專利名稱：一種改良水稻籽粒氨基酸品質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。更具體涉及一種改良水稻籽粒氨基酸品質(zhì)的 方法，具體包含了應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法將一個(gè)蜘蛛拖絲蛋白基因的CDNA片段通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 水稻，使該片段在水稻籽粒中表達(dá)，以提高水稻籽粒氨基酸含量，創(chuàng)造水稻品質(zhì)改良新材料 的方法。
背景技術(shù)：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，然而其籽粒中蛋白質(zhì)和氨基酸特別是賴氨 酸和色氨酸含量非常低，由于蛋白質(zhì)和必需氨基酸含量是反應(yīng)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的關(guān)鍵因子，因 此提高水稻籽粒氨基酸含量特別是必需氨基酸含量成為水稻品質(zhì)改良的重要任務(wù)。目前，在水稻中未發(fā)現(xiàn)高賴氨酸和高色氨酸的突變體，因此，提高水稻籽粒的氨基 酸含量主要集中在用基因工程的方法研究上。Lee等Q001)將玉米賴氨酸反應(yīng)不敏感的合 酶基因dhps ( 二氫吡啶二羧酸合成酶)的全長(zhǎng)cDNA連上水稻籽粒專一性谷蛋白GluB-I的 啟動(dòng)子構(gòu)建成嵌合基因，轉(zhuǎn)化水稻，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因材料的未成熟種子中游離賴氨酸含量要高 于野生型植株，但其成熟種子中的游離氨基酸含量和野生型差異不明顯。mi等利用 微彈法，將編碼tRNA-lys (賴氨酸擺動(dòng)密碼子)的基因轉(zhuǎn)入水稻，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因材料種子的賴 氨酸含量提高了 6%，但其遠(yuǎn)不足以滿足人們對(duì)其含量的需求。也有研究表明在水稻中過(guò)量 表達(dá)色氨酸合酶基因0ASA1D，能夠使水稻種子中的色氨酸顯著增加，但轉(zhuǎn)基因材料的產(chǎn)量、 育性以及種子萌發(fā)等表現(xiàn)均出現(xiàn)缺陷，而很難加以應(yīng)用(Wakasa et al，2006)。蜘蛛(Araneus ventricosue)拖絲蛋白(Dragline)纖維以其特殊的溶解特性和 力學(xué)特性引人注目。利用人工改造的蜘蛛拖絲蛋白基因可以在動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌以及植物如 土豆和煙草中產(chǎn)生蜘蛛拖絲蛋白(Pan et al,2006)；有人嘗試應(yīng)用蜘蛛絲蛋白基因轉(zhuǎn)化海 島棉來(lái)提高棉花纖維品質(zhì)，但不清楚其效果如何(Huang et el，2004)。目前，利用蜘蛛拖絲 蛋白基因來(lái)改良作物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的研究尚未見報(bào)道。本發(fā)明的目的是將蜘蛛拖絲蛋白(Dragline)基因的一段cDNA片段，用專一性谷 蛋白GluB-I啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，轉(zhuǎn)化水稻，使這段cDNA片段在水稻籽粒中特異表達(dá)，以提高水稻 籽粒氨基酸含量，改良水稻籽粒品質(zhì)，創(chuàng)造水稻品質(zhì)改良新材料。本發(fā)明在國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道，所在課題組也未公開發(fā)表涉及本發(fā)明內(nèi)容的文章，本 發(fā)明在國(guó)內(nèi)外公眾未知。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種改良水稻籽粒氨基酸品質(zhì)的方法，方法易行，操 作簡(jiǎn)便，包括通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法，把蜘蛛拖絲蛋白(Dragline)基因的一段cDNA片段和水稻籽 粒專一性谷蛋白GluB-I啟動(dòng)子的融合基因轉(zhuǎn)化水稻，獲得轉(zhuǎn)基因植株；結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(PCR)和分子雜交方法，生化分析方法以及農(nóng)藝性狀的調(diào)查，在轉(zhuǎn)基因植株后代中選育 氨基酸顯著提高、單株產(chǎn)量不變或有提高的轉(zhuǎn)基因株系，創(chuàng)造水稻品質(zhì)改良新材料。
一種改良水稻籽粒氨基酸品質(zhì)的方法，其步驟是1、從蜘蛛中分離的一段拖絲蛋白(Dragline)基因的cDNA片段，該cDNA片段由 905個(gè)堿基組成，編碼264個(gè)氨基酸，富含甘氨酸(31 % )和丙氨酸8 % )(圖1)。將它 與水稻籽粒專一性谷蛋白GluB-I啟動(dòng)子酶切連接連到表達(dá)載體PCAMBIA1300上(Cambia 公司產(chǎn)品)，構(gòu)建重組載體；2、利用根癌農(nóng)桿菌(Takara公司產(chǎn)品)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法將重組載體導(dǎo)入水稻品 種Dongjing中，獲得轉(zhuǎn)基因植株；3、利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)TO代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)，通過(guò)Northern 雜交檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)入片段的表達(dá)，通過(guò)Southern雜交鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的整 