專利名稱：擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗病毒型抗脂多糖因子，尤其是涉及一種擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)不僅是危害對蝦的主要病毒性病原，而且能夠感染其他許多甲殼類十足目動物，而這其中包括許多重要水產(chǎn)經(jīng)濟養(yǎng)殖品種。WSSV病害自1993年發(fā)生以來，給全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失，近20年來，國內(nèi)外學(xué)者在WSSV侵染和水生甲殼動物抗WSSV免疫研究方面取得了一些關(guān)鍵性進展， 遺憾的是，至今尚無針對此病毒的有效防治方法。眾所周知，與脊椎動物相比，蝦、蟹等無脊椎甲殼動物缺乏后天免疫應(yīng)答系統(tǒng)，它們僅依靠非特異性免疫來抵御微生物入侵感染。已有研究表明病毒感染對蝦、蟹后能夠激活宿主的免疫識別信號傳導(dǎo)通路，如NF-kappaB信號通路[1’2]、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 6(TRAF6)信號通路[3]和STAT信號通路M等，從而引發(fā)一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)，包括抗菌肽的合成與釋放[3’5]、細(xì)胞吞噬[6]和細(xì)胞凋亡[7]等，這些免疫應(yīng)答反應(yīng)在甲殼類動物抵御外界病原微生物感染過程中發(fā)揮重要作用。值得一提的是，近年來陸續(xù)有一些抗病毒活性物質(zhì)得以分離鑒定，諸如血藍(lán)蛋白[8]、溶菌酶[9]、抗菌肽[5’1(Η13]等，這些研究報道為蝦、蟹等水產(chǎn)養(yǎng)殖病毒病的有效防治提供了重要理論依據(jù)?？怪嗵且蜃邮状伟l(fā)現(xiàn)于鱟[14’15]體內(nèi)，該因子具有抗凝血作用，能夠抑制細(xì)菌脂多糖(LPQ引發(fā)的凝集反應(yīng)，故命名為抗脂多糖因子。研究表明，ALF對LPS具有高親和力， 能夠結(jié)合LPS的類脂A部位并中和其生物學(xué)活性，對于抵抗內(nèi)毒素血癥和內(nèi)毒素休克具有重要作用；此外，ALF對R-型革蘭氏陰性菌生長具有強烈抑制作用[15]。ALF在其他多種甲殼動物體內(nèi)也相繼得以分離鑒定，并且ALF在LPS[16_18]、細(xì)菌、真菌和WSSV[23]刺激后均有不同程度的上調(diào)表達，而體外重組表達的ALF蛋白也表現(xiàn)出廣譜抗菌活性，包括對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抑制與殺傷作用[16’2°’24]。近期研究表明，螯蝦Pl-ALF具有顯著的抗WSSV活性[13]，而對蝦Pm-ALF3[11]亦顯示出抗WSSV活性。綜上所述，ALF是水生甲殼類動物的重要免疫因子，對其功能的深入鑒定研究不僅在抗微生物感染理論研究方面具有重要意義，而且在生產(chǎn)實踐中亦具有廣泛應(yīng)用前景。擬穴青蟹kylla paramamosain與基因工程，特別涉及擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factor)，即Sp_ALF2基因克隆、重組表達產(chǎn)物及其制備方法，尤其是利用紅螯螯蝦造血組織干細(xì)胞作為細(xì)胞模型進行Sp-ALF2產(chǎn)品抗WSSV感染的抗病毒實驗技術(shù)。參考文獻如下1. 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tigershrimp Penaeus monodon[J]. Dev Comp Immunol,2005,29(10) :841-851.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的基因序列。本發(fā)明的第二目的在于提供擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的氨基酸序列。本發(fā)明的第三目的在于提供擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制備方法。本發(fā)明的第四目的在于提供擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子的應(yīng)用。為區(qū)別與本申請人之前已經(jīng)克隆的抗菌型抗脂多糖因子Sp-ALF，特將所述擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子命名為Sp-ALF2。