專利名稱：一種馬蹄種苗培植的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及作物育種技術領域，更具體地說，涉及ー種馬蹄種苗培植的方法。
背景技術：
馬蹄,學名荸莽(Eleocharis tuberos),屬單子葉莎草科,為多年生宿根性草本植物，食用部分為地下球莖，質脆甜多汁，營養(yǎng)豐富，可作水果也可作蔬菜。因其ロ感爽脆，其清熱解火的功效，深受消費者的喜愛，是國內外暢銷的食品，市場潛カ巨大?，F(xiàn)有技術中，國內栽培種植馬蹄種苗多采用以種果進行無性繁殖，以小果留種，育苗前不進行種果消毒，忽視了馬蹄的提純復壯，使品種退化嚴重，主要表現(xiàn)為種苗種植后大果率低、產(chǎn)量低、抗病能力差。而且，在日益増加的需求量面前，傳統(tǒng)的以種果進行無性繁殖時繁殖系數(shù)低，獲得大量種苗時需要耗費大量種果進行培植，生產(chǎn)成本高。因此需要一種新的馬蹄種苗培植的方法，能夠對馬蹄種苗復壯，用于培植能得到大果率高，產(chǎn)量高，且抗病能力強的脫毒種苗，同時能提高繁殖系數(shù)，減少種果使用量，降低成本。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供ー種馬蹄種苗培植的方法，g在解決現(xiàn)有技術馬蹄種苗大果率低、產(chǎn)量低、抗病能力差，以及繁殖系數(shù)低、成本高的問題。為了實現(xiàn)發(fā)明目的，ー種馬蹄種苗培植的方法包括以下步驟A.對優(yōu)質馬蹄種果進行無菌處理得到無菌培養(yǎng)物，并對無菌培養(yǎng)物進行小芽誘導將優(yōu)質馬蹄種果以水洗凈，以0. 2% 0. 4%的高錳酸鉀溶液浸泡15min ;放進恒溫箱中以20°C 25°C進行培養(yǎng)，直到芽體尖端露白；切取馬蹄芽體，剝去芽體外包葉鞘直至芽體中的節(jié)清晰可見；用洗衣粉浸泡芽體15min，以清水洗浄；超凈無菌條件下以75%的酒精浸泡芽體30s，然后以0. I %的氯化汞溶液(內含0.01% Tween80)浸泡10 15min，以無菌水沖洗數(shù)次，吸干芽體所含水分；橫切芽體節(jié)處，取芽體的上部分接種于小芽誘導培養(yǎng)基上，室溫無菌條件下避光培養(yǎng)24h，然后以1500 20001x的光照強度每天光照10 14h，得到小芽；B.對小芽進行分化與増殖培養(yǎng)，得到叢生芽將得到的小芽接種于分化與增殖培養(yǎng)基中，室溫無菌條件下以1500 20001x的光照強度，每天光照10 14h培養(yǎng)40 60天，得到叢生芽；C.對叢生芽進行生根培養(yǎng)，得到無菌種苗將得到的叢生芽接種到生根培養(yǎng)基中，室溫下以1500 20001x的光照強度條件，每天光照10 14h培養(yǎng)7 21天，得到長出根系的無菌種苗；D.對無菌種苗進行煉苗培育和馴化栽培，得到用于種植的脫毒種苗選擇根系發(fā)達且生長健壯的無菌種苗，保持濕潤環(huán)境下進行I 3天的煉苗培養(yǎng)，然后轉移至試驗田進行馴化栽培，避光培養(yǎng)14 40天，得到用于種植的脫毒種苗。其中，步驟A中所述的小芽誘導培養(yǎng)基成份是基礎培養(yǎng)基中加入糖類24 32g/L，瓊脂4 8g/L，并加入I 3. Omg/L的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)，所述小芽誘導培養(yǎng)基滅菌前的酸堿值調節(jié)為5. 8 6. 5。 其中，步驟B中所述的分化與増殖培養(yǎng)基的成份是基礎培養(yǎng)基中加入糖類24 32g/L，瓊脂4 8g/L，并加入I 3. Omg/L的6-BA及0. lmg/L的萘こ酸(NAA)或者是加入
