專利名稱：具有雄性不育基因tcl的載體的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的基因、編碼的蛋白及啟動子、質(zhì)粒和宿主細(xì)胞，具體涉及一種具有雄性不育基因TCL的載體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是我國最主要的糧食作物之一，我國有60%以上人口以稻米為主食，是世界上最大的稻米生產(chǎn)國和消費(fèi)國。我國水稻年播種面積3000萬公頃，占世界的20% ；產(chǎn)量 1. 85億噸，占世界的近1/3，單位面積產(chǎn)量6. 35噸/公頃，比全球平均產(chǎn)量3. 85噸/公頃高 65%。水稻在我國谷物產(chǎn)量中始終保持在總量的40%左右，占據(jù)了近半壁江山，其中一個(gè)重要的原因就是水稻雄性不育系的發(fā)明與雜種優(yōu)勢的廣泛應(yīng)用發(fā)揮了舉足輕重的作用。生物界不同遺傳背景的親本配組所產(chǎn)生的Fl代都比其父母代具有更強(qiáng)的生長勢和抗逆性，這就是雜種優(yōu)勢。作物雜種優(yōu)勢利用是提高作物產(chǎn)量的重要途徑，雜交水稻的推廣應(yīng)用，為中國乃至世界的糧食增產(chǎn)做出了巨大貢獻(xiàn)，而作物雄性不育系是有效利用雜種優(yōu)勢的前提和基礎(chǔ)。利用水稻雄性不育系生產(chǎn)雜交種子，使水稻的雜種優(yōu)勢在生產(chǎn)上得以廣泛應(yīng)用才成為可能。因此，研究選育新型水稻雄性不育系并對其調(diào)控機(jī)理進(jìn)行深入研究，是進(jìn)一步發(fā)掘水稻優(yōu)質(zhì)和超高產(chǎn)品種必要前提和基礎(chǔ)。水稻雄性器官花藥的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到花藥細(xì)胞的分裂分化，花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂和花粉的有絲分裂等發(fā)育過程，任何發(fā)育過程的異常都可影響花粉的正常發(fā)育。絨粘層是花藥壁細(xì)胞中的最內(nèi)層細(xì)胞，與花粉母細(xì)胞和小孢子直接接觸，該層細(xì)胞是花藥各層細(xì)胞中代謝最活躍和旺盛的一層細(xì)胞。在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂完成以后，絨氈層細(xì)胞通過程序性死亡的方式開始降解，并為小孢子的進(jìn)一步發(fā)育和成熟合成和分泌大量的營養(yǎng)物質(zhì)及外壁組成成份，因此該層細(xì)胞的死亡是形成成熟和可育花粉粒的基礎(chǔ)。另一方面，絨氈層的降解與花粉外壁的正常形成存在著相互依賴，密不可分的一種關(guān)系?，F(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)是建立在對植物正常發(fā)育過程分子調(diào)控機(jī)制充分研究和認(rèn)識的基礎(chǔ)上加以應(yīng)用的，因此，深入研究水稻絨氈層發(fā)育及小孢子成熟過程、分子調(diào)控機(jī)理及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并加以應(yīng)用是在生產(chǎn)上研發(fā)新型雄性不育株系的基礎(chǔ)。阻礙絨氈層細(xì)胞的死亡及小孢子外壁正常發(fā)育是培育水稻雄性不育株系的有效途徑。但是目前對水稻絨氈層發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及花粉外壁組成成份及其分子調(diào)控機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)還不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有雄性不育基因TCL的載體的應(yīng)用。本發(fā)明的TCL基因?yàn)榛ㄋ幪禺愋员磉_(dá)基因，該基因具有維持水稻花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡的功能，該基因功能的缺失導(dǎo)致絨氈層細(xì)胞發(fā)生壞死，繼而影響花粉及其外壁的發(fā)育，導(dǎo)致水稻的雄性不育。本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的第一方面，本發(fā)明涉及一種雄性不育基因TCL，該基因編碼如下(a)或(b)所述的蛋白質(zhì)(a)由SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有影響絨氈層細(xì)胞程序性死亡活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述基因的堿基序列如SEQ ID N0:1所示。