專(zhuān)利名稱(chēng)：大熊貓精液冷凍保存液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物材料保存技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及大熊貓精液冷凍保存液及其制備方法。
背景技術(shù)：
大熊貓是我國(guó)的特有種，屬世界瀕危珍稀動(dòng)物，截至2004年結(jié)束的第三次全國(guó)大熊貓種群數(shù)量調(diào)查，雖然大熊貓野外種群數(shù)量由上世紀(jì)80年代的1100余只上升到1590余只，但依然沒(méi)有擺脫瀕危的境地。經(jīng)過(guò)多年的努力，我國(guó)大熊貓圈養(yǎng)繁殖水平有了很大提高，至2008年底，圈養(yǎng)種群數(shù)量已達(dá)到268只。但是，如何避免近親繁殖已成為大熊貓圈養(yǎng)繁育必須面對(duì)的問(wèn)題。通過(guò)對(duì)大熊貓精液保存技術(shù)研究，可以使遺傳性能好的雄性個(gè)體的精液得以長(zhǎng)期保存，從而為大熊貓人工授精繁育的開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為減緩因近交和遺傳漂變所造成大熊貓種群遺傳多樣性降低的速度，提高大熊貓繁殖性能、擴(kuò)大種群數(shù)量等有著重要意義。近年來(lái)，成都大熊貓繁育基地進(jìn)行了大熊貓精液冷凍保存液的研究，獲得的冷凍保存液配方為20%卵黃、12%蔗糖、5%甘油及少量ATP，用該保存液進(jìn)行大熊貓精液的冷凍保存，解凍后進(jìn)行精子活力檢查，平均為55. 79% (侯蓉等，2005.大熊貓細(xì)管凍精制備程序的建立與應(yīng)用.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，25C3))。本發(fā)明人按照該配方和方法進(jìn)行多次冷凍保存實(shí)驗(yàn)，解凍后精子活力平均為36. 56%，遠(yuǎn)低于報(bào)道中的效果。所以，至今該保存液并沒(méi)有在大熊貓精液冷凍保存中得到應(yīng)用。目前，大熊貓人工繁育中的精液冷凍保存，包括成都大熊貓繁育基地、臥龍大熊貓研究中心以及北京動(dòng)物園等，均采用美國(guó)Irvine kientific公司生產(chǎn)的TEST保存液完成。用TEST保存液在冷凍保存解凍后的精子活力為40 60% (黃炎等.2000.大熊貓電刺激采精及精液冷凍保存研究.四川師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，21 (3)；黃炎等.2000. 大熊貓精液的保存實(shí)驗(yàn).中國(guó)獸醫(yī)雜志，26(6))，經(jīng)冷凍后的精液可以在液氮中保存20 60年。采用TEST保存液進(jìn)行大熊貓精液的冷凍保存，雖然解凍后的精子活力達(dá)到了人工授精要求，但是存在有以下問(wèn)題①其配方不公開(kāi)，國(guó)內(nèi)沒(méi)有生產(chǎn)、購(gòu)買(mǎi)不方便，而且價(jià)格昂貴，每盒(5ml χ 20瓶)7000元；②保質(zhì)期短，在-10°C條件下保存期小于1年。由于大熊貓是季節(jié)性發(fā)情、每年一次，且發(fā)情期持續(xù)短，每年采精進(jìn)行冷凍保存時(shí)，需提前訂貨購(gòu)買(mǎi)TEST保存液，當(dāng)年剩存的TEST保存液在來(lái)年無(wú)法使用。另外，冷凍保存液是大熊貓人工繁育中的基礎(chǔ)試劑，需求量比較大，又是含有蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)試劑，以進(jìn)口方式并進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間保存，對(duì)于精液的即時(shí)冷凍保存會(huì)造成影響，也給工作帶來(lái)不便。所以，冷凍保存液采用現(xiàn)配現(xiàn)用方式的效果最好。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)所存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種大熊貓精液冷凍保存液及
