專利名稱：一種提高蟲草素含量的蛹蟲草菌絲體的人工培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過錳離子脅迫提高蟲草素產(chǎn)量的蛹蟲草菌絲體的人工培養(yǎng)方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蟲草素(cordycepin，即3’ -脫氧腺苷)是一些蟲草屬真菌的特征性成分，也是蟲草屬真菌中最重要的活性成分之一。蟲草素有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗疲勞、調(diào)節(jié)心肺等功能。蟲草素作為一種新型的廣譜抗菌素，以其特有的抗菌抗病毒活性，它能抑制病毒的RNA合成；對枯草桿菌和鳥結(jié)核桿菌均有抑制作用；對HIV-I型病毒也有殺傷作用；尤其對多種實體惡性腫瘤有很強(qiáng)的抑制作用。蟲草素顯示出極好的藥學(xué)應(yīng)用前景，目前蟲草素的研究現(xiàn)正成為藥物化學(xué)中一個極其活躍的領(lǐng)域。蟲草素在冬蟲夏草中的含量極微，而一些其它的蟲草屬真菌如蛹蟲草、九州蟲草等，其蟲草素要高得多。所以當(dāng)前蟲草素產(chǎn)品一般是從蛹蟲草中提取獲得的。提高蟲草屬真菌的蟲草素含量的方法有兩類，一類是通過菌株的誘變育種等方式，提高原有菌種的蟲草素產(chǎn)量水平，如“一種生產(chǎn)蟲草素的方法及高產(chǎn)蛹蟲草菌株BYB -08的選育與應(yīng)用CN200810101715”，選育了一株高產(chǎn)菌株BYB — 08 ;“一種高含量蟲草素的北冬蟲夏草工業(yè)化培養(yǎng)方法CN200610117998”中，選育了菌株蛹蟲草C0B201、CGMCCNo. 1823，都比原來的出發(fā)菌株產(chǎn)量提高。另一類方法是通過培養(yǎng)條件優(yōu)化和培養(yǎng)過程中添加誘導(dǎo)物的方式提高蟲草素的產(chǎn)量。如“一種用于高蛹蟲草生物量和高蟲草素含量的發(fā)酵方法CN200910027839”中，通過培養(yǎng)過程中加入生物型誘導(dǎo)子炭角菌屬銀杏內(nèi)生真菌提取液，和非生物型誘導(dǎo)子乙酸鈉、硫酸銨，促進(jìn)菌體中蟲草素的產(chǎn)生。這些方式無論是誘變育種的方式還是內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子的方式提高蟲草素的含量，操作起來都比較麻煩，且蟲草素含量不是很高。申請人:在長期從事蟲草屬真菌的研究工作中，發(fā)現(xiàn)了蟲草屬真菌對于鋅離子、錳離子具有超強(qiáng)耐性和富集特性，在進(jìn)一步研究蟲草真菌對于鋅離子和錳離子的超強(qiáng)耐性和富集特性的生理生化機(jī)制的時候，發(fā)現(xiàn)較高濃度的錳離子對于蟲草素的產(chǎn)生具有誘導(dǎo)作用和促進(jìn)作用。這一發(fā)現(xiàn)在蟲草素的生產(chǎn)上有極好的應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)外關(guān)于通過錳離子脅迫提高蟲草素產(chǎn)量的人工培養(yǎng)方法還沒有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述已有技術(shù)的不足而提供了一種操作簡單、蟲草素含量高的一種通過錳離子脅迫提高蟲草素含量的蛹蟲草菌絲體的人工培養(yǎng)方法。本發(fā)明的目的可以通過如下措施來達(dá)到一種提高蟲草素含量的蛹蟲草菌絲體的人工培養(yǎng)方法，它包括以下步驟試管斜面菌種培養(yǎng)、試管液體菌種培養(yǎng)、三角瓶液體種子培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)，其特征在于所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)步驟中當(dāng)種子罐培養(yǎng)至菌絲體收得率0. 4-0. 8%時，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐培養(yǎng)，其培養(yǎng)基中按重量百分比含有1% — 9%的硫酸錳，溫度23°C 26°C，通氣I : 0.5，攪拌轉(zhuǎn)速120 rpnTl50 rpm，培養(yǎng)至菌絲體收得率I. 2-1. 8%，
