專利名稱：輻射育種高產(chǎn)蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種食用菌種源的生產(chǎn)方法，尤其涉及一種輻射育種高產(chǎn)蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產(chǎn)方法。屬于食用菌藥用菌遺傳育種領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草Cordyceps sinensis是我國傳統(tǒng)的名貴藥材,分布于西藏、青海、四川、甘肅、云南等地，具有特殊的藥理作用和治療功效。也是藥食調(diào)補(bǔ)佳品。其中蟲草素是最獨(dú)特而重要的藥物成分。近年來由于人類活動范圍的擴(kuò)大，生態(tài)環(huán)境的惡化，導(dǎo)致野生冬蟲夏草持續(xù)減少， 價(jià)格也持續(xù)飆升。到2010年優(yōu)質(zhì)蟲草已經(jīng)銷售到16萬元/公斤(干)。為解決冬蟲夏草資源緊缺問題，人們很早就開始關(guān)注蛹蟲草，從1986年起，人們把野生蛹蟲草采集回來，通過組織分離獲得菌種，20多年里，蛹蟲草栽培獲得重大技術(shù)突破。目前它已經(jīng)成為冬蟲夏草的最佳替代品。全世界已知蟲草類有350余種，我國目前有62種，但最為昂貴的只有冬蟲夏草和蛹蟲草。北蟲草即蛹蟲草Cordycepsmilitaris (L. ) Link、又稱之北冬蟲夏草,它是蟲草屬中兩個(gè)模式種之一。2007年我國正式將北蟲草列為新資源食品。它被認(rèn)為是目前唯一能替代冬蟲夏草的蟲草屬真菌。北蟲草在世界上廣泛分布，它能夠寄生在多種鱗翅目昆蟲的幼蟲及其蛹體上，在我國各地分布較廣，主要分布剝蝕丘陵地帯、海抜50-400米之間、氣候?qū)儆诒睖貛　霛駶櫞箨懶詺夂?、毎年只有林區(qū)在郁閉、避風(fēng)的地段才能有北蟲草集中發(fā)生，而傳統(tǒng)的冬蟲夏草主產(chǎn)于我國青海、云貴高原的橫斷山區(qū)及祁連山等海抜4500-5000 米以上的高原灌叢或草甸地帶、寄生在凍土層中的蝙蝠蛾幼蟲體上，遺憾的是對于這種名貴中藥材至今未能實(shí)現(xiàn)有效的子實(shí)體人工培養(yǎng)及規(guī)?；a(chǎn)，但是國內(nèi)外對已經(jīng)成為誘發(fā)蟲草子實(shí)體的種類研究認(rèn)為，北蟲草食用和藥用價(jià)值可與傳統(tǒng)的冬蟲夏草媲美，它不僅在藥效成分種類上與傳統(tǒng)冬蟲夏草相近外，而且是在已報(bào)道的350余種蟲草菌中唯一能大量形成蟲草素的種，因此它與傳統(tǒng)冬蟲夏草一祥，能滋補(bǔ)人體，而且能有效地抑制腫瘤和病毒，并具有多種藥理功能，是傳統(tǒng)冬蟲夏草的最理想代用品，但野生的北冬蟲夏草與傳統(tǒng)的冬蟲夏草一祥，在自然界中稀少，價(jià)格昂貴，因此，人工培育具有自然形態(tài)的北冬蟲夏草子實(shí)體，意義重大，經(jīng)濟(jì)效益顯著！蟲草素是蟲草屬藥用真菌中獨(dú)有的藥物成分，是ー種核苷類抗生素，具有較好的抗病毒功能；能抑制枯草桿菌，鳥結(jié)核桿菌和艾氏腹水癌細(xì)胞，并對KB細(xì)胞培養(yǎng)和Hep#2 細(xì)胞有毒性作用，可影響mRNA的形成以至蛋白質(zhì)的合成，這ー機(jī)制與蟲草素抗腫瘤有夫， 1997年美國已將蟲草素用于一期臨床試驗(yàn)，治療急性前B和前T淋巴細(xì)胞白血病患者；同時(shí)，蟲草素還表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗真菌，抗HIV-I型病毒和選擇性抑制梭菌屬細(xì)菌活性。經(jīng)檢測人工栽培的北蟲草富含蟲草素，其含量高于冬蟲夏草。目前北蟲草的人工栽培技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，但在如何提高北蟲草內(nèi)在品質(zhì)方面尚有大量工作需要去做，其中如何提高北蟲草內(nèi)蟲草素含量就是ー個(gè)重要課題。