第二方面，本發(fā)明還涉及一種啟動所述基因表達(dá)的啟動子，其堿基序列如SEQ ID NO 3所示。第三方面，本發(fā)明還涉及前述的水稻雄性不育基因TCL編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。第四方面，本發(fā)明還涉及一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含堿基序列如SEQ ID NO :1所示的基因。優(yōu)選地，所述質(zhì)粒還包含堿基序列如SEQ ID NO 3所示的啟動子。第五方面，本發(fā)明還涉及一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含堿基序列如SEQ ID NO 1 所示的基因。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞還包含堿基序列如SEQ ID NO 3所示的啟動子。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明在發(fā)掘和利用水稻小孢子早期絨氈層的程序性死亡對花粉及其外壁、育性方面具有重要作用，可以通過基因敲除或抑制TCL基因?qū)е陆q氈層細(xì)胞的異常死亡獲得新的水稻雄性不育系，用來生產(chǎn)雜交種子， 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用。


圖Itcl突變體植株的形態(tài)學(xué)觀察示意圖；圖2tcl突變體花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡信號檢測示意圖；圖3TCL座位定位示意圖；圖4tcl互補(bǔ)植株的形態(tài)學(xué)觀察圖；圖5tcl突變體和野生型9522花藥組織切片示意圖；圖6TCL啟動子活性分析圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。術(shù)語“編碼影響絨氈層細(xì)胞程序性死亡活性的蛋白的基因”指編碼具有調(diào)控花粉外壁角質(zhì)單體合成的單氧酶活性多肽的核苷酸序列，如堿基序列如SEQ ID NO :1中第1 2040位所示的核苷酸序列及其簡并序列。簡并序列是指，位于SEQ ID NO :1序列的編碼框第1 2040位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO :1中第1 2040位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO :2所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO :1中從核苷酸第1 2040位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO :1中從核苷酸第1 2040位的核苷酸序列的同源性至少70 %，較佳地至少80 %，更佳地至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的調(diào)控水稻花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡的相同功能的蛋白的SEQ ID NO :1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于) 若干個(gè)(通常為1 90個(gè)，較佳地1 60個(gè)，更佳地1 20個(gè)，最佳地1 10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為 30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。術(shù)語“影響絨氈層細(xì)胞程序性死亡活性的蛋白”指具有調(diào)控水稻花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡蛋白活性的SEQ ID NO :2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然調(diào)控水稻花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡的PHD finger蛋白SEQ ID NO :2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1 50個(gè)，較佳地1 30個(gè)，更佳地1 20個(gè)，最佳地1 10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。