3其制備方法，使該保存液在解凍后的精子活力滿足人工授精要求的前提下，成本低廉、制備方法簡(jiǎn)單，可以現(xiàn)配現(xiàn)用，實(shí)現(xiàn)精液的即時(shí)保存。本發(fā)明所提供的大熊貓精液冷凍保存液按IOOml配制，其組成配比為葡萄糖4 6g、果糖4 6g、檸檬酸三鈉0. 05 0. 15g、卵黃15 18ml、丙三醇6 7ml、以及青霉素和鏈霉素各0. 5萬(wàn)IU 2萬(wàn)IU，余量為雙蒸水。所述冷凍保存液的優(yōu)化配比為葡萄糖5g、果糖5g、檸檬酸三鈉0. lg、卵黃16ml、 丙三醇6. 7ml、以及青霉素和鏈霉素各1萬(wàn)IU，余量為雙蒸水。由于大熊貓精液呈弱堿性， pH在7. 2 7. 5，以個(gè)體不同有所差異，為避免酸堿度變化對(duì)精子的影響，所述冷凍保存液的PH為7.4。本發(fā)明冷凍保存液中，葡萄糖、果糖和卵黃為精子的代謝提供能量，因?yàn)樵诶鋬鲞^(guò)程中和解凍后精子都需要能量維持自身的新陳代謝；檸檬酸三鈉是維持保存液中適當(dāng)?shù)臐B透壓和電解質(zhì)平衡，以保證精子內(nèi)外的滲透壓平衡，其還具有緩沖作用，可以中和精子代謝產(chǎn)生的酸，防止PH的改變；由于冷卻過(guò)程中的精液要從體溫降至4 5°C，并需平衡一段時(shí)間，卵黃中的卵磷脂可以保護(hù)精子免受傷害；在冷凍和解凍的操作中，精子內(nèi)的組織液和精液液體都要經(jīng)歷由液態(tài)到固態(tài)的變化，會(huì)出現(xiàn)冰晶狀態(tài)，丙三醇能夠保護(hù)精子免受冰晶的傷害；青、鏈霉素主要是控制操作過(guò)程中的微生物污染。所述大熊貓精液冷凍保存液的制備方法為，根據(jù)制備量按上述比例稱(chēng)、量各組分， 將固體組分用雙蒸水溶解，再加入溶解后的青霉素和鏈霉素溶液，混合均勻，然后吸取鮮卵黃加至混合液中攪拌均勻，再將丙三醇加入混合液中攪拌均勻，余量用雙蒸水補(bǔ)足，充分混合均勻，置于4 5°C保存?zhèn)溆?。由于制備操作的環(huán)境條件原因，本發(fā)明在冷凍保存液中加入青霉素和鏈霉素，目的是抑制環(huán)境帶來(lái)的有害細(xì)菌污染，但其也會(huì)對(duì)精子造成一定傷害，若在無(wú)菌條件下或清潔實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作配制，完全可以不加青霉素和鏈霉素，從而使精子免受抗生素的傷害。所述大熊貓精液冷凍保存液的使用方法為，先把獲取的精液移入帶蓋的離心管中，按1 1比例加入冷凍保存液，緩慢搖動(dòng)使其充分混勻，在鏡檢后活力達(dá)到輸精要求，即放入4 5°C冰箱中平衡3小時(shí)以上，平衡結(jié)束后再次鏡檢，活力達(dá)到輸精要求后倒管，封口后做標(biāo)記，最后置入液氮罐中長(zhǎng)期保存。在人工授精使用時(shí)，將凍存管從液氮罐中取出，于 37°C溫水中解凍1分鐘，剪開(kāi)凍存管即可用于人工授精，同時(shí)進(jìn)行精子活力檢查。采用本發(fā)明冷凍保存液對(duì)大熊貓精液進(jìn)行冷凍保存，解凍后精子的活力符合人工授精的要求，平均活力> 58 %，最高為65 %，檢測(cè)方法采用侯蓉等，2005.大熊貓細(xì)管凍精制備程序的建立與應(yīng)用.