專利名稱:一種蘿卜種質(zhì)抗黑斑病的快速鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明為園藝作物抗病育種領(lǐng)域,具體涉及一種蘿卜種質(zhì)抗黑斑病的快速鑒定方法。
背景技術(shù):
蘿卜黑斑病(Garden radish Alternaria leaf spot)是蘿卜種植過程中容易出現(xiàn)的病害,它是由蘿卜鏈格孢(Alternaria Groves et Skoloko)引起的,蕓薹鏈格?包(Alternaria brassicae (Berkveley) Saccvardo)禾口甘藍(lán)鏈格抱(Alternaria brassicivcola(Schweinitz)ffiltshire)也能引起該病害的發(fā)生,是危害十字花科蔬菜生產(chǎn)的世界性真菌病害。黑斑病通過種子傳帶形成異地擴散和蔓延,危害葉片和整株植物,全生育過程發(fā)病嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì),成為我國甚至世界蔬菜生產(chǎn)的主要病害之一。蘿卜黑斑病在許多國家都有發(fā)生,尤其是在美國、加拿大、芬蘭和中國發(fā)生較重。20世紀(jì)40年代, 它在中國大陸已分布較普遍,對蘿卜的生產(chǎn)影響不大,但隨后該病的發(fā)生日益嚴(yán)重。發(fā)病植株的葉片、莖等染病部位呈現(xiàn)褪綠和黑色壞死斑,被侵染的種子發(fā)芽率降低,產(chǎn)量和質(zhì)量下降。從上世紀(jì)80年代到現(xiàn)在,黑斑病的流行給我國蘿卜中植生產(chǎn)造成了巨大損失,所以近年來控制蘿卜黑斑病甚至十字花科黑斑病仍然是生產(chǎn)的重要問題。目前,對于黑斑病的研究同黑腐病類似,也是主要從微生物學(xué)角度來進行的。國內(nèi)外研究者們先后通過形態(tài)學(xué)、酯同工酶分析和分子生物學(xué)研究為基礎(chǔ)進行分類和鑒定。傳統(tǒng)的分類主要是依據(jù)鏈格孢的分生孢子和喙的形態(tài)。自1962年科研人員將可溶性蛋白凝膠電泳分析引入脈孢菌的研究以來,真菌菌體的可溶性蛋白圖譜和酯酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、乳酸脫氫酶等多種酶系及其同工酶電泳圖譜分析作為化學(xué)分類的重要手段之一, 廣泛應(yīng)用于真菌的分類研究,在病原真菌種級分類上已廣泛接受,它在黑斑病的研究上也取得了極大的進展。隨著分子生物學(xué)方法的應(yīng)用和對蘿卜病菌的DNA序列的研究,PCR、 RFLP和RAPD等技術(shù)已開始在蘿卜種子傳帶黑斑病菌檢測中應(yīng)用,并逐步實現(xiàn)種子健康檢測的規(guī)范性、科學(xué)性和高通量的統(tǒng)一。從抗病育種工作的角度出發(fā),如果能夠從蘿卜主產(chǎn)區(qū)分離出病原菌,建立鑒別寄主并鑒別優(yōu)勢生理小種,篩選抗病品種是有效而又迫切的防控蔬菜病害的主要方法之一, 將大大提高我國蘿卜產(chǎn)區(qū)種植的經(jīng)濟效益。在抗病育種過程中,苗期在室內(nèi)進行則環(huán)境條件較易控制,鑒定周期短、速度快,建立蘿卜苗期室內(nèi)抗黑斑病抗病性鑒定方法有利于抗病育種工作的開展,填補國內(nèi)蘿卜黑斑病抗病育種研究空白。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種蘿卜種質(zhì)抗黑斑病的快速鑒定方法,與大田成株期接種相比,避免了氣候條件不適宜、環(huán)境中病蟲害等因素的影響,苗期在室內(nèi)進行抗病性篩選則條件較易控制,鑒定周期短、速度快,能節(jié)省大量人力物力;確定了適宜的黑斑病懸浮液濃度、蘿卜抗病性篩選苗齡。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是—種蘿卜種質(zhì)抗黑斑病的快速鑒定方法,其特征在于按以下步驟依次組成(1)供試材料準(zhǔn)備供試的黑斑病菌種為蘿卜鏈格孢(Alternaria Groves et Skoloko),菌種接種前用PDA培養(yǎng)基進行產(chǎn)孢培養(yǎng)備用;供試的蘿卜品種為春白蘿卜、秋白蘿卜、耐熱紅皮和耐熱白皮蘿卜四種類型蘿卜品種;將供試的種子播種在裝有滅菌基質(zhì)的花盆(8cm*8cm)內(nèi),出苗后每盆留1-3株。(2)接種直接采用孢子懸浮液噴霧接種,接種后將供試植株放入塑料盒內(nèi),用保鮮膜保濕 48h。