I.5 2. 5mg/L的6-BA、0. lmg/L的NAA及0. 05mg/L的玉米素(ZT)，所述分化與增殖培養(yǎng)基滅菌前的酸堿值調節(jié)為5. 8 6. 5。其中，步驟C中所述的生根培養(yǎng)基的成份是基礎培養(yǎng)基中加入糖類24 32g/L，瓊脂4 8g/L，并加入0. I 0. 3mg/L的NAA，I 2g/L的活性炭，所述生根培養(yǎng)基滅菌前的酸堿值調節(jié)為5. 8 6. 5。進ー步的，上述不同培養(yǎng)基中所述糖類包括蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖和白糖中的至少ー種。其中，上述不同培養(yǎng)基中所述基礎培養(yǎng)基包括MS、B5培養(yǎng)基中的至少ー種。其中，在步驟A之前還可以包括步驟AO.選取優(yōu)質的馬蹄種果選取果體豐碩飽滿、表面無蟲眼、底部圓整、芽體挺拔的馬蹄作為種果。其中，在步驟D之后還可以包括步驟E.將得到的脫毒種苗移植栽種到大田，進行生長管理，采收馬蹄。由上可知，本發(fā)明通過對優(yōu)質馬蹄種果的芽體進行無菌處理，依次接種于優(yōu)化的小芽誘導培養(yǎng)基、小芽分化與増殖培養(yǎng)基和叢生芽生根培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，從中選取根系發(fā)達且生長健壯的無菌種苗進行煉苗培植，從而達到了培植能得到大果率高，產(chǎn)量高且抗病能力強的優(yōu)選馬蹄脫毒種苗的目的；同時，通過對小芽的分化與増殖，提高了脫毒種苗的繁殖系數(shù)，從而可以減少種果的使用量，降低了成本。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下將結合具體實施例，對本發(fā)明進行進ー步詳細說明。本發(fā)明所記載馬蹄種苗培植的方法，對優(yōu)質馬蹄種果的芽體進行無菌處理，用以減少芽體所帯的病毒或病菌；然后再利用小芽誘導培養(yǎng)基對芽體進行誘導出小芽，將小芽接種于分化與増殖培養(yǎng)基中進行小芽的分化與増殖，得到叢生芽，用以提高其繁殖系數(shù)；對得到的叢生芽再接入到生根培養(yǎng)基中，進行根系催生，得到帶有根系的無菌種苗；選取根系發(fā)達且生長健壯的無菌種苗進行煉苗培養(yǎng)以及大田馴化栽培，然后得到可以用于種植的脫毒種苗。通過上述一系列的優(yōu)化培植，克服了傳統(tǒng)方法中品種不斷退化的缺陷，對馬蹄種苗進行復壯，培植能得到大果率高、產(chǎn)量高且抗病能力強的脫毒種苗，同時通過對小芽進行分化與増殖，得到不同代數(shù)的叢生芽，從而提高了種苗的繁殖系數(shù)，可以減少種果的使用量，降低成本。利用本發(fā)明所記載的馬蹄種苗培植的方法進行馬蹄良種育種，得到至少90%的脫毒種苗出苗率，移植大田的成活率可達到95%以上，大果率可達到65%以上；在使用相同種果量的前提下，產(chǎn)量可較傳統(tǒng)方法培植的馬蹄種苗得到的產(chǎn)量高24% ;進行小芽分化與增殖時，繁殖系數(shù)可達25 50，得到大量的脫毒種苗。本發(fā)明所記載了ー種馬蹄種苗培植的方法，所述方法包括以下具體步驟SI.對優(yōu)質馬蹄種果 進行無菌處理得到無菌培養(yǎng)物，并對無菌培養(yǎng)物進行小芽誘導將優(yōu)質馬蹄種果以水洗凈，以0. 2% 0. 4%的高錳酸鉀溶液浸泡15min ;放進恒溫箱中以20°C 25°C進行培養(yǎng)，直到芽體尖端露白；切取馬蹄芽體，剝去芽體外包葉鞘直至芽體中的節(jié)清晰可見；用洗衣粉浸泡芽體15min，以清水洗浄；超凈無菌條件下以75%的酒精浸泡芽體30s，然后以0. I %的氯化汞溶液(內含0.01% Tween80)浸泡10 15min，以無菌水沖洗數(shù)次，吸干芽體所含水分；橫切芽體節(jié)處，取芽體的上部分接種于小芽誘導培養(yǎng)基上，室溫無菌條件下避光培養(yǎng)24h，然后以1500 20001x的光照強度每天光照10 14h，得到小芽；S2.對小芽進行分化與増殖培養(yǎng)，得到叢生芽將得到的小芽接種于分化與增殖培養(yǎng)基中，室溫無菌條件下以1500 20001x的光照強度，每天光照10 14h培養(yǎng)40 60天，得到叢生芽；S3.對叢生芽進行生根培養(yǎng)，得到無菌種苗將得到的叢生芽接種到生根培養(yǎng)基中，室溫下以1500 20001x的光照強度條件，每天光照10 14h培養(yǎng)7 21天，得到長出根系的無菌種苗；S4.對無菌種苗進行煉苗培育和馴化栽培，得到用于種植的脫毒種苗選擇根系發(fā)達且生長健壯的無菌種苗，保持濕潤環(huán)境下進行I 3天的煉苗培養(yǎng)，然后轉移至試驗田進行馴化栽培，避光培養(yǎng)14 40天，得到用于種植的脫毒種苗。