專利名稱：一種快速獲得三倍體枇杷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速獲得三倍體枇杷的方法。
背景技術(shù)：
枇杷屬薔薇科(Rosaceae)枇杷屬(Mriobotrya)植物,原產(chǎn)我國(guó)，栽培品種為普通枇杷(E. 已有2100多年的栽培歷史(章恢志,彭抒昂，蔡禮鴻,等.中國(guó)枇杷屬種質(zhì)資源及普通枇杷起源研究.園藝學(xué)報(bào)，1990，(1):5 11;邱武陵，章恢志.中國(guó)果樹(shù)志 (龍眼、枇杷卷).北京中國(guó)林業(yè)出版社，1996 ;黃金松.枇杷栽培新技術(shù).福建福建科學(xué)技術(shù)出版社，2000)。我國(guó)枇杷資源豐富，分布區(qū)遍及北緯33.5°以南的19個(gè)省(直轄市、 自治區(qū))。枇杷秋萌冬花，春實(shí)夏熟，在百果中獨(dú)具先天四時(shí)之氣，被譽(yù)為獨(dú)冠時(shí)新的佳果珍味。枇杷成熟期正值水果淡季，且果肉柔軟多汁，營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味佳美，并具有化痰潤(rùn)肺之功效。枇杷全身都是寶，除供鮮食外，還可以制罐、果膏、果汁、果露及釀酒，深受人們喜愛(ài)。發(fā)展枇杷業(yè)對(duì)調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和增加農(nóng)民收入起著重要作用。隨著對(duì)枇杷深加工及其綜合利用的加強(qiáng)，其深度開(kāi)發(fā)意義深遠(yuǎn)。但由于枇杷果實(shí)種子較多，可食率相對(duì)較低，所以獲得無(wú)籽枇杷果實(shí)是人們夢(mèng)寐以求的愿望。尤其是近年來(lái)枇杷成為商品價(jià)值高的水果后，無(wú)籽果的生產(chǎn)要求愈來(lái)愈突出。它不僅可以增加可食率、提高果實(shí)的商品價(jià)值，還可以避免授粉受精不良或冬季低溫凍害而造成的減產(chǎn)。但是，枇杷所固有的基因高度雜合與童期長(zhǎng)等特點(diǎn)使常規(guī)育種方法受到較大限制，為此數(shù)十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)無(wú)籽枇杷的研究主要集中在采用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑來(lái)誘導(dǎo)枇杷的單性結(jié)實(shí)(丁長(zhǎng)奎，章恢志.植物激素對(duì)枇杷果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的影響.園藝學(xué)報(bào)，1988，15
(3):148 154; 丁長(zhǎng)奎，陳其峰，夏起洲，等.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)枇杷成熟期和品質(zhì)的影響.中國(guó)果樹(shù)，1989 (I) : 13 15 ;Chaudhary, A. S. Singh, M. Singh, C. N. Effect of plant growth regulatora on maturity of loquat iBriobotrya japonica Lindl). Progress Hort, 1990，22:184 190 ;Chaudhary, A. S. Singh, M. Singh, C. N. Effect of NAA , 2, 4, 5-T and GA on loquat cultivar iSafeda Batiaj . India J. Agr. Res., 1993，28:127 132 ;蔣際謀，鄭少泉.‘長(zhǎng)紅3號(hào)’枇杷噴布生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的效應(yīng).福建果樹(shù)， 1998 (2)13 14 ;張谷雄，康麗雪，高志紅，朱順蓮，高凱碧.GA和CPPU對(duì)枇杷無(wú)核果品質(zhì)的影響·果樹(shù)科學(xué)，1999，16 (1):55 59 ;Wu J, Lin S. Effect of naphthaleneacetic acid on fruit in iJie fang zhong’ loquat. Liacer G, Badenes M L. Serie A: Seminaires Mediterraneens, NO. 58, Option Mediterraneens. Zaragoza: Instituto Agronomico Mediterraneo de Zaragoza, 2003. 