在本領(lǐng)域中， 用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能；在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。實(shí)施例中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本實(shí)施例的水稻花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡相關(guān)多肽時(shí)，可以將調(diào)控水稻花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡蛋白編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成調(diào)控水稻花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡相關(guān)蛋白表達(dá)載體。術(shù)語“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ；如果啟動子調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄， 那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。術(shù)語“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞，常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、水稻細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。相關(guān)核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本實(shí)施例所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
除了用重組法產(chǎn)生之外，實(shí)施例中蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進(jìn)行?？梢苑謩e化學(xué)合成本實(shí)施例蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。術(shù)語“啟動子”指為RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。在DNA指導(dǎo)下RNA的合成稱為轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄的起始由DNA的啟動子控制。實(shí)施例是利用γ射線對粳稻9522品系進(jìn)行處理，種植后在F2代挑選花藥發(fā)育異常的突變體，挑選分離比為3 1的隱性單基因突變體為研究對象。獲得一新的水稻隱性雄性不育突變體tcl。通過遺傳定位方法，首先將突變基因座位定位在水稻第9染色體InDel 標(biāo)記Ch901和Lh901之間。進(jìn)一步精細(xì)定位，我們在這兩個(gè)標(biāo)記之間發(fā)展了 5對有多態(tài)性 InDel分子標(biāo)記，將該基因座位定位在Lh903_8和Lh903_5之間，物理距離為63. 61Λ。該區(qū)域包含7個(gè)編碼基因，其中一個(gè)編碼PHD finger蛋白的基因與擬南芥雄性不育基因MSl同源，通過對該基因的兩次測序，發(fā)現(xiàn)突變體tcl該基因的第二個(gè)內(nèi)含子處有一個(gè)T堿基的插入，通過功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分析確定雄性不育基因TCL的功能異常造成了水稻花粉的不育。通過對花藥不育突變體tcl花器官發(fā)育各時(shí)期進(jìn)行組織切片、掃描電鏡、染色體觀察，發(fā)現(xiàn)該基因的突變會導(dǎo)致水稻小孢子從四分體中釋放出來后，絨氈層細(xì)胞無PCD信號，小孢子中期絨氈層細(xì)胞逐漸膨大，且絨氈層細(xì)胞內(nèi)容物被滲透至花藥腔中，小孢子開始降解，成熟花藥中無花粉粒；通過啟動子加分子標(biāo)記GUS分析表明TCL基因在小孢子早期的絨氈層和小孢子中表達(dá)；RT-PCR也表明TCL基因在花藥中特異性表達(dá)，在根、莖、葉及內(nèi)外稃中均不表達(dá)；生化測定分析表明突變體花藥表面蠟質(zhì)成份增加；互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)顯示TCL基因可以恢復(fù)突變體的表型。