上述技術方案的優(yōu)勢在于，利用優(yōu)質馬蹄種果芽體的無菌處理，然后依次接種于小芽誘導培養(yǎng)基、分化與増殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，通過一系列優(yōu)化的培植進行種苗復壯，從而得到大果率高、產(chǎn)量高且抗病能力強的脫毒種苗；然后在分化與增殖階段，對小芽進行不同代數(shù)的分化與増殖，得到不同代數(shù)的叢生芽，提高種苗的繁殖系數(shù)，減少種果的使用量，降低了成本。需要說明的是從基因遺傳育種的角度出發(fā)，為使得到的種苗更多地繼承種果優(yōu)良的基因，因此在步驟SI之前可以先進行步驟SI，:選取那些果體豐碩飽滿、表面光滑無蟲眼、底部圓整且芽體挺拔的馬蹄作為優(yōu)質馬蹄種果，其中所述芽體指的是馬蹄果體上端能夠長出新芽的尖端部分。步驟SI中，以高錳酸鉀溶液對馬蹄種果進行浸泡，其中高錳酸鉀溶液的濃度范圍為0. 2% 0. 4%，優(yōu)選為0. 3%，在本步驟的ー個具體實施方案中，取高錳酸鉀溶液的濃度為0. 2%;在本步驟的另ー個具體實施方案中，取高錳酸鉀溶液的濃度為0. 4%;在本步驟的一個優(yōu)選實施方案中，取高錳酸鉀溶液的濃度為0. 3%。恒溫箱中的培育溫度控制在20°C 25°C，過低或過高都容易使芽體發(fā)芽受到抑制，降低種苗培育的速度，影響種苗培育的質量。步驟SI中的小芽誘導培養(yǎng)基，是ー種用于誘導馬蹄種果的芽體生長發(fā)出小芽的專屬營養(yǎng)培養(yǎng)基，其成份以基礎培養(yǎng)基為主，并在其中加入營養(yǎng)成份而形成。其中，所述的基礎培養(yǎng)基包括但不限于MS、B5培養(yǎng)基中的至少一種，本發(fā)明優(yōu)選MS培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，采用MS培養(yǎng)基作為小芽誘導培養(yǎng)基的基礎培養(yǎng)基；在本發(fā)明的ー個具體實施方案中，采用B5培養(yǎng)基小芽誘導培養(yǎng)基的作為基礎培養(yǎng)基。應當說明的是，上述具體實施方案只是本發(fā)明小芽誘導培養(yǎng)基中選用的基礎培養(yǎng)基的ー些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。小芽誘導培養(yǎng)基中所述營養(yǎng)成份包括糖類、瓊脂和激素6-BA。其中，糖類包括但不限于蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖和白糖中的至少ー種，本發(fā)明優(yōu)選蔗糖。進ー步的，加入的糖類濃度為24 35g/L，優(yōu)選為28 30g/L。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，在基礎培養(yǎng)基中加入30g/L的蔗糖；在本發(fā)明的ー個具體實施方案中，在基礎培養(yǎng)基中加入32g/L的麥芽糖；在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，在基礎培養(yǎng)基中加入28g/L的葡萄糖；在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，在基礎培養(yǎng)基中加入混合濃度為30g/L的葡萄糖與麥芽糖。應當說明的是，上述具體實施方案只是本發(fā)明小芽誘導培養(yǎng)基中糖類的ー些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。小芽誘導培養(yǎng)基中所含的瓊脂濃度范圍為4 8g/L,優(yōu)選為6g/L。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的瓊脂為6g/L ;在本發(fā)明的ー個具體實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的瓊脂為4g/L ;在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的瓊脂為8g/L。應當說明的是，上述具體實施方案僅是本發(fā)明中加入基礎培養(yǎng)基的瓊脂的ー些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。小芽誘導培養(yǎng)基中的6-BA濃度范圍為I 3. Omg/L，其中優(yōu)選為2. 0 2. 5mg/し更優(yōu)選為2. 5mg/L。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的6-BA濃度為