培養(yǎng)基還原糖含量至多0. 2%時 ，放罐收獲。為了進(jìn)一步實行本發(fā)明的目的，所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基由葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、硫酸錳、水組成。為了進(jìn)一步實行本發(fā)明的目的，所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基由蔗糖、玉米漿、硫酸錳、水組成。為了進(jìn)一步實行本發(fā)明的目的，所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基由玉米粉、豆餅粉、硫酸錳、水組成。為了進(jìn)一步實行本發(fā)明的目的，所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基由蔗糖、魚粉、硫酸錳、水組成。本發(fā)明同已有技術(shù)相比可產(chǎn)生如下積極效果申請人基于對蛹蟲草菌絲體對錳離子富集機(jī)制的研究，了解到蛹蟲草菌絲體對錳離子有極強(qiáng)的富集能力，且發(fā)現(xiàn)在高濃度錳離子脅迫下，能提高菌絲體蟲草素的產(chǎn)量，且有最佳錳離子濃度范圍。采用本發(fā)明的培養(yǎng)方法，不僅簡單易行，且蟲草素產(chǎn)量高，比未加高濃度錳離子脅迫的菌絲體中蟲草素含量高出
0.8倍以上。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的具體實施方式
作詳細(xì)說明
實施例I :
菌種蛹蟲草菌種蛹蟲草5. 270，來源于廣東省微生物菌種保藏中心。試管斜面菌種培養(yǎng)(活化)(也可按照其他常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng))
配制培養(yǎng)基葡萄糖10_60g,蛋白胨I-IOg,酵母提取物I-IOg,硫酸鎂l_5g,磷酸二氫鉀l_5g，瓊脂粉15-20g，水890-971g，其pH值為5. 0-7. 0，分裝于試管中；將蛹蟲草菌種在無菌條件下接入試管斜面，15 30°C暗培養(yǎng)5 —10天；
試管液體菌種培養(yǎng)(也可按照其他常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng))
配制培養(yǎng)基葡萄糖10-60g,蛋白胨I-IOg,酵母提取物I-IOg,硫酸鎂l_5g,磷酸二氫鉀l_5g，水910-986g，其pH值為5. 0-7. 0，分裝于試管中，滅菌；接入活化后斜面菌種，15 30°C，攪拌轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)5天 10天；
進(jìn)行三角瓶液體種子培養(yǎng)(也可按照其他常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng))
配制培養(yǎng)基葡萄糖10_60g,蛋白胨I-IOg,酵母提取物I-IOg,硫酸鎂l_5g,磷酸二氫鉀l_5g，水910-986 g，其pH值為5.0-7. 0，將配制好的培養(yǎng)基分裝入500ml錐形瓶中，每瓶裝200ml，封口后在12(Tl30°C條件下滅菌18 30分鐘，取出培養(yǎng)基，5. 0-7. 0冷卻至20^300C ;在無菌條件下每瓶接入IOml — 20ml培養(yǎng)好的試管液體菌種，15 30°C，攪拌轉(zhuǎn)速120rpm,培養(yǎng)5天 10天；
種子罐培養(yǎng)(也可按照其他常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng))
配制培養(yǎng)基葡萄糖10_60g,蛋白胨I-IOg,酵母提取物I-IOg,硫酸鎂l_5g,磷酸二氫鉀l_5g，水910-986g，其pH值為5. 0-7. 0，分批滅菌，接入培養(yǎng)好的三角瓶液體菌種，投料體積60% — 80%，溫度15 30°C，通氣I : 0. 5，在100L種子罐中15 30°C培養(yǎng)2— 5天，并逐級擴(kuò)大至10噸罐中攪拌培養(yǎng)2— 5天；
發(fā)酵罐培養(yǎng)
當(dāng)種子罐培養(yǎng)至菌絲體收得率0. 4-0. 8%時，轉(zhuǎn)入50噸發(fā)酵罐培養(yǎng)，投料40噸，投料(培養(yǎng)基)為葡萄糖800-2000 kg，蛋白胨160-400 kg，酵母提取物160-400 kg，硫酸錳400 kg -3600kg，水余量，其pH值為5. 0-7.0，溫度23°C 26°C，通氣I 0.5，攪拌轉(zhuǎn)速120rpnTl50 rpm,培養(yǎng)至菌絲體收得率I. 2-1. 8%，培養(yǎng)基還原糖含量至多0. 2%時，放罐收獲。菌絲體中蟲草素含量達(dá)到2. 31mg/g，而未添加硫酸錳的條件下菌絲體中蟲草素含量達(dá)到
0.69mg/g，添加硫酸錳之后增加2. 3倍。實施例2:
菌種蛹蟲草菌種蛹蟲草5. 701，來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心。試管斜面菌種培養(yǎng)(活化)(也可按照其他常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng))
配制培養(yǎng)基葡萄糖10_60g,蛋白胨I-IOg,酵母提取物I-IOg,硫酸鎂l_5g,磷酸二氫鉀l_5g，瓊脂粉15-20g，水890-971g，其pH值為5. 0-7. 0，分裝于試管中；將蛹蟲草菌種在無菌條件下接入試管斜面，15KTC暗培養(yǎng)5 —10天；
試管液體菌種培養(yǎng)(也可按照其他常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng))
配制培養(yǎng)基葡萄糖10_60g,蛋白胨I-IOg,酵母提取物I-IOg,硫酸鎂l_5g,磷酸二氫鉀l_5g，水910-986g，其pH值為5. 0-7. 0，分裝于試管中，滅菌；接入活化后斜面菌種，15 30°C，攪拌轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)5天 10天；
三角瓶液體種子培養(yǎng)(也可按照其他常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng))
配制培養(yǎng)基葡萄糖10_60g,蛋白胨I-IOg,酵母提取物I-IOg,硫酸鎂l_5g,磷酸二氫鉀l_5g，水910-986 g，其pH值為5.0-7. 0，將配制好的培養(yǎng)基分裝入500ml錐形瓶中，每瓶裝200ml，封口后在12(Tl30°C條件下滅菌18 30分鐘，取出培養(yǎng)基，5. 0-7. 0冷卻至20^300C ;在無菌條件下每瓶接入IOml — 20ml培養(yǎng)好的試管液體菌種，15 30°C，攪拌轉(zhuǎn)速120rpm,培養(yǎng)5天 10天；
種子罐培養(yǎng)(也可按照其他常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng))
配制培養(yǎng)基葡萄糖10_60g,蛋白胨I-IOg,酵母提取物I-IOg,硫酸鎂l_5g,磷酸二氫鉀l_5g，水910-986g，其pH值為5. 0-7. 0，分批滅菌，接入培養(yǎng)好的三角瓶液體菌種，投料體積60% — 80%，溫度15 30°C，通氣I : 0.5，在100L種子罐中15 30°C培養(yǎng)2— 5天，并逐級擴(kuò)大至10噸罐中攪拌培養(yǎng)2— 5天；
發(fā)酵罐培養(yǎng)
當(dāng)種子罐培養(yǎng)至菌絲體收得率0. 4-0. 8%時，轉(zhuǎn)入50噸發(fā)酵罐培養(yǎng)。投料40噸，投料(培養(yǎng)基)為蔗糖800-2000 kg，魚粉200-400 kg，硫酸錳400 kg -3600kg，水余量，其pH值為5. 0-7.0，溫度23°C 26°C，通氣I : 0.5，攪拌轉(zhuǎn)速120 rpnTl50 rpm，培養(yǎng)至菌絲體收得率I. 2-1. 8%，培養(yǎng)基還原糖含量至多0. 2%時，放罐收獲。菌絲體中蟲草素含量達(dá)到
1.17mg/g，而未添加硫酸錳的條件下菌絲體中蟲草素含量達(dá)到0. 65mg/g，添加硫酸錳之后增加了 0.8倍。實施例3
菌種蛹蟲草菌種蛹蟲草5. 270，來源于廣東省微生物菌種保藏中心。試管斜面菌種培養(yǎng)(活化)(也可按照其他常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng))
配制培養(yǎng)基葡萄糖20g,蛋白胨6g,酵母提取物5g,硫酸鎂Ig,磷酸二氫鉀Ig,瓊脂粉 15g,水952g,其pH值為5. 0-7. 0,分裝于試管中；將蛹蟲草菌種在無菌條件下接入試管斜面，15 30°C暗培養(yǎng)5 —10天；試管液體菌種培養(yǎng)(也可按照其他常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)):
配制培養(yǎng)基葡萄糖10-60g,蛋白胨I-IOg,酵母提取物I-IOg,硫酸鎂l_5g,磷酸二氫鉀l_5g，水910-986g，其pH值為5. 0-7. 0，分裝于試管中，滅菌；接入活化后斜面菌種，15 30°C，攪拌轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)5天 10天；
三角瓶液體種子培養(yǎng)(也可按照其他常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng))