合拷貝數(shù)，選擇含單拷貝的轉(zhuǎn)入片段、且正常結(jié)實(shí)的轉(zhuǎn)基因植株，收獲單株自交種子；4、將步驟3選留的轉(zhuǎn)基因植株的種子種成家系(Tl代)，繼續(xù)利用PCR對(duì)Tl代單 株進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)，利用Northern雜交方法對(duì)陽(yáng)性單株檢測(cè)轉(zhuǎn)入片段的表達(dá)，結(jié)合田間表現(xiàn) 選擇多個(gè)表現(xiàn)優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因單株，自交留種；5、繼續(xù)種植步驟4中選留的目標(biāo)單株成T2代家系，利用PCR對(duì)T2代單株進(jìn)行陽(yáng) 性檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性單株進(jìn)行農(nóng)藝性狀考察和水稻種子氨基酸分析，從中選擇表型穩(wěn)定，氨基酸 品質(zhì)和農(nóng)藝性狀有較大改善的純合單株，自交留種；6、對(duì)選留的純合單株進(jìn)行表型選擇，培育新材料。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果A、在水稻籽粒中表達(dá)來(lái)自蜘蛛拖絲蛋白(Dragline)基因的一段cDNA片段可以提 高水稻籽粒氨基酸含量，特別是必需氨基酸含量，從而提高了水稻籽粒營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，同時(shí)，單 株產(chǎn)量也有一定提高；B、本方法采用轉(zhuǎn)基因方法提高水稻籽粒品質(zhì)，改良周期短，效率高；C、本方法可以直接應(yīng)用于其他作物品質(zhì)的改良實(shí)踐；D、將蜘蛛拖絲蛋白(Dragline)基因的一段cDNA片段，用籽粒專一性谷蛋白 GluB-I啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，轉(zhuǎn)化水稻，使該段cDNA在水稻籽粒中特異表達(dá)，方法易行，操作簡(jiǎn)便， 提高了水稻籽粒氨基酸含量，增加了單株產(chǎn)量，為水稻品質(zhì)改良創(chuàng)造了新材料。本發(fā)明所產(chǎn) 生的材料能直接應(yīng)用于制備必需氨基酸等醫(yī)藥制品和飼料產(chǎn)品，對(duì)促進(jìn)人體健康和預(yù)防疾 病以及水稻的可持續(xù)生產(chǎn)等具有極其重要的意義。


圖1為一種轉(zhuǎn)化所用cDNA片段的核苷酸序列以及氨基酸序列。該cDNA片段有905個(gè)堿基組成，編碼264個(gè)氨基酸。圖2為一種重組載體構(gòu)建示意圖。先將谷蛋白GluB-I啟動(dòng)子(Glb)連接到表達(dá)載體pCAMBIA1300上形成中間載體， 再將蜘蛛拖絲蛋白基因的cDNA片段連接到中間載體形成重組載體。圖3為一種TO代轉(zhuǎn)基因植株陽(yáng)性檢測(cè)示意圖。第2泳道為分子量標(biāo)記，第3泳道為陽(yáng)性對(duì)照(重組載體擴(kuò)增結(jié)果)，第4-5泳道 為陰性對(duì)照(野生型Dongjing擴(kuò)增結(jié)果)，第6-19泳道為部分TO代轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增結(jié)果；圖4為一種Northern雜交檢測(cè)TO帶轉(zhuǎn)基因植株導(dǎo)入基因片段的表達(dá)量示意圖。
上排為rRNA，下排為各單株籽粒RNA與探針雜交結(jié)果。圖5A為一種Southern雜交檢測(cè)基因整合的拷貝數(shù)示意圖。有3個(gè)為單拷貝轉(zhuǎn)化植株。圖5B為一種Southern雜交檢測(cè)基因整合的拷貝數(shù)示意圖。有3個(gè)單拷貝植株。圖6A為一種Northern雜交檢測(cè)單拷貝單株的Tl代家系的目標(biāo)基因表達(dá)量示意 圖。有9個(gè)轉(zhuǎn)化植株的轉(zhuǎn)入片段得到表達(dá)。圖6B為一種Northern雜交檢測(cè)單拷貝單株的Tl代家系的目標(biāo)基因表達(dá)量示意 圖。有6個(gè)轉(zhuǎn)化植株的轉(zhuǎn)入片段得到表達(dá)。圖6C為一種Northern雜交檢測(cè)單拷貝單株的Tl代家系的目標(biāo)基因表達(dá)量示意 圖。有6個(gè)轉(zhuǎn)化植株的轉(zhuǎn)入片段得到表達(dá)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過(guò)以下詳細(xì)的實(shí)施例給出。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā) 明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實(shí)施例1 重組載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的建立(1)、根據(jù)圖2的技術(shù)路線，將帶谷蛋白GluB-I啟動(dòng)子(Glb)的質(zhì)粒pUC18_Glb (根 據(jù)EMBL序列)(5433314進(jìn)行PCR擴(kuò)增克隆到pUC18載體(Takara公司產(chǎn)品)上，方法參照 Lee etal,2001,Constitutive and seed-specific expression of a maize lysinefeedb ack-insensitivedihydrodipioolinate synthase gene leads to increased free lysine levels in rice seedsMolecular Breeding 8 :75-84)用 EcoR I 禾口 Hind III 雙酶切，分 離回收目的片段，與用EcoR I和Hind III雙酶切后的pCAMBIA1300 (Cambia公司產(chǎn)品)用 T4連接酶連接形成中間載體，再將從蜘蛛中分離克隆的一段蜘蛛拖絲蛋白(Dragline)基 