專利名稱：利用孢子半組培法快速繁殖蜈蚣草的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)方法,更具體地涉及利用蜈蟻草vittata L.)孢子，通過半組培法進(jìn)行快速種苗繁殖的方法。
背景技術(shù)：
蜈蟻草vittata L.)是水龍骨目鳳尾蕨科鳳尾蕨屬的多年生草本植物, 在中國主要分布在秦嶺以南的熱帶、亞熱帶地區(qū)，生于路旁、石縫或石灰?guī)r山地，是鈣質(zhì)土或石灰?guī)r的指示植物。民間全草藥用，能祛風(fēng)、殺蟲、治疳瘡；也可盆栽供觀賞。自2001年發(fā)現(xiàn)蜈蚣草對(duì)砷具有先天耐性和超富集能力以來，其用于科學(xué)研究和修復(fù)水體或土壤重金屬污染方面的潛在價(jià)值已吸引了科學(xué)界、環(huán)保界和企業(yè)界人士的關(guān)注。蜈蚣草可以通過根莖、孢子和孢子體植株(外植體)多種方式繁殖。蜈蚣草孢子極小，抵御外界環(huán)境能力弱，因此自然條件下萌發(fā)率低，很難獲得大規(guī)模的植物材料。陳同斌等通過組織培養(yǎng)的方法繁殖蜈蚣草，具體包括蜈蚣草孢子經(jīng)過無菌培養(yǎng)獲得孢子體， 以此作為外殖體，在適當(dāng)?shù)募に貤l件下誘導(dǎo)愈傷組織，后續(xù)增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移栽等步驟。整個(gè)過程大概需要5-6個(gè)月，并且大多數(shù)步驟涉及到激素的運(yùn)用和無菌操作，使得短期內(nèi)通過組織培養(yǎng)方法獲得大量的種苗有相當(dāng)?shù)碾y度。如果依靠根莖進(jìn)行繁殖，繁殖系數(shù)低，要從野外獲得大量的根莖費(fèi)時(shí)費(fèi)力且難以保證存活率，不能滿足實(shí)際需求。蜈蚣草孢子小但數(shù)量龐大，攜帶方便且容易保存，但如何突破孢子萌發(fā)困難的瓶頸是迅速獲得大量蜈蚣草種苗的關(guān)鍵步驟。而目前，利用蜈蚣草孢子繁殖蜈蚣草的方法還很少，申請(qǐng)?zhí)枮?200510086732. 8的中國專利公開了一種利用蜈蚣草孢子進(jìn)行快速組培繁殖的方法，主要是采用特定的培養(yǎng)基來誘導(dǎo)蜈蚣草孢子出芽，發(fā)明發(fā)現(xiàn)采用不同的培養(yǎng)基時(shí)，會(huì)在較大程度上影響孢子植株產(chǎn)生率，當(dāng)采用MS培養(yǎng)基時(shí)，其產(chǎn)生率僅〈10%，效果不理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速繁殖蜈蚣草的方法，具體來說是利用孢子半組培法快速繁殖蜈蚣草的方法。該方法不受自然條件、地區(qū)差異或時(shí)間的限制，繁殖系數(shù)高且速度快，能大規(guī)?？焖俜敝瞅隍疾莘N苗用于砷污染土壤的修復(fù)和其它觀賞性用途。發(fā)明將蜈蚣草孢子消毒后，接種于MS基本培養(yǎng)基上，在合適的條件下進(jìn)行培養(yǎng)， 發(fā)現(xiàn)其可以形成極大量的配子體；配子體與適當(dāng)介質(zhì)混勻直接散播于土壤表面，在合適的培養(yǎng)條件下迅速形成大量的蜈蚣草種苗。發(fā)明首先將蜈蚣草孢子進(jìn)行無菌化處理后，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成配子體，將配子體播種于土壤中培養(yǎng)成為蜈蚣草幼苗，其中培養(yǎng)形成配子體的過程，是將無菌的蜈蚣草孢子接種于MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22 28°C，培養(yǎng)過程進(jìn)行定期光照，光照條件為光強(qiáng)度200(Γ2500 Ix,每天光照12 14小時(shí)，培養(yǎng)5 8天即形成配子體。其中將配子體培養(yǎng)成為蜈蚣草幼苗的過程為將配子體在MS培養(yǎng)基中浸泡O.5 1. 5小時(shí)，播種于土壤表面，并進(jìn)行表面覆膜，自然光照條件下培養(yǎng)3飛天。在該培養(yǎng)過程中每天噴水1-5次；培養(yǎng)溫度為22 25 °C，空氣濕度6(Γ80%。發(fā)明優(yōu)選采用以下方案進(jìn)行
O孢子無菌化處理
