專利名稱：一種用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鮑的養(yǎng)殖活菌制劑，尤其是涉及一種主要用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉及其制備方法。
背景技術(shù)：
我國鮑養(yǎng)殖始于20世紀70年代后期，目前已成為世界第一鮑魚養(yǎng)殖大國，年產(chǎn)值達40多億元，成為我國海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重要組成部分。然而，伴隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，集約化程度的提高以及沿海水質(zhì)的日益惡化，鮑暴發(fā)性病害日益增多，特別是2000年以來， 以養(yǎng)成階段的季節(jié)轉(zhuǎn)換期暴發(fā)性死亡最為嚴重，在養(yǎng)鮑場密集的區(qū)域發(fā)病率高達90%以上，造成了慘重的經(jīng)濟損失。同時抗生素濫用造成生物的抗藥性，并引發(fā)了一系列環(huán)境和社會問題，使一度蓬勃發(fā)展的鮑養(yǎng)殖業(yè)陷入低谷，已成為制約養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素之一。鮑腸道益生菌可以針對養(yǎng)殖鮑過程中常見的腸胃病、細菌滋擾、不明原因產(chǎn)生的死亡及零星死亡，替代因抗生素引起的應(yīng)激反應(yīng)，在促進鮑魚生長，防治病害方面發(fā)揮重要作用。且由于益生菌具有無毒、無殘留、不產(chǎn)生抗藥性等特點，對促進鮑健康養(yǎng)殖具有重要意義。益生菌是一類活菌制劑，通過與病原菌競爭化學物質(zhì)和黏附位點，產(chǎn)生拈抗物質(zhì)或提供宿主必要營養(yǎng)物質(zhì)或酶，或調(diào)節(jié)并激活宿主免疫防御體系，或改善宿主腸道營養(yǎng)與菌群平衡從而對宿主產(chǎn)生有益的生理作用(Verschuere L et al, Microbiol Mol Biol Rev. 2000,64 :655-671)。目前，利用益生菌來調(diào)節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡，恢復(fù)機體正常生理功能、防治病害、促進生長，已逐漸成為世界范圍內(nèi)的熱潮。1986年，Kozasa等(Microbial Aliment Nutr, 1986,164 :351-358)首次利用芽抱桿菌(Bacillus toyoi)處理日本鰻鱺降低了由于感染愛德華氏菌而引起的死亡后，益生菌在水產(chǎn)研究方面得到迅速發(fā)展。但縱觀水產(chǎn)生物益生菌方面的研究報道，仍主要集中在魚類、甲殼類和雙殼類，而針對腹足類鮑的益生菌相對較少。目前，針對鮑養(yǎng)殖的益生菌及其制備存在以下幾個問題(I)多利用其它水生動物或水體中分離得到的益生菌應(yīng)用于鮑養(yǎng)殖中，而微生物具有宿主特異性及環(huán)境易感性，因此缺乏針對性和穩(wěn)定性而無法產(chǎn)生良好的效果。(2)篩選范圍有限，如集中在養(yǎng)殖環(huán)境，或直接應(yīng)用已報道的海洋細菌等，使益生菌菌種較為單一，它們在完全替代抗生素的過程中抗菌抗病毒效果并不理想。(3)由于宿主消化道酸性環(huán)境的滅活及消化酶的降解作用，大部分益生菌不能以活菌狀態(tài)到達腸道，或在腸道粘膜上定植，發(fā)揮有效的益生作用。(4)目前，水產(chǎn)生物養(yǎng)殖用的活菌制劑多為膠囊或液體或菌體干粉形式，應(yīng)用方式多直接投喂，或與飼料混合進行投喂。但存在鮑魚拒食、益生菌無法與飼料粘合不能進入宿主體內(nèi)發(fā)揮作用、益生菌外流至水體，使微生物數(shù)量激增造成養(yǎng)殖環(huán)境污染等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于針對現(xiàn)有養(yǎng)殖鮑益生菌應(yīng)用中存在的問題及不足，提供一種能夠有效、直接進入鮑腸道并發(fā)揮益生作用的用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉。本發(fā)明的另一目的在于提供一種具有操作簡單、效果穩(wěn)定、針對性強、不污染養(yǎng)殖環(huán)境等優(yōu)點的用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉的制備方法。所述用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉按質(zhì)量比的組成如下益生菌干粉瓊脂粉飼料為(0. I I) (I 20) (5 150)。所述飼料可選自鮑飼料，所述飼料可選自大統(tǒng)牌、金牌、洪峰牌等鮑用飼料。所述用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉的制備方法包括以下步驟I)分別將鮑腸道中分離的海洋細菌Phaeobacter sp. AP1220和芽孢桿菌 Bacillus stratosphericus A3440,經(jīng)培養(yǎng)基活化后,接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，使菌體濃度達到對數(shù)生長期0. 5 I. OX 109cfu/ml ；2)將各菌種發(fā)酵液混合后離心，棄上清，菌體沉淀洗滌，離心，滅菌，得菌泥；3)配制干粉保護劑；4)將干粉保護劑和菌泥混合，進行成膜反應(yīng)，然后，將混合物預(yù)凍，再冷凍干燥，制成具有包埋層的活性益生菌干粉；5)將益生菌干粉、瓊脂粉和飼料混合，制成用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉。在步驟I)中，所述海洋細菌Phaeobacter sp. AP1220已于2011年09月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏中心登記入冊編號=CGMCC No. 5254 ;所述芽孢桿菌 Bacillus stratosphericus A3440已于2011年09月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏中心登記入冊編號=CGMCC No. 5253 ;所述培養(yǎng)基可采用2216E固體培養(yǎng)基等；所述發(fā)酵培養(yǎng)基可采用2216E液體發(fā)酵培養(yǎng)基等；所述振蕩培養(yǎng)的條件可為在28°C下振蕩培養(yǎng) I 3天。在步驟2)中，所述洗滌可用生理鹽水洗滌2 3遍。在步驟3)中，所述干粉保護劑的組成按質(zhì)量百分比可為蔗糖1.0% 10.0%，褐藻酸鈉0. 1% 5. 0%,加水定容至IOOml ;所述滅菌的條件可為115°C,30min滅菌后,冷卻至 30 35°C。