專利名稱：蘑菇的液體種菌的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)蘑菇子實(shí)體的蘑菇液體種菌的生產(chǎn)方法、以及使用該液體種菌生產(chǎn)蘑菇子實(shí)體的方法。
背景技術(shù)：
近年來，已開發(fā)了蘑菇的人工栽培技術(shù)，從而提供各種蘑菇子實(shí)體(占地菇、荷葉菇、真姬菇、杏鮑菇、香菇、金針菇等)。通常，這樣對蘑菇進(jìn)行人工栽培通過將蘑菇的種菌接種于碎塊木或固體培養(yǎng)基中，經(jīng)由培養(yǎng)、生長等工序，收獲子實(shí)體。蘑菇的種菌包括使用鋸屑等培養(yǎng)基的固體種菌和使用液體培養(yǎng)基的液體種菌。近年來，在蘑菇的人工栽培中正在推進(jìn)機(jī)械化，例如，在大型設(shè)備的工廠系統(tǒng)中實(shí)施等。但是，為了商業(yè)上大量且穩(wěn)定地生產(chǎn)蘑菇子實(shí)體，需要大量培養(yǎng)所使用的種菌。目前，從蘑菇的種菌保存性良好且可容易運(yùn)輸?shù)壤碛煽紤]，可以使用固體種菌；但是從易于避免蘑菇子實(shí)體生產(chǎn)時(shí)的生產(chǎn)差異(其起因于固體種菌的批次差異)的風(fēng)險(xiǎn)、或有害菌·害蟲對設(shè)備的嚴(yán)重污染(其起因于接種固體種菌時(shí)溢出的種菌所引起的瓶或集裝箱的污染)等問題、能夠大幅縮短種菌的生產(chǎn)時(shí)間、且易于擴(kuò)大規(guī)模等方面考慮，液體種菌被認(rèn)為是有利的，其使用正在增加。作為用于大量培養(yǎng)液體種菌的方法，對液體深部培養(yǎng)法(其為用于從菌絲體得到有用成分的大量培養(yǎng)方法)進(jìn)行研究，為了嚴(yán)格地控制培養(yǎng)條件等，通用的是利用進(jìn)行機(jī)械攪拌、通氣、溫度管理的小型發(fā)酵罐來通氣攪拌的方法 (例如，非專利文獻(xiàn)1)。但是，為了以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)蘑菇子實(shí)體，需要設(shè)置大容量的包含小型發(fā)酵罐的高價(jià)且大規(guī)模的培養(yǎng)設(shè)備。[非專利文獻(xiàn)1]醌酵協(xié)會誌，第M卷，第7期，第四3_304頁，1966年

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題鑒于上述現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的在于提供一種在蘑菇子實(shí)體的大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)中廉價(jià)且有效地生產(chǎn)液體種菌的方法、以及使用該液體種菌生產(chǎn)蘑菇子實(shí)體的方法。本發(fā)明人對大量生產(chǎn)用于大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)的蘑菇液體種菌的方法進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，令人驚奇的是，在攪拌中使用氣泡的液體深部培養(yǎng)(無動力攪拌鼓氣泡)意外地也對用于生產(chǎn)蘑菇子實(shí)體的液體種菌的生產(chǎn)有用。另外發(fā)現(xiàn)，在該培養(yǎng)中，通過在液體培養(yǎng)基中含有低濃度的植物油，從而可以在具有蘑菇子實(shí)體形成能力的狀態(tài)下有效且穩(wěn)定地大量生產(chǎn)菌絲體。進(jìn)而，通過進(jìn)一步提高迄今為止在固體種菌中使用的菌床栽培用培養(yǎng)基的菌座，且使菌座表面均勻地平面化，從而可以進(jìn)行更穩(wěn)定的菌循環(huán)(菌廻)，可以有效地進(jìn)行由搔菌(菌+爸)所引起的發(fā)生誘導(dǎo)，與使用固體種菌的情況相比，可以生產(chǎn)優(yōu)良的蘑菇子實(shí)體，該蘑菇子實(shí)體均勻且商品價(jià)值高，而該生產(chǎn)方法包含種菌生產(chǎn)時(shí)間在內(nèi)的時(shí)間短，由此完成了本發(fā)明。本發(fā)明概述如下