配制培養(yǎng)基葡萄糖10_60g,蛋白胨I-IOg,酵母提取物I-IOg,硫酸鎂l_5g,磷酸二氫鉀l_5g，水910-986g，其pH值為5. 0-7. 0，將配制好的培養(yǎng)基分裝入500ml錐形瓶中，每瓶裝200ml，封口后在12(Tl30°C條件下滅菌18 30分鐘，取出培養(yǎng)基，5. 0-7. 0冷卻至20^300C ;在無菌條件下每瓶接入IOml — 20ml培養(yǎng)好的試管液體菌種，15 30°C，攪拌轉(zhuǎn)速120rpm,培養(yǎng)5天 10天；
種子罐培養(yǎng)(也可按照其他常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng))
配制培養(yǎng)基葡萄糖10_60g,蛋白胨I-IOg,酵母提取物I-IOg,硫酸鎂l_5g,磷酸二氫鉀l_5g，水910-986g，其pH值為5. 0-7. 0，分批滅菌，接入培養(yǎng)好的三角瓶液體菌種，投料體積60% — 80%，溫度15 30°C，通氣I : 0.5，在100L種子罐中15 30°C培養(yǎng)2— 5天，并逐級擴(kuò)大至10噸罐中攪拌培養(yǎng)2— 5天；
發(fā)酵罐培養(yǎng)
當(dāng)種子罐培養(yǎng)至菌絲體收得率0. 4-0. 8%時，轉(zhuǎn)入50噸發(fā)酵罐培養(yǎng)。投料40噸，投料(培養(yǎng)基)為蔗糖800-2000 kg，玉米漿200-1000 kg，硫酸錳400 kg -3600kg，水余量，其pH值為5. 0-7.0，溫度23°C 26°C，通氣I : 0.5，攪拌轉(zhuǎn)速120 rpnTl50 rpm，，培養(yǎng)至菌絲體收得率I. 2-1. 8%，培養(yǎng)基還原糖含量至多0. 2%時，放罐收獲。菌絲體中蟲草素含量達(dá)到
I.92mg/g，而未添加硫酸錳的條件下菌絲體中蟲草素含量達(dá)到0. 55mg/g，添加硫酸錳之后增加了 2. 50倍。實施例4
菌種蛹蟲草菌種蛹蟲草5. 270，來源于廣東省微生物菌種保藏中心。試管斜面菌種培養(yǎng)(活化)(也可按照其他常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng))
配制培養(yǎng)基葡萄糖10_60g,蛋白胨I-IOg,酵母提取物I-IOg,硫酸鎂l_5g,磷酸二氫鉀l_5g，瓊脂粉15-20g，水890-971g，其pH值為5. 0-7. 0，分裝于試管中；將蛹蟲草菌種在無菌條件下接入試管斜面，15 30°C暗培養(yǎng)5 —10天；
試管液體菌種培養(yǎng)(也可按照其他常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng))
配制培養(yǎng)基葡萄糖10-60g,蛋白胨I-IOg,酵母提取物I-IOg,硫酸鎂l_5g,磷酸二氫鉀l_5g，水910-986g，其pH值為5. 0-7. 0，分裝于試管中，滅菌；接入活化后斜面菌種，15 30°C，攪拌轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)5天 10天；
三角瓶液體種子培養(yǎng)(也可按照其他常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng))
配制培養(yǎng)基葡萄糖10_60g,蛋白胨I-IOg,酵母提取物I-IOg,硫酸鎂l_5g,磷酸二氫鉀l_5g，水910-986 g，其pH值為5.0-7. 0，將配制好的培養(yǎng)基分裝入500ml錐形瓶中，每瓶裝200ml，封口后在12(Tl30°C條件下滅菌18 30分鐘，取出培養(yǎng)基，5. 0-7. 0冷卻至20^300C ;在無菌條件下每瓶接入IOml — 20ml培養(yǎng)好的試管液體菌種，15 30°C，攪拌轉(zhuǎn)速120rpm,培養(yǎng)5天 10天；
種子罐培養(yǎng)(也可按照其他常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng))配制培養(yǎng)基葡萄糖10-60g,蛋白胨I-IOg,酵母提取物I-IOg,硫酸鎂l_5g,磷酸二氫鉀l_5g，水910-986g，其pH值為5. 0-7. 0，分批滅菌，接入培養(yǎng)好的三角瓶液體菌種，投料體積60% — 80%，溫度15 30°C，通氣I : 0.5，在100L種子罐中15 30°C培養(yǎng)2— 5天，并逐級擴(kuò)大至10噸罐中攪拌培養(yǎng)2— 5天；
發(fā)酵罐培養(yǎng)