在步驟4)中，所述干粉保護劑和菌泥的配比可為干粉保護劑菌泥=(I 10) ml lg，其中干粉保護劑按體積計算，菌泥按質(zhì)量計算；所述成膜反應(yīng)可將干粉保護劑和菌泥混合放置10 30min后再進行成膜反應(yīng)；所述預(yù)凍的條件可為預(yù)凍于_70°C，3 4h。在步驟5)中，所述用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉按質(zhì)量比的組成如下益生菌干粉、瓊脂粉、飼料的質(zhì)量比為(0. I I) (I 20) (5 150);所述飼料可選自鮑飼料， 所述飼料可選自大統(tǒng)牌、金牌、洪峰牌等鮑用飼料。使用時，將用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉用水溶解，益生菌粉與水的比例可為5 30g 100ml，冷卻后凝固成膠體，即可。本發(fā)明的突出優(yōu)點是I)選自鮑消化道分離的微生物作為腸道益生菌的來源，具有較高的針對性和穩(wěn)定性，并能有效促進鮑的生長，與投喂常規(guī)飼料比較，鮑的生長率可提高19. 92% 25. 55%。2)與現(xiàn)有保護劑比較，本發(fā)明中的干粉保護劑(蔗糖與褐藻酸鈉)的添加能有效減少菌株在制備、運輸過程中數(shù)量減少，菌體流失等問題，與多種菌體保護劑相比的實驗結(jié)果見表I。表I不同保護劑下益生菌24h后活菌濃度
權(quán)利要求
1.一種用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉，其特征在于按質(zhì)量比的組成如下益生菌干粉 瓊脂粉飼料為(O. I I) (I 20) (5 150)。
2.如權(quán)利要求I所述的一種用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉，其特征在于所述飼料選自鮑飼料。
3.如權(quán)利要求I所述的一種用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)分別將鮑腸道中分離的海洋細菌Phaeobactersp. AP1220和芽孢桿菌Bacillus stratosphericus A3440,經(jīng)培養(yǎng)基活化后,接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，使菌體濃度達到對數(shù)生長期O. 5 I. 0X109cfu/ml ；2)將各菌種發(fā)酵液混合后離心，棄上清，菌體沉淀洗滌，離心，滅菌，得菌泥；3)配制干粉保護劑；4)將干粉保護劑和菌泥混合，進行成膜反應(yīng)，然后，將混合物預(yù)凍，再冷凍干燥，制成具有包埋層的活性益生菌干粉；5)將益生菌干粉、瓊脂粉和飼料混合，制成用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉。
4.如權(quán)利要求3所述的一種用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述海洋細菌Phaeobacter sp. AP1220已于2011年09月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號=CGMCC No. 5254 ;所述芽抱桿菌Bacillus stratosphericus A3440已于2011年09月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號=CGMCC No. 5253。
5.如權(quán)利要求3所述的一種用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述培養(yǎng)基采用2216E固體培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求3所述的一種用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基采用2216E液體發(fā)酵培養(yǎng)基；所述振蕩培養(yǎng)的條件可為在28°C下振蕩培養(yǎng)I 3天。
7.如權(quán)利要求3所述的一種用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述洗滌是用生理鹽水洗滌2 3遍。
8.如權(quán)利要求3所述的一種用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述干粉保護劑的組成按質(zhì)量百分比為蔗糖1.0% 10.0%，褐藻酸鈉O. 1% 5.0%，加水定容至IOOml ;所述滅菌的條件可為115°C，30min滅菌后，冷卻至30 35°C。
9.如權(quán)利要求3所述的一種用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述干粉保護劑和菌泥的配比為干粉保護劑菌泥=(I 10)ml lg，其中干粉保護劑按體積計算，菌泥按質(zhì)量計算；所述成膜反應(yīng)可將干粉保護劑和菌泥混合放置10 30min后再進行成膜反應(yīng)；所述預(yù)凍的條件可為預(yù)凍于_70°C，3 4h。
10.如權(quán)利要求3所述的一種用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉的制備方法，其特征在于在步驟5)中，所述用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉按質(zhì)量比的組成如下益生菌干粉、瓊脂粉、飼料的質(zhì)量比為(O. I I) (I 20) (5 150);所述飼料可選自鮑飼料。
全文摘要
一種用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉及其制備方法，涉及一種鮑的養(yǎng)殖活菌制劑。腸道益生菌粉由益生菌干粉、瓊脂粉和飼料組成。分別將鮑腸道中分離的海洋細菌Phaeobacter sp.AP1220和芽孢桿菌Bacillus stratosphericus A3440，經(jīng)培養(yǎng)基活化后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，使菌體濃度達到對數(shù)生長期0.5～1.0×109cfu/ml；將各菌種發(fā)酵液混合后離心棄上清，菌體沉淀洗滌離心滅菌得菌泥；配制干粉保護劑；將干粉保護劑和菌泥混合，進行成膜反應(yīng)，然后，將混合物預(yù)凍，再冷凍干燥，制成具有包埋層的活性益生菌干粉；將益生菌干粉、瓊脂粉和飼料混合，制成用于鮑養(yǎng)殖的腸道益生菌粉。
文檔編號A23K1/18GK102578402SQ20121001601
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者柯才煥, 蔣慶茹, 趙晶 申請人:廈門大學