[1] 一種蘑菇的液體種菌的生產(chǎn)方法，其為用于生產(chǎn)蘑菇子實(shí)體的蘑菇液體種菌的生產(chǎn)方法，其特征在于，在含有植物油的液體培養(yǎng)基中，通過使用氣泡攪拌培養(yǎng)基來對蘑菇的菌絲體進(jìn)行液體深部培養(yǎng)；[2]如[1]所述的生產(chǎn)方法，其中，基本上僅使用氣泡來攪拌培養(yǎng)基；[3]如[1]或[2]所述的生產(chǎn)方法，其中，所述植物油為選自色拉油、米糠油、菜籽油、紅花油、玉米油、橄欖油、芝麻油、大豆油及棉籽油中的1種或多種；[4]如[1] [3]中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法，其中，所述培養(yǎng)基中的植物油濃度為 0. 001 0. 1 體積 ％ ；[5] 一種蘑菇子實(shí)體的生產(chǎn)方法，其特征在于，使用通過[1] W]中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法所得到的蘑菇液體種菌；[6]如[5]所述的蘑菇子實(shí)體的生產(chǎn)方法，其為瓶栽法；[7]如[5]或[6]所述的蘑菇子實(shí)體的生產(chǎn)方法，其特征在于，使用菌座提高了的菌床栽培用培養(yǎng)基。[8]如[7]所述的蘑菇子實(shí)體的生產(chǎn)方法，其特征在于，使用菌座表面均勻平面化了的菌床栽培用培養(yǎng)基。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種用于蘑菇子實(shí)體的大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)的、在短時(shí)間內(nèi)廉價(jià)地大量生產(chǎn)蘑菇液體種菌的方法。另外，也可以提供一種使用該液體種菌生產(chǎn)蘑菇子實(shí)體的方法。


[圖1]是示出用于本發(fā)明生產(chǎn)方法的栽培瓶中菌座提高了的菌床栽培用培養(yǎng)基的菌座位置的圖。
具體實(shí)施例方式對于能夠用于本發(fā)明的“蘑菇”沒有特別的限定，可以列舉荷葉菇、占地菇、真姬菇、平菇、香菇、金針菇、滑菇、平菇、舞茸、杏鮑菇、姬松茸、鮑魚菇、黑耳平菇等食用蘑菇。 作為這些蘑菇的菌株，只要是可作為液體種菌進(jìn)行培養(yǎng)且可生產(chǎn)子實(shí)體的菌株即可，可以為市售的菌株，也可以為來自野生子實(shí)體的組織分離株，還可以為通過篩選、雜交、細(xì)胞融合、基因重組等方法進(jìn)行育種而得到的菌株。作為本發(fā)明的優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方式，可以舉出荷葉菇(Lyophyllum decastes)。作為荷葉菇，可以例示公知的菌株，例如，Lyophyllum decastes K-3303 株(FERM BP-4347)、Lyophyllum decastes K-3304 株(FERM BP-4348)、 Lyophyllum decastes K-3305 株(FERM BP-4349) > Lyophyllum decastes F-623 株(FERM P-13165)、Lyophyllum decastes F-1154 株(FERM P-13166)、Lyophyllum decastes F-1488株(FERM P-13167)及適于生產(chǎn)子實(shí)體的這些菌株的突變株等。另夕卜，作為本發(fā)明中優(yōu)選的本占地菇(Lyophyllum shimeji)的菌株的實(shí)例， 可以例示LyophylIum shimeji La 01-27 (FERM BP—10960)、Lyophyllum shimeji La 01-20 (FERM BP-10959)、Lyophyllum shimeji LaO 1-37 (FERM P-17456)、Lyophyllum shimeji La 01-45 (FERM P-17457)、Lyophyllum shimeji La 01-46 (FERM P-17458)及適于生產(chǎn)子實(shí)體的這些菌株的突變株等。