說明該基因功能確實(shí)是影響到水稻的花粉發(fā)育，這種影響可能是通過調(diào)節(jié)花藥絨氈層細(xì)胞的程序性死亡來實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例1tcl突變體植株的獲得和形態(tài)學(xué)的觀察用6tlCo γ射線誘變粳稻9522種子，處理劑量為^OGy,得突變體。對誘變的F2代中一雄性不育突變體三代回交，獲得隱性單基因調(diào)控的穩(wěn)定遺傳的突變體tcl。所有植物材料種植于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地。tcl突變體與粳稻9522回交，F(xiàn)l代全部為可育，自交F2代中出現(xiàn)分離，其中正常植株為189，突變株為55 ( χ 2 = 0. 65)，表明該雄性不育突變體表型由一個(gè)單核基因突變造成。對tcl突變體植株的形態(tài)學(xué)觀察。如圖1，野生型和突變型tcl的表型對比顯示野生型稻穗結(jié)實(shí)后下垂(左)，而tcl突變型小穗不結(jié)實(shí)呈直立狀 (右)，野生型花藥包含成熟花粉呈現(xiàn)為黃色(左)(B，C)，突變型tcl花藥為淡黃色且無花粉粒(右)(B，C)。實(shí)施例2tcl突變體花藥絨氈層細(xì)胞的程序性死亡信號檢測步驟一，各發(fā)育階段野生型和突變體tcl花藥的石蠟切片制備(1)將所需材料適量(不超過固定液體積的1/20)取到已盛有FAA固定液的青霉素小瓶中。用真空泵緩慢抽氣(抽氣過程10分鐘)，在真空狀態(tài)(> 20atm)放置15分鐘后，緩慢放氣(放氣過程10分鐘)?？捎^察到有空氣小泡冒出，樣品沉到瓶底，4°C保存；(2)脫水；梯度分別為50%乙醇(植物組織沉在瓶底說明抽氣是充分的)，50% 乙醇，60%乙醇，70%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，100%乙醇，100%乙醇，1/4 二甲苯3/4乙醇，1/2 二甲苯1/2乙醇，3/4 二甲苯1/4乙醇，室溫下每級30分鐘。90%二甲苯10%氯仿， 90 % 二甲苯10 %氯仿，90 % 二甲苯10 %氯仿，室溫下每級60分鐘，最后將90 % 二甲苯10 % 氯仿裝滿青霉素小瓶體積的一半；(3)將3 5片蠟片小心投入含1/2體積90%二甲苯10%氯仿的樣品小瓶，并將小瓶放置于已調(diào)到42°C的烘箱中，大約15分鐘后蠟溶解，輕輕搖動小瓶，使溶解的石蠟均勻分布，再加入3 5片蠟片。幾次后小瓶漸滿，保持30分鐘后，將材料用鑷子迅速轉(zhuǎn)入已放有融好的蠟片(在60°C的烘箱上)的新青霉素小瓶中，過夜。每天早晚各換蠟1次，滲蠟最好2 3天時(shí)間；(4)包埋；將溶好的石蠟到入折好的小船中，用燒熱的鑷子將材料夾到小船內(nèi)，并擺好位置。待表面的蠟稍凝，將小船迅速浸于已備好的冷水中，放置至少2小時(shí)。包埋好的蠟塊晾干后可用干凈容器裝好置于4°C存放；(5)預(yù)先打開烘箱45 50°C，將載玻片架子用一次性手套包好，放入烘箱里。打開展片機(jī)42°C，預(yù)熱載玻片上的水(每片加水2 :3ml)。先大致修塊，再精細(xì)修塊，切片厚度8 10微米。42°C展片，吸干時(shí)使用無塵拭紙。42°C展1分鐘即可。展好后的片子放入 45 50°C的烘箱內(nèi)的玻片架子上，用一次性手套包好，以免污染，烤片M小時(shí)以上。步驟二，切片預(yù)處理切片預(yù)處理和PCD信號檢測的方法來源于!Iomega公司的細(xì)胞凋亡檢測產(chǎn)品試劑盒(017959)提供的實(shí)驗(yàn)步驟內(nèi)容，按公司提供的方法進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)步驟如下切片脫蠟，將切片浸入新鮮100%二甲苯5min，重復(fù)一次；100%乙醇洗滌5min ；乙醇梯度脫水，100%、95%、85%、70%、50%各級!Bmin ；0. 85% NaCl 中洗滌 5min ；PBS 洗滌 5min ；將37%的甲醛溶液用PBS稀釋至3. 