2.5mg/L ;在本發(fā)明的ー個具體實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的6-BA濃度為3. Omg/L ;在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的6-BA濃度為I. Omg/L ;在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的6-BA濃度為2. Omg/L。應當說明的是，上述具體實施方案只是本發(fā)明小芽誘導培養(yǎng)基中所含的6-BA濃度的ー些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。在基礎培養(yǎng)基中加入糖類、瓊脂與6-BA之后攪拌混勻，調節(jié)酸堿值(pH值)的范圍為5. 8 6. 5，優(yōu)選為pH6. 0，然后將調好pH值的小芽誘導培養(yǎng)基以0. 06MPa的條件下滅菌30分鐘即可得到無菌的小芽誘導培養(yǎng)基。步驟S2中，叢生芽是指小芽經(jīng)過分化與増殖之后得到的簇狀小芽，可用于分離進行進ー步的培植。而所述分化與増殖培養(yǎng)基是指用于對小芽進行分化與増殖作用的營養(yǎng)培養(yǎng)基。所述分化與増殖培養(yǎng)基，以基礎培養(yǎng)基為主，加入糖類、瓊脂，以及6-BA和NAA，或者是加入6-BA、NAA及ZT混合滅菌之后而形成。分化與增殖培養(yǎng)基中的基礎培養(yǎng)基包括但不限于MS、B5培養(yǎng)基中的至少ー種，本發(fā)明優(yōu)選MS培養(yǎng)基。分化與増殖培養(yǎng)基中加入的糖類包括但不限于蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖和白糖中的至少ー種，本發(fā)明優(yōu)選蔗糖。進ー步的，加入的糖類濃度為24 35g/L，優(yōu) 選為28 30g/L。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，在基礎培養(yǎng)基中加入30g/L的蔗糖；在本發(fā)明的ー個具體實施方案中，在基礎培養(yǎng)基中加入32g/L的麥芽糖；在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，在基礎培養(yǎng)基中加入28g/L的葡萄糖；在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，在基礎培養(yǎng)基中加入混合濃度為30g/L的葡萄糖與麥芽糖。應當說明的是，上述具體實施方案只是本發(fā)明分化與増殖培養(yǎng)基中糖類的ー些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。分化與增殖培養(yǎng)基中所含的瓊脂濃度范圍為4 8g/L，優(yōu)選為6g/L。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的瓊脂為6g/L ;在本發(fā)明的ー個具體實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的瓊脂為4g/L ;在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的瓊脂為8g/L。應當說明的是，上述具體實施方案僅是本發(fā)明分化與増殖培養(yǎng)基中加入基礎培養(yǎng)基的瓊脂濃度的ー些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。