此外，作為本發(fā)明中優(yōu)選的真姬菇的菌株，有表示為榆生離褶傘(Lyophyllum ulmarium)的菌株、表示為Hypsizygus marmoreus的菌株等，例如可以例示Lyophyllum ulmarium M-8171(FERM BP-1415) > Lyophyllum ulmarium K-0259(FERM P—12981)、 Lyophyllum ulmarium Lul-172 株(FERM BP-8354)、Lyophyllum ulmarium Lul-173 株 (FERM BP-8355)、LyophylIum ulmarium Lul-174株(FERM BP-8356)、LyophylIum ulmarium Lul-181^ (FERM BP-8357) >Hypsizygus marmoreus K-4975 (FERM BP-11321) >Hypsizygus marmoreus K-4979(FERM BP-11322)、Hypsizygus marmoreus K-4980(FERM BP-11323)、 Hypsizygus marmoreus K_4981(FERM BP-11324)及適于生產(chǎn)子實(shí)體的這些菌株的突變株寸。此外，作為本發(fā)明中優(yōu)選的黑耳平菇的菌株，可以例示=Pleurotus cystidiosus subsp. abalonus K-4986(FERM P-22064)、Pleurotus cystidiosus subsp.abalonus K-4987(FERM P-22065) >Pleurotus cystidiosus subsp. abalonus K-4988(FERM P-22066) 及適于生產(chǎn)子實(shí)體的這些菌株的突變株等。對上述菌株沒有任何限定，只要為可人工栽培的菌株、并且為可適用本發(fā)明的菌株即可。本申請說明書中，所謂“菌絲體”為上述蘑菇的菌絲體，對其沒有特別的限定，只要為可在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)、且可用作用于生產(chǎn)蘑菇子實(shí)體的液體種菌即可。本申請說明書中，所謂“使用氣泡的液體深部培養(yǎng)”是指通過在培養(yǎng)槽內(nèi)產(chǎn)生的氣泡來使培養(yǎng)液運(yùn)動(流動)，從而對培養(yǎng)基實(shí)施攪拌的培養(yǎng)方法。優(yōu)選基本上僅使用氣泡來對培養(yǎng)基進(jìn)行攪拌的培養(yǎng)方法，也可以包含通過攪拌器、螺旋槳形狀的鼓風(fēng)機(jī)之類的裝置進(jìn)行的機(jī)械攪拌，只要為不引起菌絲切斷的程度即可。特別優(yōu)選為不伴有機(jī)械性攪拌而僅使用氣泡來對培養(yǎng)基進(jìn)行攪拌的培養(yǎng)方法。對用于所述培養(yǎng)方法的培養(yǎng)槽而言，不需要用于攪拌或振蕩的使用機(jī)械動力的裝置，只要具備產(chǎn)生氣泡的裝置即可。本發(fā)明中，可以使用 (例如)文獻(xiàn)“日本応用t O 二學(xué)會誌，第8卷，第1期，第1-11頁Q000)”中記載的氣泡塔型培養(yǎng)裝置等，可以使用帶有可從底面及/或側(cè)面產(chǎn)生無菌氣泡那樣的裝置的培養(yǎng)槽。另外，也可以將可以產(chǎn)生氣泡的管子等直接加入到培養(yǎng)槽中。作為培養(yǎng)槽中的氣泡的通氣量， 優(yōu)選0. 2 0. 8vvm(volume per volume per minute :每單位體積的氣體通氣量)，優(yōu)選為 0. 2 0. 6vvm，或者也可以為10 50L/min(表示在1分鐘內(nèi)將10 50L無菌空氣通氣到 25 83L液體培養(yǎng)基中的量)，優(yōu)選為20 40L/min。