109 112 ;陳俊偉，馮健君，秦巧平，劉曉坤，吳江，謝鳴.GA3誘導(dǎo)的單性結(jié)實(shí)‘寧海白’白沙枇杷糖代謝的研究.園藝學(xué)報(bào)，2006， 33 (3) :471 476)。雖然人工合成的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在誘導(dǎo)西瓜(Citrullus vulgaris)、 番石槽(Psidium guajava)、番木瓜(Carica papaya)、油梨(Persea americana)、葡萄 (Vitis vinifera)、祀果(Mangifera indica)等產(chǎn)生無(wú)籽果實(shí)取得成功(Wong C Y(黃昌賢)·Induced parthenocarpy of watermelon, cucumber and pepper by the useof growth promoting substances . Proc. Am. Soc. Hort. Sci. 1938, 36:632 636 ；Luckwill L C.The hormones content of the seed in relation endosperm development and fruit drop in the apple. J Hort Sci, 1948，24:32 44 ;黃昌賢·番木瓜的單性結(jié)果和單性結(jié)子問(wèn)題.植物生理學(xué)通訊，1957 (2) 61 65 ；Crane J C. The chemical induction of parthenocarpy in the Calimyrna fig and its physiological significance. Plant Physiol, 1965，40:606 610),開(kāi)創(chuàng)了人工刺激單性結(jié)實(shí)的歷史,但在枇杷上誘導(dǎo)結(jié)實(shí)均不理想，無(wú)論在花前、花后不同時(shí)期噴布赤霉素或赤霉素結(jié)合其它生長(zhǎng)調(diào)劑物質(zhì)(NAA、BA、CPPU、MH)，其結(jié)果都只能得到細(xì)長(zhǎng)的無(wú)籽果實(shí)，或品質(zhì)不好有種子的果實(shí)，而且無(wú)籽果的獲得率低下，效果不穩(wěn)定，不具有商品價(jià)值(丁長(zhǎng)奎，章恢志.植物激素對(duì)枇杷果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的影響.園藝學(xué)報(bào)，1988，15 (3) :148 154;盛寶龍，吳偉民.無(wú)核枇杷生產(chǎn)技術(shù)研究.中國(guó)南方果樹(shù)，1998，27 (5) :3 6 ;張谷雄，康麗雪，高志紅，朱順蓮， 高凱碧.GA和CPPU對(duì)枇杷無(wú)核果品質(zhì)的影響.果樹(shù)科學(xué)，1999，16 (I) :55 59 ;張澤煌， 鄭少泉，劉友接，許秀淡，許家輝，蔡際謀，陳秀萍.無(wú)籽枇杷研究初報(bào).亞熱帶植物科學(xué)， 2002,31 (1):9 13 ;陳俊偉，馮健君，秦巧平，劉曉坤，吳江，謝鳴.GA3誘導(dǎo)的單性結(jié)實(shí)‘寧海白’白沙枇杷糖代謝的研究·園藝學(xué)報(bào)，2006,33 (3) :471 476)。要想獲無(wú)籽枇杷，最主要同時(shí)也是最有效的方法則是選育出三倍體，利用三倍體的特性獲得無(wú)籽枇杷果實(shí)和新品種。福建農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所于1978年用秋水仙素處理‘太城4號(hào)’枇杷，再結(jié)合6tlCo-Y射線進(jìn)行誘變，獲得四倍體枇杷‘閩3號(hào)’，在花期用GA 處理成功獲得了無(wú)籽枇杷果實(shí)(鄭少泉，許秀淡.枇杷輻射誘變育種研究I .枝條輻射的適宜劑量及性狀變異.中國(guó)南方果樹(shù)，1996，25 (3) :25 27)，雖然肉厚，可食率高，單核多，但產(chǎn)量低，很難直接在生產(chǎn)上應(yīng)用(鄭少泉，許秀淡，蔣際謀等.