專利名稱：一株能提高桉樹凈光合速率的有機(jī)解磷菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株梭形桿菌屬菌株及其應(yīng)用，更具體地涉及了一株能提高桉樹凈光合速率的有機(jī)解磷菌。
背景技術(shù)：
隨著對木材需求量的巨增，森林資源的逐步匱乏，速生桉樹的種植量明顯上升。最初僅作為觀賞樹種和科研林木，后來逐漸被引種為綠化樹種，現(xiàn)在作為緩解木材和林產(chǎn)品需求緊張的主要樹種，桉樹被廣泛種植。桉樹被譽(yù)為世界四大速生樹種(楊樹、松樹、桉樹、 相思)之一『2]，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。桉樹生長快，耗水耗費(fèi)量大，種植桉樹的林地往往容易導(dǎo)致土壤養(yǎng)分缺乏。就影響桉樹生長的養(yǎng)分因素來看，土壤中有效磷含量高低是制約桉樹生長的重要因素之一。具統(tǒng)計(jì)，我國有74%的耕地土壤明顯缺磷，而土壤中95 % 以上的磷為無效磷，很難被植物吸收植物利用DV。而通過人工施加磷肥，施入的磷肥本季節(jié)利用效率僅為5% 25%，大部分磷與土壤中的狗2+、Ca2+、Al3+、Fe3+結(jié)合形成難溶性的磷酸鹽[6]。這種通過施加磷肥來提高土壤總有效磷的含量，能耗高，成本高，有效轉(zhuǎn)化率低，浪費(fèi)嚴(yán)重[7]。利用土壤中自有的微生物的解磷功能，可以在保持土壤原有結(jié)構(gòu)形狀的前提下， 提高土壤可被植物吸收利用的可溶性磷含量。土壤微生物包含細(xì)菌、真菌和放線菌，繁殖快，分布廣泛。能將土壤中具高效解磷作用的菌株篩選出來，研制成解磷菌劑拌種或直接施入土壤，對發(fā)展可持續(xù)林業(yè)就有深遠(yuǎn)的意義。不僅解磷菌會(huì)直接提高土壤中的有效磷含量，而且可以替代有機(jī)肥、化肥等發(fā)揮同樣的功效。曾有意、德、比利時(shí)的一份試驗(yàn)報(bào)告顯示，玉米接種固氮螺菌可取代20 % 30 % 氮肥[8~9]。通過菌株的選擇，田間試驗(yàn)的驗(yàn)證，以及新科學(xué)技術(shù)在分子、基因水平的研究，解磷微生物的價(jià)值將得以最大實(shí)現(xiàn)。解磷微生物是土壤微生物的重要組成部分。解磷微生物或解磷菌( phosphatesoluble microorganisms,PSMs)是指土壤中能將難溶性化合態(tài)磷轉(zhuǎn)化為植物能夠吸收利用的簡單的可溶性磷的一類特殊的微生物功能類群，主要包括解磷細(xì)菌、解磷真菌和解磷放線菌[1°~11]。三大類解磷微生物解磷的效果存在較大的差異性，真菌數(shù)量少于細(xì)菌，但有些真菌的解磷能力則明顯大于細(xì)菌。又有學(xué)者根據(jù)解磷微生物作用于磷的形態(tài)不同，將其分為解無解磷菌和解有機(jī)磷菌。認(rèn)為能夠?qū)?fù)雜的有機(jī)磷礦化為簡單的植物可吸收形態(tài)磷的微生物稱之為有機(jī)磷微生物；能夠?qū)⒅参镫y以吸收的無機(jī)磷酸鹽化合物轉(zhuǎn)化為可直接吸收利用形態(tài)磷的微生物，稱之為無機(jī)磷微生物。但是，很多解無機(jī)磷微生物也同時(shí)具有解有機(jī)磷的能力，因此，在實(shí)際上卻很難將它們分得很清楚，有些菌僅具有單一的解磷能力，有些菌同時(shí)具有兩種解磷能力，后者是比較理想的篩選對象。解磷菌的作用對象主要是土壤中的難溶性的磷，利用土壤中自有的這種微生物特有的功能來提高土壤有效磷的含量，比傳統(tǒng)方法還有更多的優(yōu)勢(1)解磷微生物的存在可促進(jìn)農(nóng)作物對其它營養(yǎng)元素的吸收。解磷微生物由于新陳代謝，可吸附植物根系周圍鋅、 銅、鈣等微量元素，改善植物根系的營養(yǎng)；其次，其分泌的其它調(diào)節(jié)物，還可在一定程度上影響植物的生長。(2)增強(qiáng)植物的抗病能力。某些解磷微生物接種到植物根際后，適合那里的土壤環(huán)境得以迅速的繁殖。其分泌的有些物質(zhì)能抑制其它病原微生物的生存和生長，具有一定的拮抗病原菌的作用。(3)保護(hù)原有土壤性狀，減少環(huán)境污染和生態(tài)破壞。解磷微生物替代傳統(tǒng)有機(jī)肥料的使用，不僅減少了成本，而且微生物在生產(chǎn)過程中不產(chǎn)生污染物，也避免了土壤有機(jī)化的污染。(4)肥效高。篩選出來的解磷微生物可以直接作用于土壤中，也可制成菌肥施入土壤，直接將難溶性性磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的磷，生產(chǎn)過程中利用率高，減少化肥使用過程中的淋失和固化作用。因此，在當(dāng)今土壤嚴(yán)重缺磷的情況下，篩選出高效的解磷微生物，提高土壤磷的有效利用，降低農(nóng)林業(yè)的生產(chǎn)成本，保護(hù)環(huán)境和資源，具有較大的時(shí)代意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)提供了一株有機(jī)解磷菌能提高桉樹凈光合速率。