配制分化與增殖培養(yǎng)基時加入的激素組合為6-BA+NAA，或者是6-BA+NAA+ZT組合。在組合6-BA+NAA中，6-BA濃度范圍為I 3. Omg/L，其中優(yōu)選為2. 0 2. 5mg/L，更優(yōu)選為2. 5mg/L。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的6-BA濃度為2. 5mg/L ;在本發(fā)明的ー個具體實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的6-BA濃度為3. Omg/L ;在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的6-BA濃度為I. Omg/L ;在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的6-BA濃度為2. Omg/L。而NAA的濃度為0. lmg/L。在組合6-BA+NAA+ZT 中，6-BA 濃度范圍為 I. 5 2. 5mg/L, NAA 的濃度為 0. lmg/L,ZT 濃度為 0. 05mg/L。步驟S3中所述的生根培養(yǎng)基是一種用于培養(yǎng)芽體催使其長出根系的營養(yǎng)培養(yǎng)基，由基礎培養(yǎng)基中加入糖類、瓊脂、NAA及活性炭形成。其中，所述的基礎培養(yǎng)基包括但不限于MS、B5培養(yǎng)基中的至少ー種,本發(fā)明優(yōu)選MS培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，采用MS培養(yǎng)基作為生根培養(yǎng)基的基礎培養(yǎng)基；在本發(fā)明的ー個具體實施方案中，采用B5培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基的作為基礎培養(yǎng)基。應當說明的是，上述具體實施方案只是本發(fā)明生根培養(yǎng)基中選用的基礎培養(yǎng)基的ー些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。生根培養(yǎng)基中的糖類包括但不限于蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖和白糖中的至少ー種，本發(fā)明優(yōu)選蔗糖。進ー步的，加入的糖類濃度為24 35g/L，優(yōu)選為28 30g/L。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，在基礎培養(yǎng)基中加入30g/L的蔗糖；在本發(fā)明的ー個具體實施方案中，在基礎培養(yǎng)基中加入32g/L的麥芽糖；在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，在基礎培養(yǎng)基中加入28g/L的葡萄糖；在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，在基礎培養(yǎng)基中加入混合濃度為30g/L的葡萄糖與麥芽糖。應當說明的是，上述具體實施方案只是本發(fā)明生根培養(yǎng)基中糖類的ー些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。生根培養(yǎng)基中所含的瓊脂濃度范圍為4 8g/L，優(yōu)選為6g/L。在本發(fā)明的ー個優(yōu)選實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的瓊脂為6g/L;在本發(fā)明的ー個具體實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的瓊脂為4g/L ;在本發(fā)明的另ー個具體實施方案中，加入基礎培養(yǎng)基中的瓊脂為8g/L。應當說明的是，上述具體實施方案僅是本發(fā)明生根培養(yǎng)基中加入基礎培養(yǎng)基的瓊脂濃度的ー些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。其中，生根培養(yǎng)基中所含的NAA濃度范圍為0. I 0. 3mg/L，優(yōu)選為0. 2mg/L ;生根培養(yǎng)基中加入的活性炭濃度范圍為1 2g/L。為進ー步觀察和培植符合要求的脫毒種苗，在步驟S4之后還可以進行步驟S5 :將得到的脫毒種苗移植栽種到大田，進行生長管理，采收馬蹄。步驟S5中，需要對移植栽種的脫毒種苗進行抗病能力、長勢、產(chǎn)量和大果率進行進一歩的觀察以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計，然后根據(jù)統(tǒng)計的數(shù)據(jù)結果確定本發(fā)明所記載馬蹄種苗培植技術的可行性及優(yōu)越性。