枇杷品種與優(yōu)質(zhì)高效栽培技術(shù)原色圖說(shuō).北京中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005:1 16)。我國(guó)學(xué)者已相繼在枇杷胚乳培養(yǎng)方面獲得了完整植株，經(jīng)檢查其根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為接近三倍體的非整倍體植株(陳振光，林順權(quán)，林慶良.枇杷胚乳培養(yǎng)獲得植株試驗(yàn)初報(bào).福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1983，12 (4) 343 345 ;林順權(quán).枇杷胚乳離體培養(yǎng)獲得植株的研究.福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1985，14 (2) 115 117;彭嘵軍，王永清.枇杷胚乳愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽發(fā)生的研究.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，20 (3) :189 192)。利用胚乳培養(yǎng)獲得三倍體植株是培養(yǎng)無(wú)籽枇杷的可能途徑，但至今仍未見(jiàn)其生長(zhǎng)結(jié)果的進(jìn)一步報(bào)道。最富成效的是日本農(nóng)業(yè)綜合研究中心暖地園藝石開(kāi)究所的Muranishi (Muranishi S. Effect of gibberellic acid (GA ) on the seedless fruiting of artificial polyploids in loquats (Briobotrya japonica Lind. L). Acta Horticulturae, 1982，137:343 347)與八幡茂木(八幡茂木.生產(chǎn)無(wú)核枇杷的新途徑一一利用三倍體.許建國(guó)譯.柑桔與亞熱帶果樹(shù)信息，1999，(6):32 33)，他們利用在葡萄等果樹(shù)上常用的三倍體技術(shù)，從上世紀(jì)80年代開(kāi)始，以千葉縣代表性同源四倍體品種 ‘田中’ (Tanaka)為母本，回交二倍體親本，從200個(gè)株系篩選出一個(gè)最優(yōu)株系‘希房’，但枇杷單性結(jié)實(shí)能力弱，無(wú)籽果實(shí)發(fā)育不良，三倍體幾乎都在開(kāi)花后脫落。因此必須結(jié)合激素的使用，才可獲得具商品價(jià)值的果實(shí)，此果實(shí)不會(huì)混雜有種子的果實(shí)，而且所用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度低，具有經(jīng)濟(jì)栽培價(jià)值。從而使日本在三倍體雜交育種方面處于世界領(lǐng)先地位。但雜交育種存在年限長(zhǎng)，需要有四倍體親本供體，同時(shí)該四倍體親本還要具有良好的育性，此外，該三倍體枇杷還存在一些不足首先是商品化率不高(只有60%左右)，其次與有籽果實(shí)相比，果實(shí)品質(zhì)還是欠佳，有待進(jìn)一步篩選親本材料以及結(jié)合相應(yīng)的栽培管理措施。國(guó)內(nèi)在這方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。綜上所述，目前已經(jīng)有學(xué)者嘗試?yán)萌扼w培育無(wú)籽枇杷果實(shí)或植株，但是其周期長(zhǎng)、數(shù)量少、效率低，而且果實(shí)品質(zhì)不佳，因此快速獲得三倍體枇杷的方法具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，但國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。發(fā)明目的