每供試材料設(shè)置3次重復(fù),每次重復(fù)30株苗,以清水為對照,設(shè)置1.0X ΙΟ3、1.0X 104、 1.0X105、l. OX Kfpfu/mL四種接種濃度的孢子懸浮液和3-4、5_6、7_8葉期三種苗齡,在 20-25°C條件下誘導(dǎo)發(fā)病,置于光照培養(yǎng)室中,接種后第7d、第IOd與第14d調(diào)查病情指數(shù);(3)病情指數(shù)分級病情指數(shù)分級以葉片為單位,按0-9級標(biāo)準(zhǔn)進行發(fā)病程度調(diào)查。病情分級標(biāo)準(zhǔn)0 級無癥;1級接種葉生褐色小點,無退綠斑;3級接種葉生3mm以下的退綠斑,無霉層;5 級接種葉生3mm以上的退綠斑,有極少霉層,病斑不連成片;7級接種葉生5mm以上的退綠斑,有較多的霉層,病斑連成片以下;9級接種葉病斑連成片,大面積枯死,霉層明顯。所述的光照培養(yǎng)室內(nèi)溫度優(yōu)化為20_25°C ;所述的黑斑病孢子懸浮液濃度優(yōu)選為 1.0X105pfu/mL ;所述的黑斑病孢子懸浮液噴霧接種植株為5 6葉期幼苗,10天后調(diào)查病情。本發(fā)明取得的有益效果1、按步驟進行鑒定的方法與大田成株期接種相比,避免了氣候條件不適宜、環(huán)境中病蟲害等因素的影響,苗期在室內(nèi)進行抗病性篩選則條件較易控制,鑒定周期短、速度快,能節(jié)省大量人力物力。2、確定了適宜的黑斑病懸浮液濃度,該方法確定1. OX 105pfu/mL的黑斑病孢子懸浮液最為適宜。3、確定了適宜的蘿卜抗病性篩選苗齡,該方法確定5 6葉期進行抗病性篩選最為適宜。4、蘿卜抗黑斑病室內(nèi)抗病性鑒定方法病級劃分沒有可以參考的標(biāo)準(zhǔn),首次制定了蘿卜抗黑斑病苗期室內(nèi)噴霧法接種病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)。
圖1黑斑病的發(fā)病程度與接種物濃度關(guān)系示意2不同接種苗齡對抗病性的影響示意3不同接種菌株對抗病性的影響示意圖下面對本發(fā)明作一詳細(xì)說明
具體實施例方式下面對本發(fā)明作一詳細(xì)說明
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實施例1材料與方法1. 1供試材料供試的黑斑病菌種黑斑病菌種為蘿卜鏈格孢(Alternaria Groves et Skoloko) (本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過常規(guī)分離、選篩得到),菌種接種前用PDA培養(yǎng)基進行產(chǎn)孢培養(yǎng)供試的蘿卜品種為為春白蘿卜、秋白蘿卜、耐熱紅皮和耐熱白皮蘿卜四種類型蘿卜品種(均為市售產(chǎn)品,公眾可輕易獲得)。將供試的種子播種在裝有滅菌基質(zhì)的花盆(8cm*8cm)內(nèi),出苗后每盆留1_3株。1.2接種方法接種方法采用點滴孢子懸浮液法有以下缺點一株株手工點滴接種,費工、效率低;由于是根據(jù)單斑進行鑒定,因而鑒定結(jié)果不夠準(zhǔn)確;水珠容易滾落,不能保證較高的發(fā)病率。采用噴霧接種法接種的優(yōu)點是由于成片噴霧接種,因而快速、省工、簡便易行;根據(jù)多斑進行鑒定,提高了鑒定結(jié)果的可靠性;噴霧均勻,可達(dá)到很高的發(fā)病率。本研究未進行接種方法鑒定,直接采用孢子懸浮液噴霧接種,接種后將供試植株放入塑料盒內(nèi),用保鮮膜保濕48h。每供試材料設(shè)置3次重復(fù),每次重復(fù)30株苗,以清水為對照,設(shè)置1. 0 X 103、 1. 0X104、1. 0X105、1. 0XlOfiPfuAiL四種接種濃度的孢子懸浮液和3-4、5-6、7-8葉期三種苗齡,在25-30°C條件下誘導(dǎo)發(fā)病,置于光照培養(yǎng)室中,接種后第7d、第IOd與第14d調(diào)查病情指數(shù)。1. 3病情指數(shù)分級病情指數(shù)分級以葉片為單位,按0-9級標(biāo)準(zhǔn)進行發(fā)病程度調(diào)查。病情分級標(biāo)準(zhǔn)0 級無癥1級接種葉生褐色小點,無退綠斑;3級接種葉生3mm以下的退綠斑,無霉層;5 級接種葉生3mm以上的退綠斑,有極少霉層,病斑不連成片;7級接種葉生5mm以上的退綠斑,有較多的霉層,病斑連成片以下;9級接種葉病斑連成片,大面積枯死,霉層明顯。1. 4數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSSl 1. 5 (LSD,ρ < 0. 05)進行統(tǒng)計分析處理,采用Microsoft Office Excel 2003 進行制圖。2結(jié)果與分析2. 