本發(fā)明中使用的培養(yǎng)槽只要是具有可以保持期望量培養(yǎng)液的容量、且能夠防止微生物從外部混入的容器即可。優(yōu)選的是，可以使用具有可對所保持的培養(yǎng)基進(jìn)行加熱加壓殺菌的構(gòu)造的培養(yǎng)槽，但是如果保持培養(yǎng)液的培養(yǎng)槽本身可由高壓滅菌器等進(jìn)行殺菌，則不需要用于加壓殺菌的功能。另外，優(yōu)選具有將無菌空氣導(dǎo)入容器內(nèi)的功能、或能夠附加用于該功能的裝置的培養(yǎng)槽。也可以使用通常的小型發(fā)酵罐，但在該情況下，培養(yǎng)時(shí)不需要使用機(jī)械攪拌功能。本發(fā)明中使用的培養(yǎng)槽的大小根據(jù)生產(chǎn)的液體種菌的量來適宜調(diào)整即可。在本發(fā)明的液體種菌生產(chǎn)中，可以為連續(xù)培養(yǎng)或單次培養(yǎng)中的任意一者，優(yōu)選為單次培養(yǎng)，即，優(yōu)選每次培養(yǎng)進(jìn)行蘑菇子實(shí)體生產(chǎn)的每單位所使用的液體種菌。另外，在液體種菌的生產(chǎn)中進(jìn)行大量培養(yǎng)(在本申請說明書中也稱為“本培養(yǎng)”)的情況下，可以將在瓊脂培養(yǎng)皿等中生長的菌絲體直接用于本培養(yǎng)。作為優(yōu)選的實(shí)施方案， 首先通過使用燒瓶等對菌絲體進(jìn)行攪拌或振蕩來進(jìn)行小規(guī)模的預(yù)培養(yǎng)，然后使用該預(yù)培養(yǎng)物進(jìn)行本培養(yǎng)。在該情況下，通過在本培養(yǎng)時(shí)采用本發(fā)明的液體種菌生產(chǎn)方法，可以有效且廉價(jià)地大量生產(chǎn)液體種菌。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，即使在上述通過使用燒瓶等的振蕩來進(jìn)行的小規(guī)模預(yù)培養(yǎng)中，通過使所使用的液體培養(yǎng)基中含有低濃度的植物油，與不含有低濃度的植物油的情況相比， 也可以較多地獲得菌絲體。因此，通過使預(yù)培養(yǎng)時(shí)及本培養(yǎng)時(shí)所使用的液體培養(yǎng)基中含有低濃度的植物油，能夠更有效且廉價(jià)地大量生產(chǎn)液體種菌。本申請說明書中使用的液體培養(yǎng)基使用通常用作蘑菇的液體培養(yǎng)營養(yǎng)源的那些物質(zhì)作為營養(yǎng)源，可以使用(例如)含有碳源、氮源、無機(jī)鹽等可以同化的營養(yǎng)源的液體培養(yǎng)基。例如，可以使用葡萄糖、麥芽糖、糖蜜、糊精、甘油、淀粉等碳水化合物等碳源，以及蛋白胨、肉提取物、棉籽粉、大豆粉、酵母提取物、酪蛋白、玉米漿、NZ-胺、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等氮源，還可以含有磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鈉、食鹽、碳酸鈣、硫酸鎂、氯化錳等無機(jī)鹽，只要是可培養(yǎng)上述蘑菇菌絲體的液體培養(yǎng)基即可。對本申請說明書中所謂的“植物油”沒有特別的限定，只要為來自植物的油即可， 從安全性及獲得難易的方面考慮，優(yōu)選為食用油。作為食用油，可以列舉(例如)米糠油、 菜籽油、紅花油、玉米油、橄欖油、芝麻油、大豆油、棉籽油等。另外，以這些油為原料的色拉油等加工油也可用于本發(fā)明。這些植物油可以用公知的方法進(jìn)行制備，也可以使用市售品。 本發(fā)明中，也可以將這些植物油中的1種或2種以上混合在培養(yǎng)基中而使用。本發(fā)明中，培養(yǎng)基中植物油的含量相對于液體培養(yǎng)基總量可以為低濃度，適宜為 0. 001 0. 1體積％ (ν/ν)，優(yōu)選為0. 005 0. 1體積％ (ν/ν)，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 01至小于 0.05體積％ (ν/ν) 0利用該低濃度的植物油，可以在液體培養(yǎng)中在不覆蓋液體培養(yǎng)基表面的條件下進(jìn)行使用。