鑒于現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種快速獲得三倍體枇杷的方法，其最大的優(yōu)點(diǎn)就是快速、高效，能夠在短期內(nèi)獲得大量的三倍體枇杷植株，為無(wú)籽枇杷新品種的選育打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。1993年，在進(jìn)行“四川枇杷屬種質(zhì)資源調(diào)查與評(píng)價(jià)”研究時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)枇杷種子獨(dú)特的遺傳規(guī)律——高頻產(chǎn)生三倍體的現(xiàn)象。1997年本發(fā)明申請(qǐng)人對(duì)四川主要栽培品種進(jìn)行了染色體系統(tǒng)研究，又發(fā)掘出不同比率的天然三倍體，經(jīng)重復(fù)檢查，均屬純合三倍體，生長(zhǎng)正常。之后,本發(fā)明申請(qǐng)人開(kāi)始了大量生產(chǎn)三倍體枇杷的研究。本發(fā)明所述的一種快速獲得三倍體枇杷的方法，主要通過(guò)對(duì)枇杷種子進(jìn)行根尖染色體檢測(cè)從而篩選獲得三倍體，依次通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)
(1)收集枇杷種子，于20°c恒溫萌發(fā)催芽；
(2)待枇杷根長(zhǎng)至1-2厘米時(shí)，取根尖用濃度為O.002摩爾/升的8-羥基喹啉水溶液避光浸泡處理3小時(shí)，播種取了根尖的種子；
(3)處理后的根尖用卡諾氏固定液浸泡處理2-24小時(shí)，卡諾氏固定液為甲醇冰醋酸體積比=3:1的混合液；
(4)切取1-2毫米根尖，用蒸餾水清洗后，用濃度均為O.03克/毫升的纖維素酶與果膠酶混合酶液浸泡處理3小時(shí)；
(5)根尖用蒸餾水浸泡10分鐘，然后用卡諾氏固定液固定，卡諾氏固定液為甲醇冰醋酸體積比=3:1的混合液；
(6)將固定好的根尖均勻涂抹在載玻片上，用磷酸緩沖液(0.01克/毫升的磷酸氫二鈉溶液0. 01克/毫升的磷酸二氫鉀溶液體積比=6 4的混合液)稀釋的體積比濃度為5% 的Giemsa染色液染色，顯微鏡檢查染色體數(shù)目，確定根尖對(duì)應(yīng)的三倍體種子；
(7)將三倍體種子進(jìn)行常規(guī)栽培管理，即得到三倍體枇杷植株。


圖I為實(shí)生篩選獲得的天然三倍體枇杷幼苗及其體細(xì)胞染色體數(shù)目(2n=3x=51) 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)或積極效果
傳統(tǒng)的三倍體選育技術(shù)周期長(zhǎng)(要獲得三倍體枇杷，雜交育種一般至少6年)、效率低、 成本高、得到三倍體數(shù)量較少。利用本發(fā)明方法篩選得到的三倍體數(shù)量多，比例大，平均達(dá)到O. 406%,且不需要特殊的儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，容易掌握，工作效率較高，平均每人每天能夠檢測(cè)200-300顆種子，大大提高了枇杷三倍體育種的效率。該發(fā)明具有快速(當(dāng)天即可確定三倍體種子)、高效和一步獲得大量三倍體枇杷的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例現(xiàn)在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，利于達(dá)到最佳效果，但不是對(duì)本發(fā)明的限制， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的改良。(I)準(zhǔn)備河沙，用高壓滅菌鍋在121°C下高溫高壓消毒20分鐘，降溫至室溫備用；
(2)準(zhǔn)備帶透氣孔的塑料箱，將消毒后備用的河沙用清水拌濕，以用手捏沙能成團(tuán)但又不出水為宜，然后將拌好的河沙鋪在塑料箱中，整理松軟平整，厚度約為15-20厘米；
(3)收集枇杷種子，用清水洗凈，然后用100毫克/升的多菌靈溶液浸泡10分鐘，再用清水漂洗I 一 2次備用；
(4)將準(zhǔn)備好的種子逐粒播種于塑料箱中的河沙里，種臍朝下，播種深度為種子高度的三分之二，然后在上面加一層塑料沙網(wǎng)，再鋪上1-2厘米厚消毒備用的河沙，置于20°C的室內(nèi)，保濕萌發(fā)催芽；
(5)大約一周左右，種子開(kāi)始萌發(fā)長(zhǎng)出新根，當(dāng)根長(zhǎng)至1-2厘米時(shí)，用醫(yī)用鑷子夾取根尖部分(長(zhǎng)度約5毫米)，放入裝有濃度為O. 002摩爾/升的8-羥基喹啉水溶液的I. 5毫升離心管中，將夾取根尖的種子依次播種于裝有已消毒處理河沙的穴盤中，穴盤中的種子編號(hào)與離心管中根尖編號(hào)對(duì)應(yīng)，將裝有根尖的離心管置于20°C避光浸泡處理3小時(shí)；