7%，將切片浸入，固定材料15min ；PBS洗滌兩次，每次5min ；吸去多余水分，將切片放置在平整桌面上；每片加上100 μ L 20yg/mL的蛋白酶K 將花藥組織覆蓋；孵育8 IOmin ；(注蛋白酶K幫助后續(xù)步驟中染色劑滲入組織細(xì)胞；為了最佳效果，應(yīng)當(dāng)選擇最適孵育時(shí)間；4 6μπι厚的切片可以適當(dāng)延長時(shí)間；但是，延長時(shí)間可能導(dǎo)致在后續(xù)洗滌步驟中使材料從玻片上脫落下來；)PBS 洗滌 5min ；3. 7%甲醛的PBS溶液中固定5min ；PBS洗滌5min ；(此時(shí)應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)備DNasel處理的正對照)步驟三，絨氈層P⑶信號的檢測輕拍玻片以去掉多余水分，覆以100 μ L平衡緩沖液，室溫下平衡5 IOmin ；在平衡過程中，按照每張切片45 μ L平衡緩沖液，5 μ L Nucleotide Mix和 1 μ LrTdT酶準(zhǔn)備rTdT孵育緩沖液；注應(yīng)將rTdT孵育緩沖液置于冰上，并避光；負(fù)對照準(zhǔn)備一份無rTdT酶的孵育緩沖液，包括45 μ L平衡緩沖液、5 μ L Nucleotide Mix和1 μ L去離子水；按照步驟3 12處理負(fù)對照切片；正對照加100 μ L DNase I緩沖液室溫下孵育5min ；輕拍去水分，加100 μ L含有 5. 5 lOunits/mL的DNase I的酶緩沖液，室溫下孵育IOmin ；去除多余水分，在充足的去離子水中洗滌3 4次；按照步驟1 12處理正對照切片；注DNase I處理細(xì)胞會使染色體DNA片段化，并暴露出大量的可供標(biāo)記的3，_0H ； 應(yīng)當(dāng)使用另外一個(gè)染色缸處理正對照切片，因?yàn)闅埩舻腄Nase I的活性會給實(shí)驗(yàn)組引入強(qiáng)烈的背景；在5cm2平衡區(qū)域加50 μ L rTdT孵育緩沖液，不要讓細(xì)胞干燥；塑料覆膜可以剪半使用，將邊緣折起便于移除；用塑料覆膜將細(xì)胞覆蓋使得反應(yīng)試劑均勻分布；在濕盒底部放入足量吸水紙，加水至過飽和；將切片在濕盒內(nèi)37°C孵育60min，使末端反應(yīng)進(jìn)行；用鋁箔把濕盒包裹起來避免光直射；用去離子水把20XSSC按1 10稀釋為2XSSC，倒入染色缸；揭去塑料覆膜，將切片浸入SSC中15min以終止反應(yīng)；(注SSC在使用前必須確保所有的鹽都已溶解)PBS洗滌三次，每次5min，將未結(jié)合的熒光12_dUTP洗去；將碘化丙啶(PI)在PBS中稀釋至終濃度1 μ g/mL,倒入染色缸中；將切片放入，黑暗中染色I(xiàn)Omin ；去離子水洗滌三次，每次5min ；甩去多余水分，用吸水紙將細(xì)胞周邊水分吸去；在載玻片上滴一滴抗熒光淬滅封片劑，蓋玻片封片；用潔凈的指甲油封住蓋玻片四周，晾干5 IOmin ；必要時(shí)，將玻片置于濕盒內(nèi)4°C黑暗中過夜保存；在520士20nm下觀察綠色熒光， 在> 620nm下觀察PI的紅色熒光(注PI將凋亡細(xì)胞和非凋亡細(xì)胞均染成紅色；熒光 12-dUTP則只結(jié)合在凋亡細(xì)胞的核內(nèi))。圖2中，A至D為野生型9522花藥細(xì)胞的P⑶信號檢測；A，第6發(fā)育階段的花藥細(xì)胞中無任何PCD信號；第8發(fā)育階段的花藥(圖2B)、第9發(fā)育階段的花藥(圖2C)和第 10發(fā)育階段的花藥(圖2D)中都能檢測到PCD的信號。E至H為突變體tcl花藥細(xì)胞的 PCD信號檢測；第6發(fā)育階段的花藥細(xì)胞(圖2E)、第8發(fā)育階段的花藥(圖2F)、第9發(fā)育階段的花藥(圖2G)和第10發(fā)育階段的花藥(圖2H)中無任何PCD信號被檢測。實(shí)施例3TCL基因的定位和克隆步驟一，定位群體，將tcl與秈稻品系龍?zhí)馗雜交，自交獲得F2代，選擇其中為雄性不育植株為定位群體；步驟二，水稻DNA提取。采用改進(jìn)的CTAB法進(jìn)行提取，包括如下步驟取葉片 0.1 0.2克(約半片)放到小研缽中，加入適量的液氮，立刻研磨至粉狀，裝入2ml離心管，加入700ull00°C預(yù)熱的1. 5xCTAB溶液于離心管中，小心混勻后放入56°C水浴，20分鐘后取出離心管，加入等體積氯仿/異戊醇，猛烈混勻，13000rpm離心10分鐘，取上清于新管中，加入900ul無水乙醇混勻后_20°C放半小時(shí)以上。將析出的DNA離心，HOOOrpm離心10 分鐘。去掉上清，將沉淀用lml70%乙醇清洗一次，離心干燥，溶于200ul 1/10TE或水中， 4°C冰箱保存；步驟三，InDel分子標(biāo)記分析。