選擇成熟的蜈蚣草孢子，以O(shè). 1% HgCl2S消毒劑，消毒Γ8分鐘；或以5% NaClO為消毒劑，消毒8 12分鐘，而后均以無菌水沖洗4-8次，獲得無菌的的孢子懸濁液。2)蜈蚣草孢子的萌發(fā)(配子體(原葉體)的形成)
無菌的孢子懸濁液接種于MS基本培養(yǎng)基上(優(yōu)選1/2 MS),培養(yǎng)溫度22 28°C，光強(qiáng)度 2000^2500 lx，光照時(shí)間12 14小時(shí)/天。孢子萌發(fā)而后形成原葉體。若要獲得更大量的配子體，可將已形成的配子體轉(zhuǎn)接到新的MS培養(yǎng)基上。3)孢子體的形成
配子體在1/10 MS中分散O. 5^1. 5小時(shí)后，散播于土壤中，表面覆膜，并且每天噴水1-5 次(一般持續(xù)7天)。自然光照條件下培養(yǎng)，溫度22 25 °C，空氣濕度6(Γ80%。約一周后在原葉體上會(huì)有孢子體幼苗產(chǎn)生。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出效果
I)縮短蜈蚣草繁殖周期和簡(jiǎn)化了操作步驟，成活率高。本發(fā)明的半組培方法既突破了蜈蚣草繁殖時(shí)孢子萌發(fā)慢及萌發(fā)率低的問題，又簡(jiǎn)化了使用植株作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)激素誘導(dǎo)、移栽、煉苗等繁瑣工序，僅孢子形成配子體這一步需要在一般無菌室內(nèi)操作，其余步驟均在正常條件下進(jìn)行，因此可簡(jiǎn)便、快速、 大量繁殖As超富集植物蜈蚣草。利用優(yōu)化方案僅Γ2個(gè)月就能繁育出大量種苗，移栽時(shí)由于其生活條件改變不大，成活率大于90%。2)繁殖系數(shù)大幅提高。利用優(yōu)化的組培條件，孢子在一周內(nèi)即可在培養(yǎng)基上萌發(fā)，并且萌發(fā)率達(dá)70%以上。3-4周就可形成配子體，如需要進(jìn)一步擴(kuò)大配子體，僅需將少量配子體轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上，即可在1-2周形成大量的配子體，增殖系數(shù)超過100。配子體散播到土壤中后，在適當(dāng)?shù)墓庹蘸退輻l件下，1-2周內(nèi)即有超過50%的配子體會(huì)形成孢子體幼苗(孢子體植株)。
具體實(shí)施例方式以下通過具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例I蜈蚣草孢子無菌化處理
取成熟的蜈蚣草孢子，以O(shè). 1% HgCl2為消毒劑，消毒1、2、4、6、8分鐘；和以5% NaClO 為消毒劑，消毒3、6、8、10、12分鐘，而后均以無菌水沖洗4-8次，獲得無菌的的孢子懸濁液。將上述處理下的無菌孢子懸濁液接種于MS基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度2(T25 °C，光強(qiáng)度 1500^3000 lx，光照時(shí)間12 14小時(shí)/天，14天后觀察每個(gè)處理的染菌情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 以O(shè). 1% HgCl2消毒4-8分鐘或以5% NaClO消毒8_12分鐘，染菌率均低于20%。當(dāng)以O(shè). 1% HgCl2消毒6分鐘或以5% NaClO消毒10分鐘，染菌比例最低，低于10%。實(shí)施例2蜈蚣草孢子的萌發(fā)
將以上述最優(yōu)條件滅菌過的蜈蚣草孢子，接種到不同比例的MS培養(yǎng)基(MS、1/2 MS、1/5 MSU/10 MS、無MS)，在不同的光強(qiáng)度(1000、1500、2000、2500、3000 Ix)和不同光照時(shí)間(8、10、12、14、16、18小時(shí)/天)下，14天后觀察每個(gè)處理的染菌情況和孢子萌發(fā)的情況。結(jié)果表明，這些培養(yǎng)基上3飛天均出現(xiàn)肉眼可見的綠色小點(diǎn)，表明孢子已經(jīng)萌發(fā)，不同培養(yǎng)條件下萌發(fā)率均達(dá)到90%以上(隨機(jī)在培養(yǎng)基上接種孢子30處，以5天內(nèi)培養(yǎng)基上出現(xiàn)綠點(diǎn)占總接種數(shù)的比例計(jì))，但光強(qiáng)度200(Γ2500 lx，光照時(shí)間12 14小時(shí)/天下萌發(fā)率較其它條件略高(表I)。