專利名稱：菊花花發(fā)育基因CmCO的克隆及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及菊花(Chrysanthemum morflorium)花發(fā)育基因CmCO的克隆、功能鑒定與應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
菊花是我國傳統(tǒng)名花，也是世界四大切花之一。目前通過光周期調(diào)節(jié)花期技術(shù)進行周年生產(chǎn)，并常年供應(yīng)市場。但由于菊花是短日照花卉，為周年生產(chǎn)而采取的春、夏季遮光和冬季補光等花期調(diào)控措施，造成大量的人力、物力和財力的浪費，制約了菊花產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育光周期不敏感菊花新品種具有重要的理論和實踐意義。CO是成花的重要計時基因，其產(chǎn)物達到一定域值時，顯著地促進成花相關(guān)基因的表達(Onouchi H et al.，2000)，另外CO也可能具有直接促進花發(fā)育的作用(Samach A et al.，2000)。CO基因是Putterill (1995)采用圖位克隆的方法分離到的，編碼鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，它在光周期調(diào)控中起關(guān)鍵作用，是感受外界光照和開花的橋梁。過量表達CO可以使擬南芥無論日照長短均可提前開花(Putterill J, 19995 ；Samach A et al. ,2000) 高水平積累的CO蛋白激活了 FT基因的表達，從而促進擬南芥在長日條件下開花(Samach A et al.，2000)。Onouchi等Q000)發(fā)現(xiàn)由花椰菜花葉病毒35S啟動子組成型表達CO會誘導(dǎo)早開花和喪失光周期敏感性。擬南芥CO突變體表現(xiàn)為長日照開花延遲，一些異源CO基因 (如短日照植物牽?；≒nCO基因和長日照植物蘿卜&iC0基因)轉(zhuǎn)入擬南芥CO突變體中， 可以使CO突變體恢復(fù)到正常表型，顯示了植物CO類似基因在開花時間控制途徑上的保守性和重要性(Robert et al. , 1998 ；Liu et al，2001)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因工程手段對花卉進行改良育種在近十幾年也得到了迅速的發(fā)展。菊花的基因工程起步較晚，早期的研究主要是建立有效的菊花再生體系和探討遺傳轉(zhuǎn)化中的各種因素對轉(zhuǎn)化的影響，轉(zhuǎn)入的基因主要是NPT IKKarle R等，1993) 和⑶S(BoaSe M R等，1998)報告基因。后期則以轉(zhuǎn)入目的基因為主，旨在通過對菊花定向改良性狀的研究，拓展菊花新品種。目前研究者已經(jīng)從30余個物種中克隆到CO同源基因并對其序列特征、表達模式和功能特性進行了研究。

發(fā)明內(nèi)容
為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控植物開花時間，本發(fā)明提供了一種菊花花發(fā)育基因CmCO 及其在觀賞作物中的應(yīng)用，可以用來調(diào)控植物的花期。本發(fā)明從菊花幼葉中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)GenBank中已發(fā)布的其它植物中CO基因的保守氨基酸序列，設(shè)計兼并引物，進行常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)。將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞， 篩選重組子，進行序列分析。然后通過3'和5'末端快速擴增(Rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技術(shù)分別獲得3'和5'端序列，并拼接成完整的cDNA序列。根據(jù)cDNA 的3'和5'端序列設(shè)計特異引物，以菊花幼葉的cDNA為模板進行PCR擴增，得到cDNA全長序列，將該cDNA命名為CmCO。 該基因的全長cDNA為U89bp，其中開放閱讀框部分為1149bp。由此推得，該基因具有382個氨基酸。將其氨基酸序列在GenBank中檢索，發(fā)現(xiàn)與已發(fā)表的!^aCO(Fragaria ananassa, ACJ06578)、PsCOL(Pisum sativum, AAX47172) > AtCO(Arabidopsis thaliana, NP_197088. 1)相比，氨基酸同源性分別為65. 8 %、62. 0%、55. 6 %。由此表明，經(jīng)過上述克隆步驟得到了菊花花發(fā)育的基因CmCO。 該基因序列如下 序列表
(I)SEQ ID NO. 1 的信息