當(dāng)種子罐培養(yǎng)至菌絲體收得率0. 4-0. 8%時，轉(zhuǎn)入50噸發(fā)酵罐培養(yǎng)，投料40噸，投料(培養(yǎng)基)為玉米粉800-2000 kg，豆餅粉200-400 kg，硫酸錳400 kg -3600kg，水余量，其pH值為5. 0-7. 0，溫度23°C 26°C，通氣I : 0.5，攪拌轉(zhuǎn)速120 rpm"150 rpm，培養(yǎng)至菌絲體收得率I. 2-1. 8%，培養(yǎng)基還原糖 含量至多0. 2%時，放罐收獲。菌絲體中蟲草素含量達(dá)到
2.32mg/g,而未添加硫酸錳的條件下菌絲體中蟲草素含量達(dá)到0. 67mg/g,添加硫酸錳之后增加了 2. 46倍。
權(quán)利要求
1.一種提高蟲草素含量的蛹蟲草菌絲體的人工培養(yǎng)方法，它包括以下步驟試管斜面菌種培養(yǎng)、試管液體菌種培養(yǎng)、三角瓶液體種子培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)，其特征在于所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)步驟中當(dāng)種子罐培養(yǎng)至菌絲體收得率O. 4-0. 8%時，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐培養(yǎng)，其培養(yǎng)基中按重量百分比含有1%—9%的硫酸錳，溫度23 °C 26°C，通氣I : O. 5，攪拌轉(zhuǎn)速120rpnTl50 rpm，培養(yǎng)至菌絲體收得率I. 2-1. 8%，培養(yǎng)基還原糖含量至多O. 2%時，放罐收獲。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種提高蟲草素含量的蛹蟲草菌絲體的人工培養(yǎng)方法，其特征在于所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基由葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、硫酸錳、水組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種提高蟲草素含量的蛹蟲草菌絲體的人工培養(yǎng)方法，其特征在于所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基由蔗糖、玉米漿、硫酸錳、水組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種提高蟲草素含量的蛹蟲草菌絲體的人工培養(yǎng)方法，其特征在于所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基由玉米粉、豆餅粉、硫酸錳、水組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種提高蟲草素含量的蛹蟲草菌絲體的人工培養(yǎng)方法，其特征在于所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基由蔗糖、魚粉、硫酸錳、水組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高蟲草素含量的蛹蟲草菌絲體的人工培養(yǎng)方法，它包括試管斜面菌種培養(yǎng)、試管液體菌種培養(yǎng)、三角瓶液體種子培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)，其特征在于所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)步驟中當(dāng)種子罐培養(yǎng)至菌絲體收得率0.4-0.8%時，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐培養(yǎng)，其培養(yǎng)基中按重量百分比含有1%—9%的硫酸錳，溫度23℃~26℃，通氣1∶0.5，攪拌轉(zhuǎn)速120rpm~150rpm，培養(yǎng)至菌絲體收得率1.2-1.8%，培養(yǎng)基還原糖含量至多0.2%時，放罐收獲，本發(fā)明通過錳離子的脅迫作用，蛹蟲草菌絲體中蟲草素含量比未添加硫酸錳的對照培養(yǎng)基增加0.8倍以上，為蟲草素產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了增加產(chǎn)量的有效方法，有著廣闊的市場前景。
文檔編號A01G1/04GK102630490SQ20121011578
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月19日
發(fā)明者劉林德, 劉靜, 左言美, 李維煥, 程顯好 申請人:魯東大學(xué)