為證明本發(fā)明所記載的馬蹄種苗培植方法的優(yōu)勢所在，本發(fā)明提供了ー個具體實施例加以比較說明。
本實施例以廣西壯族自治區(qū)賀州市的優(yōu)質馬蹄作為種果，利用本發(fā)明所記載的馬蹄種苗培植方法培植得到脫毒種苗，然后將脫毒種苗移植栽種到大田，對其生長以及產(chǎn)果狀況進行跟蹤記錄，具體實施如下—、選取優(yōu)質馬蹄作為種果選取果體豐碩飽滿、表面光滑無蟲眼、底部圓整、芽體挺拔的優(yōu)質馬蹄作為種果。ニ、對優(yōu)質馬蹄種果進行無菌處理得到無菌培養(yǎng)物，并對無菌培養(yǎng)物進行小芽誘導I、無菌處理得到無菌培養(yǎng)物將優(yōu)質馬蹄種果以水洗浄，以0. 3%的高錳酸鉀溶液浸泡15min ;放進恒溫箱中以25°C進行培養(yǎng)，直到芽體尖端露白；切取馬蹄芽體，剝去芽體外包葉鞘直至芽體中的節(jié)清晰可見；用洗衣粉浸泡芽體15min，以清水清洗5次；在超凈臺中以75%的酒精浸泡芽體30s，然后以0. 1%的氯化汞溶液(內含0.01%TWeen80)浸泡15min，以無菌水沖洗5次，吸干芽體所含水分；順著分節(jié)處橫切芽體，取芽體上部分作為無菌培養(yǎng)物。2、小芽誘導I)配制小芽誘導培養(yǎng)基以MS作為基礎培養(yǎng)基，加入蔗糖至濃度為30g/L、加入瓊脂至濃度為6g/L，加入6-BA至濃度為2. 5mg/L,配制小芽誘導培養(yǎng)基，混勻之后調節(jié)pH至
6.0，以0. 06MPa，30min的條件，利用高壓滅菌鍋對小芽誘導培養(yǎng)基進行滅菌。2)小芽誘導培養(yǎng)將滅菌的小芽誘導培養(yǎng)基分裝至錐形瓶中，每瓶20mL，得到小芽誘導培養(yǎng)瓶；將無菌培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)瓶中，每瓶5顆無菌培養(yǎng)物；接種好的培養(yǎng)瓶避光培養(yǎng)24h，然后以20001x的光照強度，每天光照12h，控制培養(yǎng)溫度為25°C。經(jīng)培養(yǎng)4天后，可見無菌培養(yǎng)物中小芽由白變綠；10天后小芽開始長大變長，原芽體切ロ處逐漸長出愈傷組織；2 3周后切ロ處就可看到有誘導分化的小芽，且分化的小芽芽體周圍出現(xiàn)褐色外包表皮。三、對小芽進行分化與増殖培養(yǎng)，得到叢生芽I、配制分化與増殖培養(yǎng)基MS為基礎培養(yǎng)基，加入蔗糖至濃度為30g/L、加入瓊脂至濃度為6g/L,加入6-BA至濃度為2. 5mg/L,加入NAA至濃度為0. lmg/L,混勻之后調至PH6. 0，然后將混合物放入高壓滅菌鍋中，0. 06MPa, 30min進行滅菌處理，滅菌結束后將分化與増殖培養(yǎng)基分裝至錐形培養(yǎng)瓶中，每瓶20mL，得到無菌的分化與増殖培養(yǎng)瓶。2、接種小芽，得到叢生芽在超凈臺中，將誘導分化的小芽外包表皮去除，然后將分化的小芽接種至制備好的分化與増殖培養(yǎng)基中，25°C，15001x光照強度下每天光照培養(yǎng)12h。分化與増殖培養(yǎng)2周時間，明顯可見小芽分化5 10顆小芽；此時可將小芽繼續(xù)接種到新的分化與増殖培養(yǎng)瓶中，進行傳代分化増殖，可連續(xù)傳代4次得到共5代的叢生芽，其繁殖系數(shù)可達到25 50。叢生芽繼續(xù)在分化與増殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)50天，叢生芽可轉化成叢生苗，高度在I 3cm，莖狀葉直徑0. 5 2cm。四、對叢生芽進行生根培養(yǎng)，得到無菌種苗I、配制生根培養(yǎng)基以MS作為基礎培養(yǎng)基，加入蔗糖至濃度為32g/L、加入瓊脂至濃度為6. Og/L,加入NAA至濃度為0. 2mg/L,再加入活性炭至濃度為2g/L，混勻之后調節(jié)pH值為6. 0，高壓滅菌鍋內以0. 06MPa, 30min進行滅菌，然后分裝至錐形培養(yǎng)瓶中，每瓶20mL，