共設(shè)計(jì)了 132對多態(tài)性標(biāo)記，SSR引物根據(jù)已發(fā)表的序列合成(具體可參見 http://www. gramene. org/microsat/ssr. html),其他 InDel 分子標(biāo)記設(shè)計(jì)是根據(jù)比較粳稻日本晴和秈稻9311兩品系的已公布的核酸序列，對差異的部分設(shè)計(jì)引物，驗(yàn)證2個(gè)親本粳稻9522和秈稻廣陸矮之間的多態(tài)性，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?0ul體系中，Iul 模板，Iul lOpmol/ulPrimerl, Iul 10pmol/ul Primer2, Iul IOXBuffer (Mg2+), Iul 2mM dNTP，0. Iul Taq，3. 9ul水；之后通過6%的PAGE膠電泳，銀染方法檢測。步驟四，群體分離分析初定位和精細(xì)定位應(yīng)用這些多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析，在194個(gè)定位群體中發(fā)現(xiàn)突變基因與9 號染色體上的Marker Ch901和Lh901表現(xiàn)連鎖，進(jìn)一步擴(kuò)大定位群體(1162個(gè))和設(shè)計(jì)另外的多態(tài)性標(biāo)記定位發(fā)現(xiàn)該基因處于距離為63. 6kb的Lh903-8和Lh903_5兩個(gè)Marker之間(圖3A)。該區(qū)域包含7個(gè)編碼基因，其中一個(gè)編碼PHD finger蛋白的基因0s09g27620 為擬南芥雄性不育基因MSl的同源基因，通過對該基因的兩次測序，發(fā)現(xiàn)突變體tcl該基因的第二個(gè)內(nèi)含子處有一個(gè)T堿基的插入。用分子標(biāo)記對定位群體中的雄性不育單株進(jìn)行基因型分析，所用標(biāo)記的序列如表1所示。表1 InDel分子標(biāo)記及其核酸序列
MarkerForward primer (5，-3，)Reverse primer (5，-3，)BACNameNameCH901CAACCCATTCACTGACCGTCTGATCGCCGAAGCCTTAP005420LH903-5TCCATGCCTGTGGGAACAGACGGCTATGTCATCAACTGCAP005308LH903-8GGCGAAAACTAACTTGTAGCTCACTAGCTGCTGAAACGGAP005308LH903-9CGATCCCTCCGTAACTAACTTTCTTGCTTTGTTCCTCCTAAP005308LH903-2GTGTTGCCATTGCGATTGAGGCCGAGCCTGTTGAAGATGAAP005308LH902-3CGGAGATACTACACCGTGACCACAAACTCCAAGACGCAATAP005655LH901-1CCCAATACTCACCATAATCACAGCCTACTCACGGACTGTTTAP005676實(shí)施例4TCL基因的功能分析從水稻9522基因組中用引物TCL-lpF5 :5’ -caccgtcgacGAGTTAACAAGTGGATGGTG-3’,禾口TCL-3R1 :5，-TITggatccACAGTTGAAGGACGGGAACGACAC-3，；擴(kuò)增出含TCL全長基因組序列的5255bp片段，該片段覆蓋0s09g027620起始密碼
子上游3043bp和基因終止密碼子處(不包括終止密碼子)。將該片段通過MlI和BamHl插入到Gateway載體PGWB7中，該構(gòu)建測序驗(yàn)證正確后通過熱擊導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，使用遺
傳手段轉(zhuǎn)化突變體幼穗愈傷，以觀察是否會引起植株恢復(fù)野生型性狀。Ttl代獲得互補(bǔ)植株，
圖5顯示Ttl代互補(bǔ)植株tcl突變體花粉發(fā)育恢復(fù)，花藥中含成熟花粉變成黃色，Tl代出現(xiàn)可
育不育植株的分離比為3 1(23株可育7株不育)。由此可見所克隆的0s09g027620
基因是引起tcl突變體雄性不育表型的基因；圖5中，E 表皮層，En 內(nèi)皮層，Mi 中層，T
絨氈層，Tds 四分體，Ms 小孢子，DMs 降解的小孢子，ST 膨大的絨氈層。通過對花藥不育
突變體tcl花器官發(fā)育各時(shí)期進(jìn)行組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)TCL基因的突變會導(dǎo)致水稻在小孢