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，25(3)的方法。由于冷凍保存液含有蛋白質(zhì)，容易受環(huán)境的變化而變性。而本發(fā)明最重要的是可以按照需要量現(xiàn)配現(xiàn)用，不用擔(dān)心冷凍保存液的變性；其制備方法簡(jiǎn)便，一人在15分鐘內(nèi)即可完成。目前，陜西省珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)研究中心一直在采用本發(fā)明的冷凍保護(hù)液對(duì)遺傳性能好的雄性大熊貓的精液進(jìn)行低溫冷凍保存，并使用凍存精液進(jìn)行人工授精，開(kāi)展大熊貓的搶救繁育工作，取得了很好的效果。與美國(guó)TEST保存液相比，本發(fā)明的冷凍保存液所需的試劑和原料取材方便、價(jià)格便宜，配制IOOmL冷凍保存液的成本約50元，并且制備方法簡(jiǎn)便，可以現(xiàn)配現(xiàn)用，實(shí)現(xiàn)精液的即時(shí)保存；置于4 5°C可保存1周，在-10°C條件下保存1月以上；冷凍后的精液在液氮中可保存50年以上。為大熊貓人工授精提供符合要求的精液，使大熊貓人工繁育和精液長(zhǎng)期保存的成本大大降低，對(duì)于提高大熊貓繁殖性能、擴(kuò)大種群數(shù)量都具有重要意義。
具體實(shí)施例方式為了保證本發(fā)明技術(shù)方案的可比性和檢測(cè)結(jié)果的一致性，以下實(shí)例中精子活力檢測(cè)方法均采用“侯蓉等，2005.大熊貓細(xì)管凍精制備程序的建立與應(yīng)用.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 25(3)，，的檢測(cè)方法，由相同人員進(jìn)行具體操作。實(shí)施例1、按IOOml配制稱(chēng)、量葡萄糖4g、果糖6g、檸檬酸三鈉0. lg、卵黃15mL、 丙三醇6mL、青霉素和鏈霉素各1萬(wàn)IU，余量為雙蒸水。先將固體組分用適量雙蒸水充分溶解，再用注射器加入溶解后的青霉素和鏈霉素溶液，混合均勻；用移液管吸取新鮮卵黃加至混合液中攪拌均勻，再用移液管將丙三醇加入混合液中攪拌均勻，用雙蒸水補(bǔ)足100ml，充分混合均勻，置于4 5°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ栽摾鋬霰４嬉簩?duì)圈養(yǎng)秦嶺大熊貓精液進(jìn)行冷凍保存，解凍后精子的活力平均為 60%。主要原因卵黃含量低，使精子從體溫降至5°C的過(guò)程中卵磷脂和脂蛋白的量不夠， 導(dǎo)致部分精子遭受低溫的傷害；丙三醇含量低，沒(méi)有足夠滲入精子內(nèi)部，從而在低溫冷凍過(guò)程中，使得精子內(nèi)液體形成了冰晶物質(zhì)，導(dǎo)致部分精子受到冰晶破壞。2007年，用該冷凍保存液對(duì)一只7歲齡雄性大熊貓的精液進(jìn)行冷凍保存，1月后解凍檢查活力為56%，凍存13個(gè)月后檢查活力仍為56%，用該精液對(duì)一只發(fā)情的雌性秦嶺大熊貓進(jìn)行人工授精，該大熊貓成功受孕。實(shí)施例2、按200ml配制稱(chēng)、量葡萄糖10g、果糖10g、檸檬酸三鈉0. 2g、卵黃32mL、 丙三醇13. 4mL、青霉素和鏈霉素各2萬(wàn)IU，余量為雙蒸水。先將固體組分用適量雙蒸水充分溶解，再用注射器加入溶解后的青霉素和鏈霉素溶液，混合均勻；用移液管吸取新鮮卵黃加至混合液中攪拌均勻，再用移液管將丙三醇加入混合液中攪拌均勻，用雙蒸水補(bǔ)足200ml， 充分混合均勻，置于4 5°C冰箱保存?zhèn)溆?。以該冷凍保存液?duì)圈養(yǎng)秦嶺大熊貓精液(30余份)進(jìn)行冷凍保存，解凍后檢測(cè)精子活力平均為65%。