所述擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的基因序列為cagtatgaaa ctctgatagc ctccgttctt ggaaaactca ctggactgtg gcacaacaac 60tcagtggact tcatgggcca cacctgtcac ttccgccgcc gtcctaaggt caggaaattc 120aagctgtacc acgagggcaa gttttggtgt cctggctggg cgccttttga gggcaggtcg 180aggacaaaga gcaggtcggg gtcatccagg gaagccatca aggacttcgt gcgcaaagct 240ttacagaacg gactcatcac acagcaggac gctacggtgt gggtgaataa ttaa 294所述擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的氨基酸序列為Gln Tyr Glu Thr Leu lie Ala Ser Val Leu Gly Lys Leu Thr Gly Leu151015Trp His Asn Asn Ser Val Asp Phe Met Gly His Thr Cys His Phe Arg2025 30Arg Arg Pro Lys Val Arg Lys Phe Lys Leu Tyr His Glu Gly Lys Phe3540 45Trp Cys Pro Gly Trp Ala Pro Phe Glu Gly Arg Ser Arg Thr Lys Ser5055 60Arg Ser Gly Ser Ser Arg Glu Ala lie Lys Asp Phe Val Arg Lys Ala6570 7580Leu Gln Asn Gly Leu lie Thr Gln Gln Asp Ala Thr Val Trp Val Asn859095Asn所述擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制備方法包括以下步驟
1)構(gòu)建擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2重組表達載體；2)將步驟1)所得重組表達載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并將宿主細(xì)胞進行誘導(dǎo)表達，獲得表達產(chǎn)物；3)分離純化步驟2、所得的表達產(chǎn)物，獲得重組蛋白，即Sp-ALF2。在步驟1)中，所述表達載體可選用pPICTk等。在步驟幻中，所述宿主細(xì)胞可為畢赤酵母等。在步驟幻中，所述分離純化步驟2、所得的表達產(chǎn)物的方法可先將表達產(chǎn)物進行透析，再進行親和層析。所述擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2對WSSV和多種病原菌具有明顯抑制作用和殺傷作用，在制備抗病毒類新藥和作為動物抗病飼料添加劑中具有廣泛應(yīng)用價值。本發(fā)明在分離出擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的基礎(chǔ)上，根據(jù) Sp-ALF2基因序列特征成功構(gòu)建重組表達載體并在畢赤酵母系統(tǒng)中表達并純化獲得 Sp-ALF2蛋白，該重組蛋白具有較強的抗WSSV活性及廣譜抗菌活性。研究結(jié)果表明， Sp-ALF2可能廣泛參與了擬穴青蟹抗微生物感染反應(yīng)，是一種重要的先天免疫因子，因此， 重組基因工程產(chǎn)品Sp-ALF2蛋白在抗微生物感染，特別是抗病毒類新藥開發(fā)應(yīng)用中顯示出非常誘人的應(yīng)用前景。


圖1為pPICTk載體雙酶切前后電泳圖譜。1為酶切前的pPICTk載體；2為酶切后 pPIC9k 載體；M 為 DS2000DNA Marker。圖2為表達載體pPIC9k和pPIC9k/Sp_ALF2Sal I線性化前后電泳圖譜。1為 pPIC9k，2 為酶切后 pPIC9k，3 為 pPIC9k/Sp_ALF2，4 為酶切后的 pPIC9k/Sp_ALF2，M 為 DS2000DNA Marker。圖3為pPICTk/Sp-ALF2重組畢赤酵母克隆子甲醇誘導(dǎo)表達檢測SDS-PAGE電泳圖譜。1為誘導(dǎo)前表達情況；2 4分別為甲醇誘導(dǎo)12h、Mh、48h的表達產(chǎn)物；M為SDS-PAGE 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker，重組蛋白Sp_ALF2的大小為13kDa，與Marker的14kDa條帶位置一致。圖4為pPICTk/Sp-ALF2重組畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達產(chǎn)物純化檢測電泳圖譜。1 2為透析樣品離心后的沉淀和上清；3為穿過峰；4為溶液C洗脫峰；5 9為溶液D洗脫峰； M為SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker。圖5為重組蛋白rSp_ALF2的抗病毒實驗檢測電泳圖譜分別檢測內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因(1 6)和WSSV極早期基因IEl (7 12)的表達。1、7為正常細(xì)胞對照；2、8 為 5 μ MrSp-ALF2 孵育組；3、9 為 10 μ M rSp_ALF2 孵育組；4、10 為 5 μ Mr Sp-ALF 孵育組；5、11為10 μ Mr Sp-ALF孵育組；6、12為WSSV感染對照組。