子早期絨氈層不能降解，小孢子不能發(fā)育成正常的成熟花粉粒，最后在突變體花藥中被徹底瓦解(圖幻。說明TCL基因是調(diào)控水稻雄性不育的基因，對花藥絨氈層的降解具有調(diào)控作用。實(shí)施例5TCL啟動子活性分析從水稻9522基因組中用引物TCL_lpF5 5，-caccgtcgacGAGTTAACAAGTGGATGGTG-3‘和 TCL-pR 5，-aaaggatccCACCATCTTAGGCGCCAT-3’ 擴(kuò)增出含 TCL 啟動子序列的 3043bp 片段。 擴(kuò)增得至Ij的TCL啟動子通過SalI和BamHl插入到Gateway載體pGWB3中。構(gòu)建pGWB3 TCLpro :GUS通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化至野生型水稻愈傷組織中。通過分析B-半乳糖苷酶的活性分析TCL啟動子的表達(dá)模式，在轉(zhuǎn)基因的雜合子植株的根，莖，葉，小穗和小花中通過GUS染色液染色，染色后的組織用75 %的乙醇脫色處理，發(fā)現(xiàn)TCL主要在水稻花藥發(fā)育的第8階段和第9階段的花藥中表達(dá)。將脫色處理的材料放入FAA固定液中固定，脫水，滲透和樹脂包埋等處理，通過切片(ΙΟμπι厚)和釕紅染色(0.05%，W/V，pH 9)20min，通過光學(xué)顯微鏡下觀察(Leica DM2500)，我們發(fā)現(xiàn)TCL基因主要在絨氈層中表達(dá)，而且在小孢子中也有表達(dá)。圖6A中，1-第6發(fā)育階段；2-第8發(fā)育階段；3-第9發(fā)育階段；4-第10階段； 5-第10階段晚期。圖6B中，St-雄蕊；圖6C中，T，絨氈層；Ms，小孢子。圖6中的箭頭表示呈現(xiàn)GUS染色的花藥。
權(quán)利要求
1.一種具有雄性不育基因TCL的載體的應(yīng)用，該載體為蛋白質(zhì)、質(zhì)?；蛩拗骷?xì)胞，其中所述的蛋白質(zhì)(a)氨基酸序列如SEQID NO 2所示；(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有影響絨氈層細(xì)胞程序性死亡活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；所述的質(zhì)粒包含堿基序列如SEQ ID NO 1所示的基因； 所述的宿主細(xì)胞包含堿基序列如SEQ ID NO 1所示的基因；其特征在于通過基因敲除或抑制所述TCL基因，使得絨氈層細(xì)胞的異常死亡以獲得新的水稻雄性不育系用來生產(chǎn)雜交種子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是，通過突變TCL基因獲得水稻雄性不育材料。
3.一種恢復(fù)TCL基因缺失導(dǎo)致的水稻雄性不育的方法，其特征在于，通過引物序列擴(kuò)增出含TCL全長基因組序列的5255bp片段，并將該片段通過熱擊導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，使用遺傳手段轉(zhuǎn)化突變體愈傷并實(shí)現(xiàn)野生型性狀的恢復(fù)；所述的引物序列為TCL-lpF5 :5’ -caccgtcgacGAGTTAACAAGTGGATGGTG-3，， TCL-3R1 :5’ -TTTggatcc ACAGTTGAAGGACGGGAACGACAC-3’。
全文摘要
一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的雄性不育基因TCL、編碼的蛋白及啟動子、質(zhì)粒和宿主細(xì)胞；本發(fā)明涉及的雄性不育基因TCL為編碼如下(a)或(b)所述的蛋白質(zhì)的基因(a)由SEQ IDNO2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有影響絨氈層細(xì)胞程序性死亡活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；本發(fā)明還涉及一種堿基序列如SEQ ID NO3所示的啟動子；本發(fā)明還涉及一種氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的蛋白質(zhì)；本發(fā)明還涉及一種包含堿基序列如SEQ ID NO1所示的基因的質(zhì)粒以及宿主細(xì)胞。本發(fā)明的TCL基因具有維持水稻花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡的功能，該基因功能的缺失導(dǎo)致絨氈層細(xì)胞發(fā)生壞死，導(dǎo)致水稻的雄性不育。
文檔編號A01H1/06GK102242110SQ20111010191
公開日2011年11月16日 申請日期2010年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月8日
發(fā)明者張大兵, 李暉, 梁婉琪, 袁政 申請人:上海交通大學(xué)