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蘆筍莖枯病苗期抗性鑒定方法

文檔序號(hào):203027閱讀:469來源:國(guó)知局
專利名稱:蘆筍莖枯病苗期抗性鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明專利涉及一種蘆筍莖枯病的苗期抗性鑒定的方法,該方法可以對(duì)1月齡的蘆筍苗進(jìn)行快速鑒定,具有簡(jiǎn)單,快捷,鑒定過程中各種條件容易控制等特點(diǎn),鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可信;主要應(yīng)用于蘆筍種質(zhì)資源和新品種選育過程中的抗病篩選。
背景技術(shù)
P筍{Asparagus officinalis Lirme)又稱石刁柏,百合科天門冬屬,是世界十大名菜之一,在國(guó)際市場(chǎng)上被稱為“蔬菜之王”。由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,并能潤(rùn)肺、鎮(zhèn)咳、祛痰, 具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥理功能,深受人們的喜愛。近年來,隨著蘆筍市場(chǎng)與栽培面積的擴(kuò)大,在生產(chǎn)上病害的發(fā)生也逐年增加,尤其莖枯病的嚴(yán)重發(fā)生已嚴(yán)重影響了蘆筍的產(chǎn)量與質(zhì)量。其病原菌為天門冬擬莖點(diǎn)霉D^offlOASi1S asparagi (Sacc. ) Bubak],是一種世界性分布的毀滅性病害,在中國(guó)、日本、泰國(guó)、印尼等亞洲蘆筍種植國(guó)家發(fā)生比較嚴(yán)重,歐美發(fā)生則比較少,只有零星報(bào)道。蘆筍莖枯病已發(fā)展成為我國(guó)蘆筍產(chǎn)業(yè)的限制性因子之一。初步鑒定,它是由真菌天冬擬莖點(diǎn)菌引發(fā)的莖部病害。在亞洲尤以中國(guó)發(fā)病最為嚴(yán)重,我國(guó)臺(tái)灣、廣東、廣西、福建、浙江、江西、江蘇、上海、安徽、湖北、四川、陜西、河南、山東、河北、遼寧、黑龍江等蘆筍生產(chǎn)省份均發(fā)生普遍,輕者生長(zhǎng)發(fā)育不良,降低產(chǎn)量與品質(zhì),重者病株提前枯死,全田毀滅,嚴(yán)重影響蘆筍生產(chǎn)與創(chuàng)匯。本專利旨在系統(tǒng)建立蘆筍莖枯病抗性鑒定方法,并用該方法篩選蘆筍抗病種質(zhì)資源。目前,國(guó)內(nèi)學(xué)者在蘆筍莖枯病的癥狀、病原、侵染循環(huán)、田間發(fā)生規(guī)律及防治方法等方面開展了不少的研究工作。蘆筍莖枯病癥狀研究已比較清楚,研究發(fā)現(xiàn)莖枯病主要發(fā)生在蘆筍莖枝上,有時(shí)也發(fā)生在擬葉上,但果實(shí)上未見病斑,重癥株地上枯死甚至根盤腐爛;在不同環(huán)境條件下,莖稈上可形成兩種不同類型的病斑一是急性型病斑,二是慢性型病斑,二者形態(tài)上有一定區(qū)別(苗華民,1991 ;康業(yè)斌等,1999)。病原菌的形態(tài)特征與生物學(xué)特性,研究報(bào)道不少,形態(tài)特征基本清楚,菌絲生長(zhǎng)條件明確,但莖枯病原菌鑒定結(jié)果尚存爭(zhēng)議,國(guó)內(nèi)大多認(rèn)為蘆筍莖枯病菌為天門冬擬莖點(diǎn)霉菌[/^ffiOASi1S asparagi (Sacc.) Bubak](劉克均等,1991 ;章月梅等,1996)。蘆筍莖枯病菌侵染循環(huán)研究表明,病菌主要主要以分生孢子器和分生孢子、菌絲體在田間病殘?bào)w重越冬,成活,適宜條件下進(jìn)行初次侵染,再次侵染(陳光宇,2005)。田間發(fā)生規(guī)律與流行因素基本闡明,不同生態(tài)區(qū)的蘆筍主產(chǎn)區(qū)有所不同,氣候條件、栽培條件、品種特性等是主要影響因素(葉曉輝等,2009)。病害防治技術(shù)研究(孫淑建等,2002 ;王政逸等,1995 ;盛全學(xué)等,2007 ;李術(shù)臣等,2009報(bào)道非常多,但比較零散,缺乏系統(tǒng)和全面的論述,主要以化學(xué)防治為主,開展了藥劑篩選與藥效試驗(yàn)(林佩力等,1995 ;胡翠鳳等,1996 ;施德等,1997 ;羅時(shí)華等,2003 ;徐玉恒等,2005 ;張金良等,2007)、拮抗菌篩選(陳福如等,1995 ;馬利平等,2008)、與對(duì)殺菌劑敏感性(鄭元梅等,1995;陳新建,1999)等試驗(yàn),農(nóng)業(yè)措施防治已為人們所接受,最近幾年興起設(shè)施栽培避雨防病和生物防治。而關(guān)于蘆筍莖枯病菌的侵染過程和致病生理生化機(jī)制、寄主的抗病機(jī)制尚未見有報(bào)道,在侵入和致病過程中,病菌分泌的角質(zhì)酶、纖維素酶和果膠酶及毒素等可能起重要作用,加強(qiáng)這些方面的研究將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)病害的本質(zhì)和抗病品種的選育,并在病害防治上取得更大成功。