本發(fā)明的液體種菌培養(yǎng)可以通過公知的方法進(jìn)行，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間可以在蘑菇菌絲體可繁殖的范圍內(nèi)來適宜地決定。作為一個(gè)例子而不是對本發(fā)明的特別限定，例如， 可以按照下述工序進(jìn)行。在200mL PGY液體培養(yǎng)基[組成葡萄糖1.49% (w/v)、蛋白胨 0. 15% (w/v)、酵母提取物 0. 15% (w/v)、KH2PO4O. 0373 % (w/v)、及 MgSO4 · 7Η200· 0373 % (w/v),pH 6.0]中接種荷葉菇的菌絲體，在25°C培養(yǎng)14天，制備預(yù)培養(yǎng)物。接著，在另行制備的430L PGY液體培養(yǎng)基中以相對于培養(yǎng)基為0.001 0.04體積％的量添加植物油(例如，色拉油[日清色拉油，日清才4 1J才夕·^一株式會社制])，制備本培養(yǎng)用的液體培養(yǎng)基。將該液體培養(yǎng)基填充到培養(yǎng)槽中，在118°C下進(jìn)行90分鐘高壓蒸氣滅菌。自然冷卻開始后立即利用無菌空氣進(jìn)行通氣，將培養(yǎng)槽內(nèi)調(diào)成正壓。將該培養(yǎng)基冷卻后，接種上述全部的預(yù)培養(yǎng)物，在培養(yǎng)溫度25°C、通氣量0. ^vvm、內(nèi)壓0. 075MPa、無動力攪拌(鼓泡)的培養(yǎng)條件下，進(jìn)行6 7天培養(yǎng)，生產(chǎn)液體種菌。將如上生產(chǎn)的液體種菌無菌轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜?例如，聚丙烯制的圓形瓶等)中， 直到攝取至菌床培養(yǎng)基為止的這一期間，可以保持在控制為3 -1°C范圍的環(huán)境下以保存。接著，使用上述液體種菌，可以通過(例如)作為菌床栽培方法的瓶栽、袋栽、箱栽等來生產(chǎn)蘑菇子實(shí)體。作為一個(gè)例子，對利用瓶栽的本發(fā)明的使用液體種菌的蘑菇子實(shí)體的生產(chǎn)方法進(jìn)行描述，該方法由菌床培養(yǎng)基的制備、裝瓶、滅菌、液體種菌的接種、菌床培養(yǎng)、(如果需要，搔菌)、發(fā)芽、(如果需要，插芽的分離、插芽的移植)、生長繁殖、收獲等各工序組成。例如，可以將通過本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的液體種菌用作以下種菌如果為荷葉菇， 則用作進(jìn)行日本特開平04-211308號公報(bào)所述的菌床栽培時(shí)的種菌；如果為香菇，則用作進(jìn)行日本特開平04-075538號公報(bào)所述的菌床栽培時(shí)的種菌；如果為真姬菇，則用作進(jìn)行日本特開平05-268942號公報(bào)所述的菌床栽培時(shí)的種菌；或者，如果為本占地菇，則用作進(jìn)行日本特開2000-106752號公報(bào)所述的菌床栽培時(shí)的種菌。另外，如果為進(jìn)行插芽的分離及插芽的移植的菌床栽培的情況，則也可以將通過本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的液體種菌用作進(jìn)行日本特開2009-017872號公報(bào)所述的菌床栽培時(shí)的種菌。但是，與使用固體種菌時(shí)的菌床栽培用培養(yǎng)基或通常使用的菌床栽培用培養(yǎng)基相比，本發(fā)明的蘑菇子實(shí)體的生產(chǎn)方法中使用的菌床栽培用培養(yǎng)基優(yōu)選使菌座提高，適當(dāng)?shù)氖?，使菌座位于比瓶口? IOmm的下方。另外，優(yōu)選將菌座表面均勻地平面化。進(jìn)而，瓶中央部的穴(也稱為孔或接種孔)不是特別需要的，可以使用在每個(gè)瓶的瓶淵附近(即，瓶中央部的周邊)開2 6處、優(yōu)選4處口徑3 IOmm左右、優(yōu)選5mm左右、深度100 200mm 左右、優(yōu)選110 150mm左右的小穴(也稱為孔或接種孔)的菌床栽培用培養(yǎng)基。