(a)序列特征 *長度1298堿基對 *類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓撲結(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型cDNA
(c)假設(shè)否
(d)反義否
(e)最初來源菊花(Chrysanthemummorflorium)
(f)序列描述:SEQID NO. 11ATGTTGMACMGAGAGTAACATTAACGCTAGTGGAGCGAACAGTTGGGCACGACTCTGT
61GACACATGCCGGTCAGCTCCCTGCACCGTGTATTGCCGAGCAGATTCTGCCTACTTGTGC
121GCCGGCTGTGATGCCCATGTTCACGCTGCCAATCGTGTTGCTTCCCGCCATAAACGCGTC
181AGGGTCTGCGAGGCGTGTGAGCGTGCTCCAGCTGCTTTTTTATGTAAGGCAGATGCAGCC
241TCTCTTTGCACCGCCTGTGATGCAGATATTCACTCTGCAAACCCTCTTGCACGACGCCAC
301CMCGTGTCCCGGTTATTCCTATTTCAGGGTCTACGTATGAATCTCAAGGCAGGTTTTTT
361CCCCAAGGGTCAGACGGAACTGTTAATAAAGAAGMGAAGACGAAGCAGCGTCGTGGCTG
421CTATTCGATACTCCTGCTAAMACAACCAAAACCMGAATATACGAACGAGTTTTTGTTT
481AATGGAGAGGGGGGTGTAGATGAGTATTTGGATCTTGTGGACTACAATTCTTGTCAAGAT
541ACTCAGTTTAGTGATGATCATAAATGCAATAATTTGCAATTTAATGATGACTATAAGTAT
601ACGAATGATGTTACTAATTATAGTAAGGATATGCGGAAGTATGGCAGAGGTGATGCAGAT
661AGCGTAGTGCCAGTTGGAGGTGGAGAGGCTAAGAAGGAGCATCAMTTTATGATCTTAAC
721TTCCAACATCMAAATTTCAATTGGGATGTGATTATGAGGCTTCMATGGTGGCTACAGC
781TACCCTGCTTCACGTGGTCATAGTGTTTCTATGTCATCACTGGATGTTGGAGTAGTACCA
841GMTCTTCAATCTCAAGTTCMGATCTTCAAAAGGGACAACTGACTTATTCTCAGGTACT
901TCAATTCAGATGCCAACGCAACTTACTCCGTTAGACAGAGAGGCMGAGTCTTGAGTTAC
961AGGGAAMGAAGAAAACAAGMAATTTGAGAAAACGATTAGGTACGCATCTAGMAAGCG
1021TATGCAGAAACAAGGCCTAGGATCAMGGCCGTTTCTCAAAGCGMCAAATGTTGATGTC
1081GAGGTGGATCMATGTTTTCGACAACATTAATGACAGAAGGCGGATACTGTATTGTCCCT
1141TCGTTTTMTGMTGGTTAGGAGCAATAGATGCCAATATTGTAACTGGTTTTTTTCATTC
權(quán)利要求
1.一個菊花花發(fā)育基因β ⑶，其特征在于其核苷酸序列如SEQ IN NO. 1所示；其核苷酸編碼氨基酸序列如SEQ IN NO. 2所示。
2.一個菊花花發(fā)育基因^⑶的應(yīng)用，其特征在于該基因所編碼的蛋白包含B-boxl， B-box2, CCT結(jié)構(gòu)域及COOH區(qū)域，可以調(diào)控花期，培育對光周期不敏感植物新品種。
3.一個菊花花發(fā)育基因^⑶的應(yīng)用，其特征在于該基因的過量表達能促使菊花提前開花。
全文摘要
本發(fā)明涉及菊花花發(fā)育基因CmCO的克隆及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從菊花幼葉中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；設(shè)計兼并引物，進行常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選重組子；然后通過3′和5′末端快速擴增技術(shù)分別獲得3′和5′端序列，并拼接成完整的cDNA序列。根據(jù)cDNA的3′和5′端序列設(shè)計特異引物，以菊花幼葉的cDNA為模板進行PCR擴增，得到菊花花發(fā)育基因CmCO。該基因在觀賞作物中的應(yīng)用，可以調(diào)控植物的花期。
文檔編號A01H5/00GK102229936SQ201110150100
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月7日
發(fā)明者孫憲芝, 孫霞, 王文莉, 田素波, 鄭成淑, 黃在范 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)