資料顯示，目前科技工作者在提高蟲草素方面主要是通過向培養(yǎng)基中添加一定數(shù)量的蛋白源，但這種做法提高幅度有限，從2008年起，我們主要通過培育北蟲草新品種來提高蟲草素含量，具體做法就是對現(xiàn)有蟲草種源進(jìn)行輻射育種，再通過液相色譜檢測法篩選蟲草素產(chǎn)率高的新菌株。本專利所提及的高產(chǎn)蟲草素北蟲草新菌株ycc Gy 1016的生產(chǎn)方法就是在上述背景下選育而成。批量多次重復(fù)的栽培結(jié)果表明，在相同栽培培養(yǎng)基和管理?xiàng)l件下，采用ycc Gy 1016和ycc-01兩個(gè)不同品種進(jìn)行栽培，所獲得的蟲草干品中蟲草素含量差異明顯，與種源本身產(chǎn)生蟲草素能力成正相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決目前為提高北蟲草的蟲草素含量，所采用的通過向培養(yǎng)基中添加一定數(shù)量的蛋白源其提高幅度有限，效果不理想的技術(shù)問題，提供一種輻射育種高產(chǎn)蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產(chǎn)方法，通過低劑量銫137放射性元素輻射后篩選獲得，定名為 ycc Gy 1016 ;具體生產(chǎn)方法是通過下述步驟實(shí)現(xiàn)的I)選擇目前生產(chǎn)中廣泛使用的北蟲草品種ycc-01作為輻射育種的出發(fā)菌株；2) ycc-01培養(yǎng)基配方葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸ニ氫鉀3克、 硫酸鎂2克、復(fù)合維生素100毫克及蒸餾水1000毫升，按常規(guī)方法生產(chǎn)液體種源；3)按常規(guī)方法制備加富PDA培養(yǎng)基，取直徑10厘米培養(yǎng)皿同步高壓滅菌，倒平板、 冷卻后涂布稀釋1000-3000倍的含有分生孢子的液體種源菌液0. 1-0. 5毫升，均勻涂布于平板上，在18-25°C避光定植培養(yǎng)24-36小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入輻射處理；4)輻射源選擇低劑量銫137，劑量50Gy-500Gy，距離30cm，照射2_300s，照射后在 20°C暗培養(yǎng)2-7天，然后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度4000-6000勒克斯，培養(yǎng)時(shí)間2_4天，然后根據(jù)菌落生長形態(tài)進(jìn)行菌落篩選；5)菌落篩選，在宏觀層面，選擇菌落生長正常，邊緣整齊、菌絲不徒長，菌絲轉(zhuǎn)色深的菌落；在微觀層面通過顯微鏡進(jìn)行觀察，選擇菌絲粗細(xì)均勻、細(xì)胞核數(shù)量多、菌絲分枝適度、分生孢子著生呈念珠狀態(tài)，選擇符合上述要求的菌落挑取保存；6)將挑取菌落進(jìn)行編號，按常規(guī)方法擴(kuò)繁母種和液體菌種，并進(jìn)行栽培對出草正常，子實(shí)體形態(tài)正常、產(chǎn)量高的菌落制備液體菌種，培養(yǎng)基配方為葡萄糖20克，蛋白胨5 克，酵母浸粉3克，磷酸ニ氫鉀3克，硫酸鎂2克，蒸餾水1000毫升，以出發(fā)菌株ycc-01為對照，常規(guī)培養(yǎng)后測定菌絲體中蟲草素含量和液體培養(yǎng)基中蟲草素含量；7)經(jīng)過檢測，對蟲草素含量高菌落進(jìn)行提純、復(fù)壯；按常規(guī)制備液體菌種，按每瓶鮮蠶蛹10個(gè)、干小麥20克、飲用水30毫升，滅菌后接種，按常規(guī)培養(yǎng)，待出草后選子實(shí)體形態(tài)好的，進(jìn)行組織分離獲取種源；8)對選擇出的產(chǎn)生蟲草素高的組織分離種源進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性評價(jià)實(shí)驗(yàn)，最后篩選得到一株高產(chǎn)蟲草素的新菌株，定名為ycc Gy 1016新菌株。