得到生根培養(yǎng)瓶。2、叢生苗生根培養(yǎng)選擇生長良好的叢生苗接種到生根培養(yǎng)瓶中進行生根培養(yǎng)，每瓶接種8顆；25°C，20001x光照強度下每天光照12h培養(yǎng)一周，叢生苗基部長出根毛；10天后基部根毛長長至I 3cm，可作為無菌種苗；3周后無菌種苗根長為3 8cm，主根開始分化幼根與根毛，此時叢生苗長聞至5cm左右。五、對無菌種苗進行煉苗培育和馴化栽培，得到用于種植的脫毒種苗
待無菌種苗的根系基本布滿培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)基時，從培養(yǎng)室中選擇根系發(fā)達且生長健壯的無菌種苗取出，打開培養(yǎng)瓶的封蓋，以噴霧器保持種苗處于濕潤環(huán)境下，進行3天煉苗；之后將煉苗結束的無菌種苗移植到大棚或者是有遮陰的水田進行馴化栽培，按照常規(guī)的方法進行生長管理；移植一周后種苗進入生長期，成活率達到94%;移植五周可進行進一步的苗株分化，得到更多的種苗，此時稱為ニ段育苗；ニ段育苗之后再過四周得到用于種植的脫毒種六、脫毒種苗移植栽種到大田，進行生長管理，采收馬蹄將脫毒種苗移植栽種到大田中，一周后觀察移植栽種成活率達到96% ;移植成活后，每兩周施復合肥一次，封行前毎次60斤/畝，封行后毎次90斤每畝；待到馬蹄結果成熟后進行采收，并統(tǒng)計大果率以及畝產(chǎn)量。為使本發(fā)明所記載的技術方案優(yōu)勢更加明顯，在利用本發(fā)明所記載的馬蹄種苗培植方法進行種苗培植的同時，利用傳統(tǒng)的以馬蹄種果直接進行種苗培植的方法，進行相同面積的種苗種植，按照同樣的生產(chǎn)管理，進行馬蹄種植，采收果實并統(tǒng)計大果率和畝產(chǎn)量。對兩種培植方法的各項數(shù)據(jù)進行平均數(shù)據(jù)統(tǒng)計，包括出苗率、繁殖系數(shù)、移植成活率、畝產(chǎn)量和大果率。其中，以果重大于等于30g作為大果的標準進行計算。兩種培植方法得到的各項統(tǒng)計結果如表I所示表I.兩種培植方法各項統(tǒng)計結果
統(tǒng)計項目平均出苗率I繁殖系數(shù)平均移植成活率平均畝產(chǎn)量(kg) 平均大果率本發(fā)明方法 92%5095%310065%
傳統(tǒng)方法 83%1085%250050%從上表中統(tǒng)計數(shù)據(jù)可以看出，利用本發(fā)明所記載的馬蹄種苗培植方法得到的平均種苗出苗率要高于傳統(tǒng)方法約9個百分點；本發(fā)明所述方法繁殖系數(shù)遠高于傳統(tǒng)培植方法；大田移植時的平均移植成活率也遠高于傳統(tǒng)方法；3100kg的平均畝產(chǎn)量更是高于傳統(tǒng)培植方法的2500kg多達24% ;在大果的統(tǒng)計中，不論是絕對數(shù)量還是所占的比值都遠高于傳統(tǒng)培植方法得到的種苗。由此可知本發(fā)明所記載的馬蹄種苗培植方法能對馬蹄種苗進行復壯，培植能得到大果率高、產(chǎn)量高且抗病能力強的脫毒種苗，同時通過小芽的分化與増殖，大大提高了種苗的繁殖系數(shù)，減少了種果的使用量，可以降低成本。
應當說明的是，本發(fā)明典型的應用但不限于馬蹄種苗的培植，在其他類似的作物育種中也可以應用本發(fā)明所闡述的方法。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1.ー種馬蹄種苗培植的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 A.對優(yōu)質馬蹄種果進行無菌處理得到無菌培養(yǎng)物，并對無菌培養(yǎng)物進行小芽誘導 將優(yōu)質馬蹄種果以水洗凈，以0. 2% 0. 