國(guó)外研究報(bào)道極少,1991年UECKER對(duì)蘆筍莖枯病菌的形態(tài)學(xué)及分類地位進(jìn)行了報(bào)道,2001年澳大利亞報(bào)道發(fā)生蘆筍莖枯病(DaViS,2001)。培育和利用抗性品種是植物病蟲害綜合防治中的最安全環(huán)保最為經(jīng)濟(jì)有效的措施和關(guān)鍵技術(shù),這也是今后蘆筍莖枯病綜合防治研究的發(fā)展方向和迫切需求。進(jìn)行蘆筍抗莖枯病育種,首先需要抗性種質(zhì)資源,探明寄主的抗性遺傳規(guī)律才有助于抗性性狀的遺傳改良。而蘆筍莖枯病的抗性鑒定方法國(guó)內(nèi)外尚無公開報(bào)道。本專利將系統(tǒng)建立蘆筍莖枯病苗期鑒定方法,并用該方法篩選蘆筍種質(zhì)資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立蘆筍莖枯病的苗期抗性鑒定方法,提供一種簡(jiǎn)便、有效、準(zhǔn)確的抗性鑒定方法。為了達(dá)到以上目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 1.分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的制定
制定了苗期接種的4級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)0級(jí)無發(fā)??;1級(jí)發(fā)病面積占株冠面積的10%以下;2級(jí)發(fā)病面積占株冠面積的11%_30% ;3級(jí)發(fā)病面積占株冠面積的31%-50% ;4級(jí)發(fā)病面積占株冠面積的50%以上。2.接種方法的篩選
以江西省農(nóng)科院創(chuàng)制的蘆筍品種作為供試材料,比較成菌絲塊基部接種法、菌絲塊中部接種法、菌絲塊中基部接種法、孢子噴霧法等4種接種方法的優(yōu)劣,選擇一種最為靈敏、 有效的方法,用于蘆筍抗性鑒定方法的建立。具體方法如下 (1)菌絲塊基部接種法
選擇1月齡的蘆筍幼苗10-20株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,將蘆筍幼苗缽置于50厘米長(zhǎng)30厘米寬的塑料盤平放,將5毫米直徑的菌絲塊放置到蘆筍莖的基部,噴無菌水保濕,并用保鮮膜覆蓋,25- !黑暗培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)到玻璃恒溫溫室25-28 !培養(yǎng),每天噴水3次,保持濕度, 6-10天后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(2)菌絲塊中部接種法
選擇1月齡的蘆筍幼苗10-20株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,將蘆筍幼苗缽置于50厘米長(zhǎng)30厘米寬的塑料盤平放,將5毫米直徑菌絲塊放置到蘆筍莖的中部,噴無菌水保濕,并用保鮮膜覆蓋,25- !黑暗培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)到玻璃恒溫溫室25-28 !培養(yǎng),每天噴水3次,保持濕度, 6-10天后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(3)菌絲塊中基部接種法
選擇1月齡的蘆筍幼苗10-20株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,將蘆筍幼苗缽置于50厘米長(zhǎng)30厘米寬的塑料盤平放,將5毫米直徑菌絲塊分別放置到蘆筍莖的中部和基部,噴無菌水保濕,并用保鮮膜覆蓋,25-28 !黑暗培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)到玻璃恒溫溫室25-28 °C培養(yǎng),每天噴水3次, 保持濕度,6-10天后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(4)孢子噴霧法
選擇1月齡的蘆筍幼苗10-20株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,配制10的6次方至10的7次方個(gè)蘆筍莖枯病菌強(qiáng)致病力菌株的孢子懸浮液,在配置好的孢子懸浮液中按每100毫升加5-10微升的比例加入吐溫-20后噴霧,黑暗保濕培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)到玻璃恒溫溫室25-28 °C培養(yǎng),每天噴水3次,保持濕度,6-10天后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌絲塊中基部接種法相對(duì)菌絲塊中部接種法和菌絲塊基部接種法發(fā)病略重,但相對(duì)孢子噴霧法發(fā)病較輕,且操作操作難度較大。孢子噴霧法操作簡(jiǎn)單,發(fā)病較為迅速,易根據(jù)造成病斑的長(zhǎng)度確定病級(jí)。因此,通過對(duì)4種接種方法的比較,本專利選擇孢子噴霧法用于蘆筍種質(zhì)資源的抗性鑒定。3.強(qiáng)致病力菌株的篩選