在此，本申請說明書中，所謂“菌座”是指栽培用培養(yǎng)基上部表面的菌接種部位。 例如，在瓶栽用培養(yǎng)基中，將瓶開口部的露出的培養(yǎng)基表面稱為菌座。本發(fā)明中，優(yōu)選的是， 與使用固體種菌時(shí)的菌床栽培用培養(yǎng)基(也稱為菌床栽培用固體培養(yǎng)基、菌床栽培用培養(yǎng)基)相比，使菌座提高(即距離瓶口近)，例如，在瓶栽的情況(如圖1所示使用固體種菌的情況)下，推薦的是，將通常的瓶栽所使用的市售的850mL瓶或IlOOmL瓶的瓶口(瓶淵) 下方15mm處設(shè)為菌座，但本發(fā)明中，優(yōu)選的是，與使用固體種菌時(shí)的菌床栽培用培養(yǎng)基的菌座相比，使菌座提高，優(yōu)選將位于瓶口下方2 IOmm處、進(jìn)一步優(yōu)選瓶口下方5 9mm處設(shè)為菌座。將通過發(fā)明的方法生產(chǎn)的液體種菌接種在菌床栽培用培養(yǎng)基中時(shí)，對于每瓶 850mL的廣口培養(yǎng)瓶，無菌地移植(例如)約10 20mL即可。作為接種上述液體種菌的方法，不需要使用特殊的機(jī)械以噴霧狀地在菌座及接種孔上均勻地進(jìn)行接種，僅直接將必需量的液體種菌無菌地添加在菌座上即可。添加液體種菌的菌座上的位置優(yōu)選位于菌座的中央部附近。與用于大規(guī)模蘑菇子實(shí)體的商業(yè)生產(chǎn)的固體種菌相比，根據(jù)本發(fā)明，能夠在極短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)用于蘑菇子實(shí)體的商業(yè)生產(chǎn)的液體種菌。例如，在生產(chǎn)上述固體種菌的情況下， 將預(yù)培養(yǎng)后的液體菌絲或固體菌絲接種在固體培養(yǎng)基中。然后，使菌絲在固體培養(yǎng)基中蔓延約30 60天。將得到的蔓延有菌絲的固體培養(yǎng)基作為固體種菌，用于蘑菇子實(shí)體的商業(yè)生產(chǎn)。與此相對，在通過本發(fā)明方法得到液體種菌的情況下，將預(yù)培養(yǎng)后的液體菌絲接種于本發(fā)明的液體培養(yǎng)基。然后，通過進(jìn)行約3 7天、優(yōu)選6 7天的培養(yǎng)，從而可以生產(chǎn)液體種菌，且可以用于蘑菇子實(shí)體的商業(yè)生產(chǎn)。另外，將通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的液體種菌用于大規(guī)模的蘑菇子實(shí)體的商業(yè)生產(chǎn)， 由此可以避免由固體種菌的批次差造成的蘑菇子實(shí)體生產(chǎn)時(shí)的生產(chǎn)差異，并且可以穩(wěn)定地生產(chǎn)優(yōu)良的蘑菇子實(shí)體。以上列舉實(shí)例對瓶栽方法進(jìn)行了說明，但是通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的液體種菌并不限定于在利用上述瓶栽的菌床栽培中的使用。[實(shí)施例]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體說明，但本發(fā)明并不僅限定于以下實(shí)施例的范圍。實(shí)施例1在200mL PGY液體培養(yǎng)基組成葡萄糖1. 49% (w/v)、蛋白胨0. 15% (w/v)、酵母提取物 0. 15% (w/v)、KH2PO4O. 0373% (w/v)、及 MgSO4 · 7H20 0. 0373% (w/v)，pH 6· 0中接種 Lyophyllum decastes K-3304 (FERM BP-4348)的菌絲體，在 25°C下進(jìn)行 14 天振蕩培養(yǎng)(IOOrpm)，制備預(yù)培養(yǎng)物。接著，在另行制備的430L PGY液體培養(yǎng)基中，以相對于培養(yǎng)基為約0. 