本發(fā)明所述有機(jī)解磷菌為梭形桿菌屬(Zj^iflihciB^s sphaericus)菌株YP17， 所述菌株YP17的保藏號為CGMCC No. 4770。本發(fā)明的梭形桿菌屬(Xysinibacillus ^Aaeric^s)菌株YP17，已經(jīng)于2011年4 月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC No. 4770。本發(fā)明的菌株YP17可應(yīng)用于接種桉樹。所述接種的具體步驟如下
⑴將菌種點(diǎn)接入液體培養(yǎng)基，經(jīng)過4 振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為；所述液體培養(yǎng)基配制為每升液體培養(yǎng)基含有牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH 7. 2-7. 4 ；
⑵將菌液滴入血球計(jì)數(shù)板，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，得出菌液濃度； ⑶將菌液用超純水稀釋；
⑷在桉樹根際施入菌株濃度為0. 5X106cfu/ml -2. 0 X 106cfu/ml的菌液。本發(fā)明的菌株YP17具有較強(qiáng)的提高桉樹光合作用速率的能力，具有高效的解磷能力。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的菌株YP17能夠大幅提高桉樹植株的光合作用速率， 從而達(dá)到促進(jìn)植株生長的能力。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1 有機(jī)解磷菌菌株YP17的獲得
一、有機(jī)解磷菌菌株YP17的分離篩選過程如下
(1)野外采集桉樹根際土壤。土壤取自福建省永安國有林場，地處永安市城郊，經(jīng)緯度為 E117° 23，18"，N25° 56，27"。(2)有機(jī)解磷菌分離
①根際土壤懸濁液的制備在無菌室中，準(zhǔn)確稱取新鮮土壤樣品5 g，放入裝有95 ml 無菌水的250 ml三角瓶中，置搖床上振蕩20 min，使微生物細(xì)胞分散，靜置20-30 s,即成
4IO-1稀釋液；在按10倍逐步稀釋的方法，連續(xù)稀釋，制成10_4、10_5、10_6、10_7、10_8、10_9等一系列稀釋菌液，用于有關(guān)微生物的測定[12]。②采用稀釋平板涂抹法分離解磷菌時(shí)，采用10_4、10_5、10_6稀釋度，用移液器各取 IOOul的稀釋菌液于有機(jī)磷平板中央，并用接菌環(huán)在平板上涂布均勻。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。有機(jī)解磷細(xì)菌培養(yǎng)3d，觀察菌落生長情況，同時(shí)計(jì)算具有解磷作用的解磷菌的菌株數(shù)。分離解有機(jī)磷菌采用有機(jī)磷培養(yǎng)基。③用接種環(huán)挑取培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯溶磷圈或透明圈的菌落，用連續(xù)劃線的方法劃線純化，有機(jī)解磷菌于觀V培養(yǎng)4 d，得到單株具解磷能力的菌株。同時(shí)測量解磷菌的菌落直徑和透明圈直徑，計(jì)算透明圈與菌落直徑比，初步斷定菌落解磷效果。將提純的解磷菌株接種到斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)保存置于4 V冰箱備用。④培養(yǎng)液有效磷含量測定——銷銻抗比色法。取菌株培養(yǎng)液離心后的上清液200 μ 1加入50 ml容量瓶中，加水至15_20ml，加 1滴2，4- 二硝基酚指示劑，用稀堿溶液和稀酸(硫酸)調(diào)節(jié)pH值至溶液呈微黃色。用移液管加5 ml鉬銻抗顯色劑，用水定容，搖勻。30 min后，在分光光度計(jì)上用700 nm波長比色， 以空白試驗(yàn)溶液為參比液，調(diào)吸收值到零，然后測定待測液的吸收值，在工作曲線上查出顯示液的溶磷量，顏色在8 h內(nèi)可保持穩(wěn)定。⑤有機(jī)磷菌解有機(jī)磷能力的定量測定。將每升加入0. 5g的卵磷脂有機(jī)磷培養(yǎng)基在分裝于150ml的三角瓶中，每瓶30ml，滅菌后加入Iml已用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基活化 48 h的待測菌液，3次重復(fù)。