根據(jù)平常接種的發(fā)病情況,選擇來自江西的兩個(gè)菌株,來自福建的兩個(gè)菌株。用上述孢子噴霧法進(jìn)行接種,計(jì)算病情指數(shù),并比較其致病力,選擇一個(gè)致病力最強(qiáng)的菌株用于蘆筍莖枯病菌抗性鑒定方法的建立。每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù),用新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。 用孢子噴霧法接種8-10天和16-20天后分別調(diào)查發(fā)病情況,并計(jì)算病情指數(shù)。結(jié)果表明 不同菌株存在明顯的致病力分化,本專利選擇致病力最強(qiáng)的菌株用于苗期抗性鑒定方法的建立。4.孢子懸浮液濃度的確定
分別配制10的5次方個(gè)蘆筍莖枯病菌強(qiáng)致病力菌株的孢子每毫升、10的6次方個(gè)蘆筍莖枯病菌強(qiáng)致病力菌株的孢子每毫升、10的7次方個(gè)蘆筍莖枯病菌強(qiáng)致病力菌株的孢子每毫升的蘆筍莖枯病菌強(qiáng)致病力菌株的孢子懸浮液,分別用孢子噴霧法對(duì)江西省農(nóng)科院蔬菜花卉所創(chuàng)制的蘆筍品種進(jìn)行接種,在8-10天和16-20天后分別統(tǒng)計(jì)病級(jí)和計(jì)算病級(jí)指數(shù)。 結(jié)果表明當(dāng)孢子懸浮液濃度達(dá)到10的6次方個(gè)蘆筍莖枯病菌強(qiáng)致病力菌株的孢子每毫升后蘆筍莖枯病的病情指數(shù)幾乎達(dá)到穩(wěn)定,而10的6次方個(gè)蘆筍莖枯病菌強(qiáng)致病力菌株的孢子每毫升和10的7次方個(gè)蘆筍莖枯病菌強(qiáng)致病力菌株的孢子每毫升下的病情指數(shù)明顯高于10的5次方個(gè)蘆筍莖枯病菌強(qiáng)致病力菌株的孢子每毫升的濃度,說明10的6次方個(gè)蘆筍莖枯病菌強(qiáng)致病力菌株的孢子每毫升的濃度是蘆筍莖枯病孢子噴霧法接種的最佳濃度(圖 2)。5.抗性鑒定方法的驗(yàn)證
選擇5個(gè)田間抗感差異較明顯的蘆筍品種,用上述建立的方法進(jìn)行抗性鑒定。結(jié)果表明用本專利的鑒定結(jié)果與這5個(gè)品種的田間抗感表現(xiàn)相吻合,證明了本研究建立的抗性鑒定方法準(zhǔn)確、靈敏、可靠。6.成株期與苗期鑒定的一致性分析
5個(gè)蘆筍種質(zhì)資源的成株期鑒定結(jié)果表明,成株期鑒定結(jié)果與苗期鑒定一致。即蘆筍種質(zhì)資源的成株期與苗期鑒定結(jié)果基本一致。苗期鑒定在栽培時(shí)間、鑒定時(shí)間等方面存在優(yōu)勢(shì),因此本發(fā)明選擇在苗期用孢子噴霧法對(duì)蘆筍種質(zhì)資源進(jìn)行抗病篩選。7.蘆筍種質(zhì)資源的抗性鑒定
用本研究建立的苗期抗性鑒定方法對(duì)江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉所蘆筍創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供的31個(gè)蘆筍種質(zhì)資源進(jìn)行了抗性鑒定。在31個(gè)種質(zhì)資源中,野生天門冬的病情指數(shù)均為0,為免疫種質(zhì)資源;雜交一代TX-4/SD的病情指數(shù)較低為相對(duì)抗病品種,其次較抗病的是碩豐和 UC157 ;Pacific Peak, JG701,Patron,Jersey Giant 和 B3 的病情指數(shù)較高,為相對(duì)易感品種。


圖1.不同蘆筍莖枯病菌菌株致病力測(cè)定; 圖2.孢子懸浮液濃度對(duì)病情指數(shù)的影響; 圖3.田間抗感差異較顯著蘆筍種質(zhì)資源的抗病性鑒定; 圖4.蘆筍種質(zhì)資源的成株期鑒定。
具體實(shí)施例方式一種蘆筍莖枯病的苗期抗性鑒定的方法,按以下步驟實(shí)現(xiàn) (1)分生孢子的培養(yǎng)
將強(qiáng)致病力菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上活化,生長(zhǎng)6天后,用5毫米直徑的打孔器在菌落邊緣打孔,用接種針挑取菌絲塊接種到新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。將接有菌絲塊的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板置于黑光燈下,25 °C全天黑光燈誘導(dǎo)產(chǎn)孢培養(yǎng),共培養(yǎng)14天,使之產(chǎn)生分生孢子器。(2)孢子懸浮液的配制
將培養(yǎng)皿中的分生孢子器用載玻片刮下,用紗布包裹,置于8厘米直徑的玻璃研缽中, 加入30毫升無菌水,用研杵輕輕搗碎,使分生孢子釋放。三層紗布過濾后,用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子濃度,并加無菌水調(diào)節(jié)到需要的濃度。(3)孢子噴霧法接種
在配置好的孢子懸浮液中按每100毫升加5微升的比例加入吐溫-20,混勻后,用噴霧器均勻噴到各個(gè)處理的蘆筍幼苗上。25 °C黑暗保濕培養(yǎng)2天后,轉(zhuǎn)到玻璃溫室,25 °C覆膜培養(yǎng),并每天噴水3次,保持濕度。(4)結(jié)果調(diào)查與分析