02% (ν/ν) 的比率添加作為植物油的色拉油(日清色拉油，日清才^ 'J才夕·^一株式會社制)，制備本培養(yǎng)用的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)槽使用的是沒有攪拌能力的非第一類壓力容器。將加入有本培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)槽在118°C下進(jìn)行90分鐘高壓蒸汽殺菌，自然冷卻開始后立即進(jìn)行利用無菌空氣的通氣，將培養(yǎng)槽內(nèi)調(diào)成正壓。將該培養(yǎng)基冷卻后，接種上述全部的預(yù)培養(yǎng)物，在培養(yǎng)溫度25°C、通氣量0. 26vvm,內(nèi)壓0. 075MPa、無動力攪拌(鼓泡)的培養(yǎng)條件下， 進(jìn)行6 7天培養(yǎng)，制備液體種菌。同時(shí)，僅利用PGY液體培養(yǎng)基進(jìn)行無動力攪拌(鼓泡)培養(yǎng)，作為比較對照。其他的培養(yǎng)條件與上述條件相同，比較菌體的收獲量。將其結(jié)果示于表1。[表 1]
條件干燥菌體重量(g/L)有色拉油4. 1無色拉油3. 0表1表明，在使用本發(fā)明的添加有色拉油的培養(yǎng)基的、使用不伴有機(jī)械攪拌的氣泡所進(jìn)行的培養(yǎng)中，與沒有添加時(shí)的情況相比，可以得到約多1. 36倍的菌體。實(shí)施例2為了確認(rèn)通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的液體種菌的子實(shí)體形成能力，進(jìn)行如下的子實(shí)
體生產(chǎn)。液體種菌通過與實(shí)施例1同樣的方法進(jìn)行制備。作為比較對象，固體種菌如下進(jìn)行制備。首先，在聚丙烯制的廣口培養(yǎng)瓶(850mL，信越農(nóng)材株式會社制)中加入IOOg鋸屑 (杉材)、86g米糠、2g硅酸鋁鎂(富士化學(xué)工業(yè)株式會社制，商品名Neusilin FH1)、5g碳酸鈣(Nacalai Tesque株式會社制，一級試劑)、3g—水檸檬酸(Nacalai Tesque株式會社制，一級試劑)，并將水分含量設(shè)定為63 65重量％，充分混合，壓實(shí)成為濕潤狀態(tài)的物質(zhì)。 在壓實(shí)物表面的中央開直徑Icm左右的接種孔部，蓋上蓋子后，在118°C下進(jìn)行90分鐘高壓蒸汽殺菌，自然冷卻至20°C。對這樣得到的固體培養(yǎng)基接種約10 20mL的實(shí)施例1所述預(yù)培養(yǎng)物。然后，在暗處，在溫度25°C、濕度55%的條件下培養(yǎng)菌絲體約60天，使菌絲蔓延到固體培養(yǎng)基整體，制備固體種菌。
接著，在聚丙烯制的廣口培養(yǎng)瓶(llOOmL，山田產(chǎn)業(yè)株式會社制)中加入134g鋸屑(杉材)、130g米糠、2. 6g硅酸鋁鎂[富士化學(xué)工業(yè)株式會社制，商品名Neusilin FH1], 6. 5g碳酸鈣(Nacalai Tesque株式會社制，一級試劑)、3. 9g—水檸檬酸(Nacalai Tesque 株式會社制，一級試劑)，將水分含量設(shè)定為63% 65重量％，充分混合，將菌座設(shè)定在距瓶口約15mm的下方，壓實(shí)成為濕潤狀態(tài)的物質(zhì)。在壓實(shí)物表面的瓶中央開直徑2cm左右的接種孔部，蓋上蓋子后，在118°C下進(jìn)行90分鐘高壓蒸汽殺菌，將自然冷卻至20°C的培養(yǎng)基作為菌床栽培用培養(yǎng)基。在該菌床栽培用培養(yǎng)基上接種約20mL上述制備的液體種菌。作為比較對象，準(zhǔn)備接種有約35g上述制備的固體種菌的培養(yǎng)基。各制作16瓶分別接種有液體種菌及固體種菌的菌床栽培用培養(yǎng)基。將它們在暗處，在溫度25°C、濕度55%的條件下下培養(yǎng)菌絲體約60天，使菌絲蔓延到菌床栽培用培養(yǎng)基整體。然后，取下蓋子，進(jìn)行菌床面上部的搔菌，接著，加入自來水至瓶口后，立即排水，供于發(fā)芽工序。