置全溫振蕩培養(yǎng)箱160 r · HiirT1培養(yǎng)5d，然后取菌株培養(yǎng)液，10000 rpm離心20 min，上清液采用鉬銻抗比色法測定其磷含量，同時(shí)用pH計(jì)測定培養(yǎng)液的PH值，以加Iml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基做為參比液。離心后的沉淀用溶菌液處理 [13]，37°C水浴lh，然后4°C下離心(lOOOOr/min) 15min，取上清液定容至50ml，用鉬藍(lán)比色法測定菌體的含磷量。溶菌液將5mg溶菌酶加入到ImlTEN溶液中，現(xiàn)配現(xiàn)用。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[14]牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，瓊月旨 18. 0 g/L, pH 7. 2-7. 4。有機(jī)磷培養(yǎng)基葡萄糖(C6H12O6· H2O) 10. Og/L，(NH4) 2S04 0. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, NaCl 0. 3g/L, KCl 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 0. 03g/L, MnSO4 · 7H20 0. 03g/L, CaCO3 5. Og/L,卵磷脂 2. Og/L,瓊脂 18g/L，PH 7. 2-7. 5。(5)結(jié)果分析 ①有機(jī)磷菌平板試驗(yàn)
有機(jī)磷平板上篩選出30株具有明顯透明圈的有機(jī)解磷菌。菌株YP17，透明圈與菌落直徑的比為2. 300cm，從平板試驗(yàn)分析具有較強(qiáng)的解磷能力。②有機(jī)磷菌菌體吸收磷含量
解磷菌在分解液體中難溶性有機(jī)磷時(shí)部分有效磷會(huì)被菌體吸收利用，儲(chǔ)存在菌體內(nèi)， 為了更準(zhǔn)確的判定菌體是否具有解磷能力，被菌體吸收的磷含量不能忽略。不同菌株吸收利用磷的含量差異很大。菌株YP17，為1.095yg/ml，從菌體本身的磷含量分析可知，菌種 YP17具有較強(qiáng)的吸收磷的能力。③有機(jī)磷菌溶解的有效磷含量
測定發(fā)現(xiàn)，有機(jī)解磷菌菌株YP17溶解的有效磷含量為19. 370yg/ml,而對照僅
55.34(^8/!111，有機(jī)解磷菌菌株￥ 17的解磷能力是對照的3. 63倍。菌株YP17具有較強(qiáng)的解磷能力。④有機(jī)磷菌培養(yǎng)液pH值
進(jìn)一步測定有機(jī)解磷菌菌株YP17的培養(yǎng)液pH值為8. 07，對照為8. 18。菌株P(guān)17的培養(yǎng)液PH值比對照下降了 0. 11。結(jié)果表明，溶磷量與pH值存在相關(guān)關(guān)系，這與陳陽等[15]研究結(jié)果相一致，表明菌株P(guān)17具有較強(qiáng)的溶磷能力。二、菌株YP17鑒定
有機(jī)解磷菌菌株YP17的光學(xué)顯微鏡鑒定將菌種制成載玻片，在顯微鏡下觀察并參考 《伯杰細(xì)菌鑒定》進(jìn)行初步鑒定。[1]供試菌株YP17。[2]梭形桿菌屬(Lysinibacillus)為嚴(yán)格的專性厭氧菌，革蘭氏染色陰性，菌體呈梭狀，兩端尖細(xì)，大小為(5 10) μ m，常見到游離者為橢圓體，有時(shí)菌體中有革蘭陽性顆粒存在。無芽胞，無鞭毛。經(jīng)48小時(shí)培養(yǎng)后，菌落直徑1 2mm，不規(guī)則圓形，略凸起，灰色， 發(fā)光，透明。生化反應(yīng)不活潑，菌株多數(shù)不發(fā)酵任何糖類，少數(shù)對葡萄糖、果糖可出現(xiàn)弱發(fā)酵反應(yīng)。吲哚和DNA酶試驗(yàn)陽性，觸酶陽性，不還原硝酸鹽，在20%膽汁中不生長，脂酶試驗(yàn)陰性，主要代謝產(chǎn)物是丁酸。有機(jī)解磷菌菌株分子分類鑒定 ω供試菌株
ΥΡ17。⑵培養(yǎng)基
將菌種點(diǎn)接入液體培養(yǎng)基，經(jīng)過4 振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為。所述液體培養(yǎng)基配制為牛肉膏 3.0 g/L，蛋白胨 5. 0 g/L，氯化鈉 10.0 g/L，pH 7.2-7.4。⑶引物
利用細(xì)菌16S rDNA特異引物F27和R1492進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16]，該引物可以擴(kuò)增供試菌株幾乎全部的16S rDNA序列，引物序列如下
Primer 1 (F27) 5 ‘ -AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3 ‘ Primer2(R1492) 5 ‘ -TAG GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3 ‘；