在以上培養(yǎng)基上，兩周內(nèi)均出現(xiàn)配子體(原葉體)。無MS的所有光照培養(yǎng)條件下，配子體的增殖情況都很差。在1/2 MS培養(yǎng)基上，以及在光強(qiáng)度200(Γ2500 lx，光照時(shí)間12 14小時(shí)/天下，配子體的生長(zhǎng)狀況最好和增殖速度最快，增殖系數(shù)平均值達(dá)到105。 在不同的實(shí)驗(yàn)條件下接種同樣數(shù)量的配子體在培養(yǎng)基上，2周后通過接種前后重量的比較確定增殖系數(shù)，如表2所示
權(quán)利要求
1.利用孢子半組培法快速繁殖蜈蚣草的方法，將蜈蚣草孢子進(jìn)行無菌化處理后，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成配子體，將配子體播種于土壤中培養(yǎng)成為蜈蚣草幼苗，其特征在于所述的培養(yǎng)形成配子體的過程，是將無菌的蜈蚣草孢子接種于1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22 28°C，培養(yǎng)過程進(jìn)行定期光照，光照條件為光強(qiáng)度200(Γ2500 Ix,每天光照12 14小時(shí)，培養(yǎng)51天即孢子萌發(fā)形成配子體。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的MS培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)成為蜈蚣草幼苗的過程為將配子體在1/10 MS培養(yǎng)基中浸泡O. 5" . 5小時(shí),播種于土壤表面,并進(jìn)行表面覆膜，自然光照條件下培養(yǎng)3飛天。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的MS培養(yǎng)基為1/10MS培養(yǎng)基。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)過程中每天噴水1-5次。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)溫度為22 2 5 °C，空氣濕度 60 80%。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的無菌化處理是以0.1%HgCl2為消毒劑，消毒4、分鐘。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的無菌化處理以5%NaClO為消毒劑，消毒8 12分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用孢子半組培法快速繁殖蜈蚣草的方法，將蜈蚣草孢子進(jìn)行無菌化處理后，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成配子體，將配子體播種于土壤中培養(yǎng)成為蜈蚣草幼苗；培養(yǎng)形成配子體的過程，是將無菌的蜈蚣草孢子接種于1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22~28℃，培養(yǎng)過程進(jìn)行定期光照，光照條件為光強(qiáng)度2000~2500lx，每天光照12~14小時(shí)，培養(yǎng)5~8天即孢子萌發(fā)形成配子體；將配子體培養(yǎng)成為蜈蚣草幼苗的過程為將配子體在1/10MS培養(yǎng)基中浸泡0.5-1.5小時(shí)，播種于土壤表面，并進(jìn)行表面覆膜，自然光照條件下培養(yǎng)3~5天。本發(fā)明的培養(yǎng)方法可以縮短蜈蚣草繁殖周期和簡(jiǎn)化了操作步驟，成活率高，并且繁殖系數(shù)大幅提高。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102577971SQ201210061170
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月9日
發(fā)明者周密, 廖斌, 李金天, 束文圣, 楊兵 申請(qǐng)人:中山大學(xué)