分別在接種8天和16天后,按照本專利建立的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)病級(jí)兩次,并分別計(jì)算病情指數(shù),采用新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。(5)抗感品種的確定
根據(jù)本專利制定的抗感指標(biāo),根據(jù)各個(gè)品種的病情指數(shù),確定該品種是免疫、易感、抗病、中抗、感病五種類型中的哪一種。圖1.為不同蘆筍莖枯病菌菌株致病力測(cè)定,圖1中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值,采用新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析,圖上不同字母者表示在5%水平上差異極顯著。圖2為孢子懸浮液濃度對(duì)病情指數(shù)的影響,圖2中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值,采用新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析,圖上不同字母者表示在5%水平上差異極顯著
圖3為田間抗感差異較顯著蘆筍種質(zhì)資源的抗病性鑒定,圖3中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值,采用新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析,圖上不同字母者表示在5%水平上差異極顯
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者O圖4為蘆筍種質(zhì)資源的成株期鑒定,圖4中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值,采用新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析,圖上不同字母者表示在5%水平上差異極顯著。
權(quán)利要求
1. 一種蘆筍莖枯病的苗期抗性鑒定的方法,其特征在于按以下步驟,a、制定蘆筍幼苗接種的四級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下0級(jí)無發(fā)??;1級(jí)發(fā)病面積占株冠面積的10%以下;2級(jí)發(fā)病面積占株冠面積的11%_30% ;3級(jí)發(fā)病面積占株冠面積的31%-50% ;4級(jí)發(fā)病面積占株冠面積的50%以上;b、選擇1月齡的蘆筍幼苗10-20株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,配制10的6次方至10的7次方個(gè)蘆筍莖枯病菌強(qiáng)致病力菌株的孢子懸浮液,在配置好的孢子懸浮液中按每100毫升加5-10 微升的比例加入吐溫-20后噴霧,黑暗保濕培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)到玻璃恒溫溫室25-28 °C培養(yǎng),每天噴水3次,保持濕度,6-10天后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果;c、用孢子噴霧法接種8-10天和16-20天后分別調(diào)查發(fā)病情況,并計(jì)算病情指數(shù)。
全文摘要
一種蘆筍莖枯病的苗期抗性鑒定的方法,先制定蘆筍幼苗接種的四級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下0級(jí)無發(fā)??;1級(jí)發(fā)病面積占株冠面積的10%以下;2級(jí)發(fā)病面積占株冠面積的11%-30%;3級(jí)發(fā)病面積占株冠面積的31%-50%;4級(jí)發(fā)病面積占株冠面積的50%以上;再選擇1月齡的蘆筍幼苗10-20株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,配制10的6次方至10的7次方個(gè)蘆筍莖枯病菌強(qiáng)致病力菌株的孢子懸浮液,在配置好的孢子懸浮液中按每100毫升加5-10微升的比例加入吐溫-20后噴霧,黑暗保濕培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)到玻璃恒溫溫室25-28℃培養(yǎng),每天噴水3次,保持濕度,6-10天后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果;本發(fā)明選擇在苗期用孢子噴霧法對(duì)蘆筍種質(zhì)資源進(jìn)行抗病篩選,成株期鑒定結(jié)果與苗期鑒定一致,并具有在栽培時(shí)間、鑒定時(shí)間等方面存在優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)A01G31/00GK102523907SQ20121002983
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月10日
發(fā)明者蘭波, 孟凡, 李湘民, 楊迎青 申請(qǐng)人:江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
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