試驗(yàn)方法
①細(xì)菌總DNA的提取
將供試菌株分別用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，大約M-48 h。采用離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(購自上海生工生物工程有限公司)提取總DNA，步驟如下
a.取1.5 ml菌體培養(yǎng)液于一滅菌EP管中，10 000 rpm離心1 min，去上清液，收集菌體。b.向菌體沉淀中加入200 μ 1緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮。c.向管中加入20 μ 1蛋白酶K溶液，混勻。d.加入220 μ 1緩沖液GB，振蕩15 s，70°C放置10 min，溶液變清亮，簡短離心以
去除管蓋內(nèi)壁的水珠。e.加入220 μ 1無水乙醇，充分振蕩混勻15 s，簡短離心以管蓋內(nèi)壁的水珠。f.將上一步所得都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000 rpm離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。g.向吸附柱CB3中加入500 μ 1緩沖液GD，12000 rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。h.向吸附柱CB3中加入700 μ 1漂洗液PW，12000 rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附
柱CB3放入收集管中。i.向吸附柱CB3中加入500 μ 1漂洗液PW，12000 rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。j.將吸附柱CB3放入收集管中，12000 rpm離心2 min，倒掉廢液，將吸附柱CB3 置于室溫放置數(shù)8 min,以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。k.將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴100 μ 1 洗脫緩沖液ΤΕ，室溫放置5 min, 12000 rpm離心2 min，將溶液收集到離心管中，一 20°C保
存?zhèn)溆?。②PCR擴(kuò)增
(1)PCR反應(yīng)體系為 10XPCR Buffer dNTP (濃度 2. 5 mmol/L) Mg2 +
引物 1 (50 μπιο ) 引物 2 (50 μπιο ) 模板DNA Tag 酶(1 U/μ 1) 補(bǔ)ddH20至總體積
權(quán)利要求
1.一株有機(jī)解磷菌，其特征在于所述有機(jī)解磷菌為梭形桿菌屬如《7ΛΛ5 sphaericus)菌株 YP17，保藏號為 CGMCC No. 4770。
2.一種如權(quán)利要求1所述的有機(jī)解磷菌的用途，其特征在于將所述有機(jī)解磷菌接種于桉樹。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的有機(jī)解磷菌的用途，其特征在于所述接種的具體步驟如下⑴將菌種點(diǎn)接入液體培養(yǎng)基，經(jīng)過4 振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為；所述液體培養(yǎng)基配制為牛肉膏3. 0 g/L，蛋白胨5. 0 g/L，氯化鈉10. 0 g/L，pH 7. 2-7. 4 ； ⑵將菌液滴入血球計(jì)數(shù)板，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，得出菌液濃度； ⑶將菌液用超純水稀釋；⑷在桉樹根際施入菌株濃度為0. 5X106cfu/ml -2. 0 X 106cfu/ml的菌液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株有機(jī)解磷菌，有機(jī)解磷菌為梭形桿菌屬(Lysinibacillussphaericus)菌株YP17，所述菌株YP17的保藏號為CGMCCNo.4770。將所述有機(jī)解磷菌接種于桉樹，能提高桉樹凈光合速率。本發(fā)明的菌株YP17具有較強(qiáng)的提高桉樹光合作用速率的能力，具有高效的解磷能力，能夠大幅提高桉樹植株的光合作用速率，從而達(dá)到促進(jìn)植株生長的能力。
文檔編號A01G7/06GK102250787SQ20111013206
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月21日
發(fā)明者俞新玲, 吳承禎, 洪偉, 洪滔, 謝安強(qiáng) 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)