1不同接種濃度對抗病性的影響從圖1可以看出,黑斑病的發(fā)病程度與接種物濃度呈正相關(guān)。從第10天表現(xiàn)典型癥狀的病情指數(shù)調(diào)查結(jié)果來看,以1.0Xl(fpfu/mL、l.OXloVfu/mL接種發(fā)病慢,發(fā)病程度也較低,四種材料間發(fā)病差異不顯著;以1. OX 105pfu/mL、l. OX Kfpfu/mL兩個濃度接種時,四種材料間發(fā)病差異一致,濃度大、發(fā)病快。2. 2不同接種苗齡對抗病性的影響如圖2所示,3 4葉期苗齡時,四種材料發(fā)病程度都比較重,病情指數(shù)值高,隨著苗齡的增加,發(fā)病程度呈現(xiàn)減輕趨勢,說明隨著苗齡的增加其抗病力也增強。5 6葉期、 7 8葉期苗齡四種材料間發(fā)病差異一致,但從發(fā)病情況來看,苗齡大接種后發(fā)病較慢。2. 3不同接種菌株對抗病性的影響如圖3所示,三個不同采樣地點的黑斑病菌株接種后,四種材料對不同菌株的抗
5性均不一致,秋白蘿卜對HBl、WHHBl、JZHBl的抗性差異顯著。3、結(jié)論研究結(jié)果表明,在光照培養(yǎng)室內(nèi)05 30°C ),選擇濃度為1. OX l(^pfu/mL的黑斑病孢子懸浮液噴霧接種于蘿卜5 6葉期幼苗,保濕48h,10天后調(diào)查病情,可準(zhǔn)確評價蘿卜品種對黑斑病的抗性。研究當(dāng)中采用三個不同地點得到的蘿卜黑斑病菌株對4種材料的抗病鑒定結(jié)果也表明,針對不同的菌株材料的抗性差異大。該結(jié)論為蘿卜抗黑斑病抗病育種工作打下了基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種蘿卜種質(zhì)抗黑斑病的快速鑒定方法,其特征在于按以下步驟依次組成(1)供試材料準(zhǔn)備供試的黑斑病菌種為蘿卜鏈格孢(Alternaria Groves et Skoloko),菌種接種前用 PDA培養(yǎng)基進行產(chǎn)孢培養(yǎng)備用;供試的蘿卜品種為春白蘿卜、秋白蘿卜、耐熱紅皮和耐熱白皮蘿卜四種類型蘿卜品種;將供試的種子播種在裝有滅菌基質(zhì)的花盆(8cm*8cm)內(nèi),出苗后每盆留1-3株。(2)接種直接采用孢子懸浮液噴霧接種,接種后將供試植株放入塑料盒內(nèi),用保鮮膜保濕48h。 每供試材料設(shè)置3次重復(fù),每次重復(fù)30株苗,以清水為對照,設(shè)置1. OX 103、1. OX 104、 1.0X105U.0X106pfu/mL四種接種濃度的孢子懸浮液和3-4、5_6、7_8葉期三種苗齡,在約 20-25°C條件下誘導(dǎo)發(fā)病,置于光照培養(yǎng)室中,接種后第7d、第IOd與第14d調(diào)查病情指數(shù);(3)病情指數(shù)分級病情指數(shù)分級以葉片為單位,按0-9級標(biāo)準(zhǔn)進行發(fā)病程度調(diào)查。病情分級標(biāo)準(zhǔn)0級無癥;1級接種葉生褐色小點,無退綠斑;3級接種葉生3mm以下的退綠斑,無霉層;5級接種葉生3mm以上的退綠斑,有極少霉層,病斑不連成片;7級接種葉生5mm以上的退綠斑, 有較多的霉層,病斑連成片以下;9級接種葉病斑連成片,大面積枯死,霉層明顯。
2.如權(quán)利要求1所述的鑒定方法,其特征在于所述的光照培養(yǎng)室內(nèi)溫度優(yōu)化為大約 20- °C。
3.如權(quán)利要求1或2所述的鑒定方法,其特征在于所述的黑斑病孢子懸浮液濃度優(yōu)選為 1. 0X105pfu/mL。
4.如權(quán)利要求1或2所述的鑒定方法,其特征在于所述的黑斑病孢子懸浮液噴霧接種植株為大約5 6葉期幼苗,大概10天后調(diào)查病情。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蘿卜種質(zhì)抗黑斑病的快速鑒定方法,其特征在于按以下步驟依次組成(1)供試材料準(zhǔn)備、(2)接種和(3)病情指數(shù)分級,確定了適宜的黑斑病懸浮液濃度、蘿卜抗病性篩選苗齡,與大田成株期接種相比,避免了氣候條件不適宜、環(huán)境中病蟲害等因素的影響,苗期在室內(nèi)進行抗病性篩選則條件較易控制,鑒定周期短、速度快,能節(jié)省大量人力物力。
文檔編號A01G7/00GK102293107SQ20111006543
公開日2011年12月28日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者丁自立, 何云啟, 崔磊, 張興中, 梅時勇, 梅雪飛, 王晴芳, 甘彩霞, 高翔, 黃來春 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所