用該冷凍保存液對(duì)采集到的大熊貓精液進(jìn)行冷凍保存操作，分別解凍后，對(duì)發(fā)情期的雌性秦嶺大熊貓進(jìn)行了人工授精，成功繁育大熊貓4胎6仔2008年繁育1 胎2仔；2009年繁育2胎3仔；2010年繁育1胎1仔。實(shí)施例3、按IOOml配制稱(chēng)、量葡萄糖5g、果糖5g、檸檬酸三鈉0. 15g、卵黃18mL、 丙三醇7mL、青霉素和鏈霉素各1萬(wàn)IU，余量為雙蒸水。先將固體組分用適量雙蒸水充分溶解，再用注射器加入溶解后的青霉素和鏈霉素溶液，混合均勻；用移液管吸取新鮮卵黃加至混合液中攪拌均勻，再用移液管將丙三醇加入混合液中攪拌均勻，用雙蒸水補(bǔ)足100ml，充分混合均勻，置于4 5°C冰箱保存?zhèn)溆?。以該冷凍保存液?duì)圈養(yǎng)秦嶺大熊貓精液進(jìn)行冷凍保存，解凍后精子的活力平均為 58%。主要原因是緩沖物檸檬酸三鈉含量高，導(dǎo)致PH值偏高；卵黃含量高，使部分精子產(chǎn)生聚集現(xiàn)象，影響精子的直線運(yùn)動(dòng)；丙三醇含量高，對(duì)精子的毒害超過(guò)了保護(hù)作用，導(dǎo)致部分精子頂替蛋白遭到破壞，從而造成了精子活力的降低。2008年，用該冷凍保存液對(duì)一只23歲雄性大熊貓的精液進(jìn)行冷凍保存，凍存20天后檢查活力為58%，凍存1年后檢查活力仍為58%。2009年用該精液對(duì)一只發(fā)情的雌性大熊貓進(jìn)行人工授精，該大熊貓成功受孕。
權(quán)利要求
1.一種大熊貓精液冷凍保存液，其特征在于，按IOOml配制其組成配比為葡萄糖4 6g、果糖4 6g、檸檬酸三鈉0. 05 0. 15g、卵黃15 18ml、丙三醇6 7ml、以及青霉素和鏈霉素各0. 5萬(wàn)IU 2萬(wàn)IU，余量為雙蒸水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的冷凍保存液，其特征在于，按IOOml配制其組成配比為葡萄糖5g、果糖5g、檸檬酸三鈉0. lg、卵黃16ml、丙三醇6. 7ml、以及青霉素和鏈霉素各1萬(wàn)IU， 余量為雙蒸水；冷凍保存液的PH為7. 4。
3.制備權(quán)利要求1所述大熊貓精液冷凍保存液的方法，其特征在于，按所述比例稱(chēng)、量各組分，將固體組分用雙蒸水溶解，再加入溶解后的青霉素和鏈霉素溶液混合均勻，然后吸取鮮卵黃加至混合液中攪拌均勻，再將丙三醇加入混合液中攪拌均勻，余量用雙蒸水補(bǔ)足， 充分混合均勻，置于4 5°C保存。
全文摘要
一種大熊貓精液冷凍保存液及其制備方法，本發(fā)明采用葡萄糖、果糖、檸檬酸三鈉、卵黃、丙三醇以及雙蒸水配制；先將固體組分溶解后，再加入液體組分充分混合均勻而成。采用本發(fā)明的冷凍保存液對(duì)大熊貓精液冷凍保存，解凍后精子的活力符合人工授精的要求，平均活力≥58％，最高為65％；與美國(guó)TEST保存液相比，所需的試劑和原料取材方便、價(jià)格便宜，配制100mL冷凍保存液的成本約50元，并且制備方法簡(jiǎn)便，可以現(xiàn)配現(xiàn)用，實(shí)現(xiàn)精液的即時(shí)保存；冷凍后的精液在液氮中可保存50年以上。為大熊貓人工授精提供符合要求的精液，使大熊貓人工繁育和精液長(zhǎng)期保存的成本大大降低，對(duì)于提高大熊貓繁殖性能、擴(kuò)大種群數(shù)量都具有重要意義。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102246744SQ201110112099
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月3日
發(fā)明者吳曉民, 封托, 車(chē)?yán)? 金學(xué)林, 馬清義 申請(qǐng)人:陜西省動(dòng)物研究所