4%的高錳酸鉀溶液浸泡15min ;放進恒溫箱中以20°C 25°C進行培養(yǎng)，直到芽體尖端露白；切取馬蹄芽體，剝去芽體外包葉鞘直至芽體中的節(jié)清晰可見；用洗衣粉浸泡芽體15min，以清水洗浄；超凈無菌條件下以75%的酒精浸泡芽體30s，然后以0. I %的氯化汞溶液(內含0. 01% Tween80)浸泡10 15min，以無菌水沖洗數(shù)次，吸干芽體所含水分；橫切芽體節(jié)處，取芽體的上部分接種于小芽誘導培養(yǎng)基上，室溫無菌條件下避光培養(yǎng)24h，然后以1500 20001x的光照強度每天光照10 14h，得到小芽； B.對小芽進行分化與増殖培養(yǎng)，得到叢生芽 將得到的小芽接種于分化與增殖培養(yǎng)基中，室溫無菌條件下以1500 20001x的光照強度，每天光照10 14h培養(yǎng)40 60天，得到叢生芽； C.對叢生芽進行生根培養(yǎng)，得到無菌種苗 將得到的叢生芽接種到生根培養(yǎng)基中，室溫下以1500 20001x的光照強度條件，每天光照10 14h培養(yǎng)7 21天，得到長出根系的無菌種苗； D.對無菌種苗進行煉苗培育和馴化栽培，得到用于種植的脫毒種苗 選擇根系發(fā)達且生長健壯的無菌種苗，保持濕潤環(huán)境下進行I 3天的煉苗培養(yǎng)，然后轉移至試驗田進行馴化栽培，避光培養(yǎng)14 40天，得到用于種植的脫毒種苗。
2.根據(jù)權利要求I所述的馬蹄種苗培植的方法，其特征在干，步驟A中所述的小芽誘導培養(yǎng)基成份是基礎培養(yǎng)基中加入糖類24 32g/L，瓊脂4 8g/L，并加入I 3. Omg/L的6-BA，所述小芽誘導培養(yǎng)基滅菌前的酸堿值調節(jié)為5. 8 6. 5。
3.根據(jù)權利要求I所述的馬蹄種苗培植的方法，其特征在干，步驟B中所述的分化與增殖培養(yǎng)基的成份是基礎培養(yǎng)基中加入糖類24 32g/L，瓊脂4 8g/L，并加入I 3. Omg/L的 6-BA 及 0. lmg/L 的 NAA 或者是加入 I. 5 2. 5mg/L 的 6_BA、0. lmg/L 的 NAA 及 0. 05mg/L的ZT，所述分化與增殖培養(yǎng)基滅菌前的酸堿值調節(jié)為5. 8 6. 5。
4.根據(jù)權利要求I所述的馬蹄種苗培植的方法，其特征在于，步驟C中所述的生根培養(yǎng)基的成份是基礎培養(yǎng)基中加入糖類24 32g/L，瓊脂4 8g/L，并加入0. I 0. 3mg/L的NAA, I 2g/L的活性炭，所述生根培養(yǎng)基滅菌前的酸堿值調節(jié)為5. 8 6. 5。
5.根據(jù)權利要求2至4中的任一項所述的馬蹄種苗培植的方法，其特征在于，所述糖類包括蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖和白糖中的至少ー種。
6.根據(jù)權利要求5所述的馬蹄種苗培植的方法，其特征在于，所述基礎培養(yǎng)基包括MS、B5培養(yǎng)基中的至少ー種。
7.根據(jù)權利要求I所述的馬蹄種苗培植的方法，其特征在于，在步驟A之前還包括步驟 A0.選取優(yōu)質的馬蹄種果 選取果體豐碩飽滿、表面無蟲眼、底部圓整、芽體挺拔的馬蹄作為種果。
8.根據(jù)權利要求I所述的馬蹄種苗培植的方法，其特征在于，在步驟D之后還包括步驟 E.將得到的脫毒種苗移植栽種到大田，進行生長管理，采收馬蹄。
全文摘要
本發(fā)明涉及作物育種技術領域，提供了一種馬蹄脫毒種苗培植的方法。所述方法包括以下步驟對優(yōu)質馬蹄種果進行無菌處理得到無菌培養(yǎng)物，并對無菌培養(yǎng)物進行小芽誘導；對小芽進行分化與增殖培養(yǎng)，得到叢生芽；對叢生芽進行生根培養(yǎng)，得到無菌種苗；對無菌種苗進行煉苗培育和馴化栽培，得到用于種植的脫毒種苗。利用本發(fā)明所記載的馬蹄種苗培植的方法，能夠對馬蹄種苗復壯，用于培植能得到大果率高，產(chǎn)量高，且抗病能力強的脫毒種苗，同時能提高馬蹄種苗的繁殖系數(shù)，減少種果的使用量，降低成本。
文檔編號A01H4/00GK102613079SQ20121008460
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月18日 優(yōu)先權日2012年3月18日
發(fā)明者何子劍, 余炳鋒, 吳桂容, 曲芬霞, 林寧 申請人:吳桂容