具體實施例方式以下通過實施例結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。實施例1擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2真核重組表達載體的構(gòu)建根據(jù)pPICTk載體多克隆位點，設(shè)計擴增編碼擬穴青蟹Sp-ALF2 (cDNA)基因ORF的特異性上游引物Fl和下游引物R1。在上游引物Fl的5'端添加SnaB I酶切位點和編碼His-tag的堿基；在下游引物Rl的5'端添加終止密碼子和Avr II酶切位點。上游引物 Fl :5 ‘ -CGTACGTACACCATCATCATCATCATCAGTATGAAGCTCTGGTAGC-3 ‘，下游引物 Rl 5' -AACCTAGGTTA CCCCTTCAGCCAGGCGGCC-3‘，擴增 Sp_ALF2 的編碼區(qū)片段。PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，重復(fù)30個循環(huán)；72°C 延伸lOmin。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠純化試劑盒回收，回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)SnaB I和Avr II 酶切后純化回收，與SnaB I和Avr II雙酶切線性化pPICTk載體連接，構(gòu)建好酵母表達重組載體pPirak/Sp-ALFl，測序鑒定讀碼框正確無誤。pPICTk載體雙酶切前后電泳圖譜參見圖1。實施例2pPIC9k/Sp_ALF2重組質(zhì)粒在畢赤酵母GS 115中的誘導(dǎo)表達測序正確質(zhì)粒pPIC9k/Sp_ALF2經(jīng)Ml I酶切線性化(參見圖2)，以電擊法轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GSl 15感受態(tài)細(xì)胞中，并誘導(dǎo)表達。以pPICTk空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母GS115為對照，以pPirak/Sp-ALF2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母GS115為實驗組，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測目的蛋白的表達。結(jié)果顯示，以？？1(躲/^)41^2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母63115誘導(dǎo)后與誘導(dǎo)前相比具有明顯的重組蛋白誘導(dǎo)表達，蛋白條帶在14kDa左右(參見圖幻，與計算的理論分子量相似，后經(jīng)質(zhì)譜鑒定無誤，確定為Sp-ALF2。實施例3pPIC9k/Sp_ALF2重組質(zhì)粒在畢赤酵母GS115中誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的純化、抗病毒活性及抗菌活性鑒定1、親和層析法純化目的蛋白將重組陽性畢赤酵母GS115菌株大量誘導(dǎo)表達后，離心去除菌體收集培養(yǎng)基上清 1L，PBS透析兩次(12h換一次新透析液)后，4°C，12000rpm離心35min，取上清，得上柱樣品。隨后采用金屬鏊合層析柱對透析后蛋白進行親和層析。收集溶液D洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分析及質(zhì)譜鑒定為Sp-ALF2重組蛋白(參見圖4)。2、Sp-ALF2重組蛋白抗WSSV活性鑒定應(yīng)用Bradford法測定BSA標(biāo)準(zhǔn)品得到蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)公式可計算出 Sp-ALF2重組蛋白濃度。Sp-ALF2重組蛋白抗WSSV活性鑒定將目的蛋白稀釋至5 μ M和10 μ Μ，與WSSV 混勻；孵育30min后，加至螯蝦造血組織干細(xì)胞(Hpt)體外培養(yǎng)細(xì)胞中，混勻；孵育1小時， 隨后移走全部培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基，混勻；繼續(xù)孵育3小時后，收集培養(yǎng)孔中細(xì)胞，提取 Hpt細(xì)胞總RNA，取1 μ g DNaseI處理后總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用東盛公司HS Taq Mix試劑盒做RT-PCR，檢測WSSV在Hpt細(xì)胞中的復(fù)制檢測病毒復(fù)制極早期基因IE1，以GAPDH基因作為內(nèi)參，GAPDH引物為F:AATGCTTCTTGCACCACCAAC ；R:AGGTCTTGCTCAGCTGGATACC ；IEl 引物為FGGTATTGAGGTGATGAAGAGGCG ；
RTGACATGGGAACCACTGTTGAG)。
PCR反應(yīng)體系如表1所示表 權(quán)利要求