因的cDNA片段(序列見圖1)用Kpn I和Mc I雙酶切，分離回收目標(biāo)片段，與用Kpn I和 Sac I雙酶切過(guò)中間載體用T4連接酶連接形成重組載體，以上限制性內(nèi)切酶(EcoR I Hind IIIKpn I和Sac I)和T4連接酶均購(gòu)于Takara公司；(2)、將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α (Takara公司產(chǎn)品)，在含X-Gal、IPTG 和卡那霉素(上海生工公司產(chǎn)品)的抗性培養(yǎng)基上挑選白色單菌落；(3)、將挑選的白色單菌落富集抽提質(zhì)粒，用EcoR I和Hind III雙酶切后電泳檢 測(cè)，挑選連接正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105(Takara公司產(chǎn)品)中，轉(zhuǎn)化后的菌株命名為 Sl ；上述分子克隆方法及試劑配方參照J(rèn).薩姆布魯克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三 版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，2002。實(shí)施例2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(1)、誘導(dǎo)
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將成熟的水稻品種(Dongjign韓國(guó)公開的粳稻品種)種子去殼，然后依次用70% 體積比的乙醇處理1分鐘，0. 15%濃度的氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；用滅菌水 洗種子4-5次；將種子放在粳稻誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫 度 25 士 1°C。O)、繼代挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于粳稻繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2-3 周，溫度25士 1°C。(3)、預(yù)培養(yǎng)挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于粳稻預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培4-5天，溫度 25 士 1°C。0)、農(nóng)桿菌培養(yǎng)在帶有卡那霉素抗性(上海生工公司產(chǎn)品)選擇的LA培養(yǎng)基(LA培養(yǎng)基的配制 參照J(rèn).薩姆布魯克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，2002)上 預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌株Sl兩天，溫度；刮取農(nóng)桿菌至懸浮培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，溫度^°C。(5)、侵染將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅好菌的瓶子內(nèi)；調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌Sl的懸浮液至0D_ 0. 8-1. 0 ；將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放 置在粳稻共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20°C。(6)、篩選用滅菌水洗滌愈傷8遍；浸泡在含400毫克/L羧芐青霉素(CN)(上海生工公司產(chǎn) 品)的滅菌水中30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；轉(zhuǎn)移愈傷至含有250mg/L羧芐 青霉素(CN)、50mg/L潮霉素(Hn) (Roche公司產(chǎn)品)粳稻選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2_3次，每 次2周。(7)、分化將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至粳稻分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26。C。(8)、生根剪掉再生苗分化時(shí)產(chǎn)生的根；然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周， 溫度^°C。(9)、移栽洗掉再生植株根上的殘留培養(yǎng)基，移入缽中盆栽，同時(shí)在最初的幾天保持水分濕 潤(rùn)，待植株存活健壯后移入大田。實(shí)施例3 取轉(zhuǎn)基因植株葉片抽提DNA，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，PCR程序94°C預(yù)變性5 分鐘；33個(gè)循環(huán)(94°C變性1分鐘；55°C退火1分鐘；72°C延伸2分鐘)，72°C延伸7分鐘；) 檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，能擴(kuò)增出1. 2kb大小條帶的單株即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化單株(圖幻。抽提陽(yáng)性 單株籽粒的RNA進(jìn)行Northern雜交檢測(cè)轉(zhuǎn)入片段在籽粒中的表達(dá)，陽(yáng)性單株的轉(zhuǎn)入片段全 部表達(dá)(圖4)。抽提陽(yáng)性單株DNA大樣分別用Mc I和)(ba I (Takara公司產(chǎn)品)酶切， 進(jìn)行Southern雜交鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化單株的片段整合拷貝數(shù)，得到3個(gè)單拷貝的獨(dú)立轉(zhuǎn)化植 株(圖5)。