCTTTGAPrimer3:CCGTCTAGA_TCATTGTTGTCTCTTTCTCTTGATCCAA
GAAATCAAAGCTGG單基因的分段互補PCR合成第I階段PCR反應(St印I):PCR反應體系
權利要求
1.一種雜合抗菌肽基因轉化畢赤酵母工程菌，其特征是一種雜合抗菌肽基因Lfcin B_Mel轉化GS115、KM71和X33等畢赤酵母菌株而制得的工程菌。
2.根據(jù)權利要求1所述的抗菌肽基因轉化畢赤酵母工程菌，其特征在于所述的載體是pPICZ a A、pPIC3.5K、pPIC9K、pGAPZ a A 等畢赤酵母表達載體。
3.根據(jù)權利要求1所述的抗菌肽基因轉化畢赤酵母工程菌，其特征在于所述的基因是雜合抗菌肽基因Lfcin B_Mel，其核苷酸序列如下:TTTAAGTGTAGA AGA TGGCAATGGAGAATGAAGAAGTTGGGTGCTCCATCTATTACTTGTGTTAGAAGAGCTTTCGGTTTGCCA GCT TTG ATT TCT TGG ATCAAG AGA AAG AGACAACAA。
4.根據(jù)權利要求2所述的抗菌肽基因，其特征在于，經(jīng)酵母偏愛密碼子優(yōu)化的DNA序列為:TTT AAGTGTAGA AGA TGGCAATGGAGAATGAAGAAGTTGGGTGCTCCATCTATTACTTGTGTTAGAAGAGCTTTCGGTTTGCCA GCT TTG ATT TCT TGG ATC AAG AGA AAGAGACAACAAο
5.根據(jù)權利要求2所述基因編碼蛋白LFB_Mel，其特征在于，其氨基酸序列為:FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAFGLPALISWIKRKRQQo
6.根據(jù)權利要求1所述的抗菌肽LFBMel制品，其特征在于，制備方法包括如下步驟: (1)將抗菌肽基因LfcinB_Mel經(jīng)酵母偏愛密碼子優(yōu)化后設計引物合成基因序列； (2)將抗菌肽基因LfcinB克隆到表達載體pPICZ α Α,得到重組表達載體pPICZa A-Lfcin B_Mel ；(3)將重組表達載體pPICZa A-Lfcin B_Mel電擊轉化畢赤酵母GS115 ； (4)在pH6.0的YPD培養(yǎng)基中，以終濃度為1%的甲醇，對上述重組酵母基因工程菌誘導表達5天； (5)放料，發(fā)酵液經(jīng)80°C以上高溫處理后，噴霧干燥得到轉抗菌肽LFB_Mel的制品。
7.根據(jù)權利要求5所述的抗菌肽LFB_Mel制品，其特征在于所敘述的抗菌肽在養(yǎng)殖中的應用。
8.根據(jù)權利要求5所述的抗菌肽LFB_Mel制品，其特征在于，所述及的應用是在制備飼料添加劑，促進豬的生長。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雜合抗菌肽LFB_Mel和編碼該蛋白的基因Lfcin B_Mel，其DNA序列如序列表中1所示，該基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中2所示。本發(fā)明根據(jù)酵母偏愛密碼子重新設計雜合抗菌肽基因Lfcin B_Mel，合成其DNA序列轉化于畢赤酵母中表達，形成雜合抗菌肽基因的畢赤酵母工程菌。同時優(yōu)化該菌發(fā)酵條件，達到高密度發(fā)酵和高效表達的效果。該工程菌發(fā)酵液對Gram+菌、Gram-菌及真菌等均有明顯的抑制作用。將發(fā)酵液制成的產(chǎn)品應用于豬的飼料中，均有較好的飼養(yǎng)效果。該抗菌肽制品能夠代替抗生素，能夠預防消化道疾病、促進生長、增加體重，可以作為畜禽飼料添加劑。
文檔編號A23K1/17GK103205370SQ201210149859
公開日2013年7月17日 申請日期2012年5月15日 優(yōu)先權日2012年5月15日
發(fā)明者李本濤, 李帥偉 申請人:廣州格拉姆生物科技有限公司