1.擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子SP-ALF2的基因序列為cagtatgaaa ctctgatagc ctccgttctt ggaaaactca ctggactgtg gcacaacaac 60 tcagtggact tcatgggcca cacctgtcac ttccgccgcc gtcctaaggt caggaaattc 120 aagctgtacc acgagggcaa gttttggtgt cctggctggg cgccttttga gggcaggtcg 180 aggacaaaga gcaggtcggg gtcatccagg gaagccatca aggacttcgt gcgcaaagct 240 ttacagaacg gactcatcac acagcaggac gctacggtgt gggtgaataa ttaa2940
2.擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的氨基酸序列為 Gln Tyr Glu Thr Leu lie Ala Ser Val Leu Gly Lys Leu Thr 1510 Trp His Asn Asn Ser Val Asp Phe Met Gly His Thr Cys His202530Arg Arg Pro Lys Val Arg Lys Phe Lys Leu Tyr His Glu Gly354045Trp Cys Pro Gly Trp Ala Pro Phe Glu Gly Arg Ser Arg Thr505560Arg Ser Gly Ser Ser Arg Glu Ala lie Lys Asp Phe Val Arg 657075Leu Gln Asn Gly Leu lie Thr Gln Gln Asp Ala Thr Val Trp 8590Asn0
3.擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)構(gòu)建擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2重組表達載體；2)將步驟1)所得重組表達載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并將宿主細(xì)胞進行誘導(dǎo)表達，獲得表達產(chǎn)物；3)分離純化步驟幻所得的表達產(chǎn)物，獲得重組蛋白，即Sp-ALF2。
4.如權(quán)利要求3所述的擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述表達載體選用pPICTk。
5.如權(quán)利要求3所述的擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制備方法，其特征在于在步驟幻中，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母。
6.如權(quán)利要求3所述的擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制備方法，其特征在于在步驟幻中，所述分離純化步驟幻所得的表達產(chǎn)物的方法是先將表達產(chǎn)物進行透析， 再進行親和層析。
7.擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2在制備抗病毒藥中的應(yīng)用。
8.擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2在制備動物抗病飼料添加劑中的應(yīng)用。Gly Leu 15Phe ArgLys PheLys SerLys Ala 80 Val Asn 9全文摘要
擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子及其制備方法與應(yīng)用，涉及一種抗病毒型抗脂多糖因子。提供擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的基因序列、氨基酸序列、擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制備方法以及擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子的應(yīng)用。構(gòu)建擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2重組表達載體；將重組表達載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并將宿主細(xì)胞進行誘導(dǎo)表達，獲得表達產(chǎn)物；分離純化后產(chǎn)物，獲得重組蛋白，即Sp-ALF2。所述擬穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2對WSSV和多種病原菌具有明顯抑制作用和殺傷作用，在制備抗病新藥和作為動物抗病飼料添加劑中具有廣泛應(yīng)用價值。
文檔編號A23K1/16GK102242128SQ201110198629
公開日2011年11月16日 申請日期2011年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月15日
發(fā)明者劉海鵬, 王克堅, 陳榮元 申請人:廈門大學(xué)