DNA抽提、RNA抽提、PCR反應(yīng)體系、Southern和Northern雜交等相關(guān)技術(shù)參照J(rèn).薩姆布魯克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，2002。實(shí)施例4 將選留的3個(gè)單拷貝轉(zhuǎn)基因單株的種子種成Tl代家系，由于Tl代會(huì)分離，因此進(jìn) 一步利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(方法同實(shí)施例3)檢測(cè)各家系中的陽(yáng)性單株，對(duì)陽(yáng)性單株 抽提籽粒RNA進(jìn)行Northern雜交檢測(cè)轉(zhuǎn)入片段的表達(dá)(方法同實(shí)施例3，圖6)，結(jié)合田間 表現(xiàn)各家系選一個(gè)含有目標(biāo)片段且目標(biāo)片段正常表達(dá)的單株，自交收種；實(shí)施例5 將實(shí)施例4中選留的3個(gè)單株的種子種成T2代家系，繼續(xù)利用PCR(方法同實(shí)施 例3)檢測(cè)各家系中的陽(yáng)性單株，其中家系3和家系5已經(jīng)純合穩(wěn)定(表1)?？疾旒蚁?和 家系5的主要農(nóng)藝性狀并分析籽粒氨基酸含量，從中選擇3個(gè)氨基酸含量提高且田間表現(xiàn) 良好的純合單株(SPD1、SPD2和SPD3)。表1 T2代陽(yáng)性植株率(陽(yáng)性植株數(shù)/檢測(cè)植株數(shù))
權(quán)利要求
1. 一種改良水稻籽粒氨基酸品質(zhì)的方法，其步驟是A、從蜘蛛中分離的一段拖絲蛋白基因的cDNA片段，該cDNA片段由905個(gè)堿基組成，編 碼264個(gè)氨基酸，富含甘氨酸和丙氨酸，將它與水稻籽粒專一性谷蛋白GluB-I啟動(dòng)子酶切 連接連到表達(dá)載體PCAMBIA1300上，構(gòu)建重組載體；B、利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法將重組載體導(dǎo)入水稻中，獲得轉(zhuǎn)基因植株；C、利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)TO代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)，通過(guò)Northern雜交檢測(cè)陽(yáng) 性轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)入片段的表達(dá)，通過(guò)Southern雜交鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的整合拷貝數(shù)，選 擇含單拷貝的轉(zhuǎn)入片段且正常結(jié)實(shí)的轉(zhuǎn)基因植株，收獲單株自交種子；D、將步驟(C)選留的轉(zhuǎn)基因植株的種子種成家系Tl代，繼續(xù)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR 對(duì)Tl代單株進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)，利用Northern雜交檢測(cè)陽(yáng)性單株轉(zhuǎn)入片段的表達(dá)，結(jié)合田間表 型選擇轉(zhuǎn)入片段表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，自交留種；E、繼續(xù)種植步驟(D)中選留的目標(biāo)單株成T2代家系，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR對(duì)T2代 單株進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性單株進(jìn)行農(nóng)藝性狀考察和籽粒氨基酸分析，從中選擇表型穩(wěn)定， 氨基酸品質(zhì)和農(nóng)藝性狀有較大改善的純合單株，自交留種；F、對(duì)選留的純合單株進(jìn)一步進(jìn)行表型選擇，培育新材料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改良水稻籽粒氨基酸品質(zhì)的方法，步驟是A、把從蜘蛛中分離的一段拖絲蛋白基因的cDNA片段與谷蛋白啟動(dòng)子融合，構(gòu)建重組載體；B、利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法將重組載體導(dǎo)入水稻中，獲得轉(zhuǎn)化植株；C、利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)，收獲陽(yáng)性單株自交種子；D、將選留的T0代陽(yáng)性單株的種子種成家系(T1)，對(duì)T1代單株進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)；E、繼續(xù)種植T1代陽(yáng)性單株種子成T2代家系，從中選擇氨基酸品質(zhì)提高的純合單株，自交留種；F、對(duì)選留的純合單株進(jìn)一步進(jìn)行表型選擇，培育新材料。方法易行，操作簡(jiǎn)便，在水稻籽粒中表達(dá)來(lái)自蜘蛛拖絲蛋白基因的cDNA片段提高水稻籽粒氨基酸含量，提高了籽粒營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)；提高水稻籽粒品質(zhì)，效率高；應(yīng)用于作物品質(zhì)的改良。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102144568SQ20111010922
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者余四斌, 孫文強(qiáng), 李敏, 金冬紅, 陳炳來(lái) 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)