發(fā)芽工序在發(fā)芽室中在以下條件下進(jìn)行照度50勒克司、溫度16°C、濕度控制在作為一 S τ 4 100(鷺宮制作所制)的示值的115% 120%范圍內(nèi)、二氧化碳濃度控制在1000 1500ppm的范圍。另外，為了避免結(jié)露，將瓶倒置，繼續(xù)培養(yǎng)11天，形成子實(shí)體原基。然后，將瓶反轉(zhuǎn) 正置，過渡到前期生長工序。在前期生長工序中，在生長室中在以下條件下培養(yǎng)6天照度500勒克司、溫度16°C、濕度控制在作為t-一 S τ 4 100的示值的 115% 120%范圍內(nèi)、二氧化碳濃度控制在1000 2000ppm的范圍。接著，過渡到后期生長工序。在后期生長工序中，在生長室中在以下條件下繼續(xù)培養(yǎng)7天照度500勒克司、溫度16°C、濕度控制在作為匕工一 7、100的示值的95 105%范圍內(nèi)、二氧化碳濃度控制在1000 2000ppm的范圍。收獲這樣得到的成熟子實(shí)體后，比較子實(shí)體的平均收獲量(g/ 瓶)。將其結(jié)果示于表2。[表 2]
權(quán)利要求
1.一種蘑菇的液體種菌的生產(chǎn)方法，其為用于生產(chǎn)蘑菇子實(shí)體的液體種菌的生產(chǎn)方法，其特征在于，在含有植物油的液體培養(yǎng)基中，通過使用氣泡攪拌培養(yǎng)基來對蘑菇的菌絲體進(jìn)行液體深部培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中，基本上僅使用氣泡來對培養(yǎng)基進(jìn)行攪拌。
3.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中，所述植物油為選自色拉油、米糠油、菜籽油、紅花油、玉米油、橄欖油、芝麻油、大豆油及棉籽油中的1種或多種。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法，其中，所述培養(yǎng)基中的所述植物油濃度為0. 001 0. 1體積％。
5.一種蘑菇子實(shí)體的生產(chǎn)方法，其特征在于，使用了通過權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法而得到的蘑菇的液體種菌。
6.如權(quán)利要求5所述的蘑菇子實(shí)體的生產(chǎn)方法，其為瓶栽法。
7.如權(quán)利要求5或6所述的蘑菇子實(shí)體的生產(chǎn)方法，其特征在于，使用菌座提高了的菌床栽培用培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蘑菇子實(shí)體的大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)中廉價(jià)且有效的液體種菌生產(chǎn)方法、以及使用該液體種菌的蘑菇子實(shí)體生產(chǎn)方法。本發(fā)明涉及一種蘑菇的液體種菌的生產(chǎn)方法，其為用于生產(chǎn)蘑菇子實(shí)體的蘑菇液體種菌的生產(chǎn)方法，其特征在于，在含有植物油的液體培養(yǎng)基中，通過使用氣泡攪拌培養(yǎng)基來進(jìn)行液體深部培養(yǎng)。另外，本發(fā)明還涉及一種蘑菇子實(shí)體的生產(chǎn)方法，其特征在于，在瓶栽中，使用菌座進(jìn)一步提高了的菌床栽培用培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，可以大幅縮短種菌生產(chǎn)時(shí)間，另外，可以避免使用固體種菌的蘑菇子實(shí)體生產(chǎn)時(shí)的生產(chǎn)不均勻性的風(fēng)險(xiǎn)，并且可以穩(wěn)定地生產(chǎn)優(yōu)良的蘑菇子實(shí)體。
文檔編號A01G1/04GK102369838SQ20111023156
公開日2012年3月14日 申請日期2011年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月11日
發(fā)明者喜多昭彥, 大島健一, 日下部克彥, 橋元勇二 申請人:寶生物工程株式會社