(6)前一步處理時(shí)間達(dá)到3小時(shí)后，用膠頭滴管吸出離心管中的8-羥基喹啉溶液，加入新配制的卡諾氏固定液(甲醇冰醋酸體積比=3:1)處理2-24小時(shí)；
(7)待前一步處理結(jié)束，將固定液吸出，并用刀片切取根尖(長(zhǎng)度1-2毫米)放入I.5 毫升離心管中，用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)清洗2-3次，加入濃度均為O. 03克/毫升的纖維素酶與果膠酶混合酶液20微升處理3小時(shí)；
(8)待前一步處理結(jié)束，輕輕吸出酶液，保證根尖不散碎，用無(wú)菌蒸餾水浸泡根尖10分鐘，然后輕輕吸出蒸餾水，加入新鮮配制的卡諾氏固定液(甲醇冰醋酸體積比=3:1)；
(9)用尖嘴眼科鑷子輕輕夾出根尖，在載玻片上快速涂抹，直到根尖成細(xì)微糊狀，然后滴上少許卡諾氏固定液，向載玻片表面輕輕吹氣，迅速在酒精燈上烘烤1-2秒鐘；
(10)準(zhǔn)備干凈的玻璃板，放置兩根干凈直徑約I毫米的竹棍，將制備好的載玻片放于竹棍上，涂抹面朝下，加入用磷酸緩沖液(O. 01克/毫升的磷酸氫二鈉溶液0. 01克/毫升的磷酸二氫鉀溶液體積比=6 4)稀釋的體積比濃度為5%的Giemsa染色液染色5_10分鐘， 用自來(lái)水沖洗干凈，空氣晾干；
(10)根據(jù)所取根尖的編號(hào)，在載玻片上進(jìn)行標(biāo)記，然后利用顯微鏡檢查，統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目，鑒定篩選出所需要的三倍體個(gè)體；
(11)根據(jù)對(duì)應(yīng)的編號(hào)，找出三倍體種子，進(jìn)行常規(guī)栽培管理，從而獲得三倍體植株。1997-2007年，利用本發(fā)明方法對(duì)國(guó)內(nèi)22個(gè)主栽品種和日本引進(jìn)的5個(gè)品種的 63472粒種子進(jìn)行了檢測(cè)，成功獲得258株三倍體突變體，其平均頻率為O. 406% (如表I)。表I 27個(gè)枇杷品種的天然三倍體檢出頻率
權(quán)利要求
1.一種快速獲得三倍體枇杷的方法，其特征在于依次通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)收集枇杷種子，于20°c恒溫萌發(fā)催芽；(2)待枇杷根長(zhǎng)至1-2厘米時(shí)，取根尖用濃度為O.002摩爾/升的8-羥基喹啉水溶液避光浸泡處理3小時(shí)，播種取了根尖的種子；(3)處理后的根尖用卡諾氏固定液浸泡處理2-24小時(shí)，卡諾氏固定液為甲醇冰醋酸體積比=3:1的混合液；(4)切取1-2毫米根尖，用蒸餾水清洗后，用濃度均為O.03克/毫升的纖維素酶與果膠酶混合酶液浸泡處理3小時(shí)；(5)根尖用蒸餾水浸泡10分鐘，然后用卡諾氏固定液固定，卡諾氏固定液為甲醇冰醋酸體積比=3:1的混合液；(6)將固定好的根尖均勻涂抹在載玻片上，用磷酸緩沖液稀釋的體積比濃度為5%的 Giemsa染色液染色，顯微鏡檢查染色體數(shù)目，確定根尖對(duì)應(yīng)的三倍體種子；磷酸緩沖液為O.01克/毫升的磷酸氫二鈉溶液0. 01克/毫升的磷酸二氫鉀溶液體積比=6 4的混合液；(7)將三倍體種子進(jìn)行常規(guī)栽培管理，即得到三倍體枇杷植株。
全文摘要
一種快速獲得三倍體枇杷的方法，通過(guò)將枇杷種子催芽、取尖用8-羥基喹啉水溶液避光浸泡處理、卡諾氏固定液浸泡處理、纖維素酶與果膠酶混合酶液浸泡處理、卡諾氏固定液固定后，涂抹于載玻片上，顯微鏡檢查染色體數(shù)目，確定根尖對(duì)應(yīng)的三倍體種子。利用本發(fā)明方法篩選得到的三倍體數(shù)量多，比例大，平均達(dá)到0.406％，且不需要特殊的儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，容易掌握，工作效率較高，大大提高了枇杷三倍體育種的效率。該發(fā)明具有快速(當(dāng)天即可確定三倍體種子)、高效和一步獲得大量三倍體枇杷的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01H1/08GK102577940SQ20121005840
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月7日
發(fā)明者何橋, 向素瓊, 孫海燕, 李曉林, 李艷梅, 梁國(guó)魯, 汪衛(wèi)星, 郭啟高 申請(qǐng)人:西南大學(xué)