本發(fā)明的特點(diǎn)及有益效果ycc Gy 1016菌株與出發(fā)菌株ycc-01相比,在出草方面形態(tài)正常，產(chǎn)量性狀在0. 05水平比較差異不顯著，蟲草素產(chǎn)率在0. 05水平比較，差異達(dá)到顯著水平。經(jīng)檢測菌株ycc Gy 1016產(chǎn)生蟲草素能力是出發(fā)菌株ycc-01的3. 8倍。這一成果對于人工生產(chǎn)功能性北蟲草具有重要價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。具體結(jié)果ycc Gy 1016菌株生物轉(zhuǎn)化率為5. 62克(干)/45克小麥，出發(fā)菌株ycc-01生物轉(zhuǎn)化率為5. 68克(干)/45克小麥；yCC Gy 1016菌株蟲草素產(chǎn)率481. 6毫克 /公斤，ycc-01菌株蟲草素產(chǎn)率126. 3毫克/公斤。


圖lyCCGyl016和YCC-01菌種轉(zhuǎn)代次數(shù)對子實(shí)體產(chǎn)量的影響曲線2蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線3轉(zhuǎn)代次數(shù)對yCCGyl016和YCC-Ol菌種蟲草素含量曲線圖
具體實(shí)施例方式輻射育種高產(chǎn)蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產(chǎn)方法，通過低劑量銫137放射性元素輻射后篩選獲得，定名為..ice Gy 1016 ;具體生產(chǎn)方法是通過下述步驟實(shí)現(xiàn)的I)選擇目前生產(chǎn)中廣泛使用的北蟲草品種ycc-01作為輻射育種的出發(fā)菌株；2) ycc-01培養(yǎng)基配方葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸ニ氫鉀3克、 硫酸鎂2克、復(fù)合維生素100毫克及蒸餾水1000毫升，按常規(guī)方法生產(chǎn)液體種源；3)按常規(guī)方法制備加富PDA培養(yǎng)基，取直徑10厘米培養(yǎng)皿同步高壓滅菌，倒平板、 冷卻后涂布稀釋1000-3000倍的含有分生孢子的液體種源菌液0. 1-0. 5毫升，均勻涂布于平板上，在18-25°C避光定植培養(yǎng)24-36小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入輻射處理；4)輻射源選擇低劑量銫137，劑量50Gy_500Gy，距離30cm，照射2_300s，照射后在 20°C暗培養(yǎng)2-7天，然后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度4000-6000勒克斯，培養(yǎng)時(shí)間2_4天，選擇菌落生長正常，菌絲不徒長，菌絲轉(zhuǎn)色深的菌落，挑取保存；5)菌落篩選，在宏觀層面，選擇菌落生長正常，邊緣整齊、菌絲不徒長，菌絲轉(zhuǎn)色深的菌落；在微觀層面通過顯微鏡進(jìn)行觀察，選擇菌絲粗細(xì)均勻、細(xì)胞核數(shù)量多、菌絲分枝適度、分生孢子著生呈念珠狀態(tài)，選擇符合上述要求的菌落挑取保存；6)將挑取菌落進(jìn)行編號，按常規(guī)方法擴(kuò)繁母種和液體菌種，并進(jìn)行栽培對出草正常，子實(shí)體形態(tài)正常、產(chǎn)量高的菌落制備液體菌種，培養(yǎng)基配方為葡萄糖20克，蛋白胨5 克，酵母浸粉3克，磷酸ニ氫鉀3克，硫酸鎂2克，蒸餾水1000毫升，以出發(fā)菌株ycc-01為對照，常規(guī)培養(yǎng)后測定菌絲體中蟲草素含量和液體培養(yǎng)基中蟲草素含量；7)經(jīng)過檢測，對蟲草素含量高菌落進(jìn)行提純、復(fù)壯；按常規(guī)制備液體菌種，按每瓶鮮蠶蛹10個(gè)、干小麥20克、飲用水30毫升，滅菌后接種，按常規(guī)培養(yǎng)，待出草后選子實(shí)體形態(tài)好的，進(jìn)行組織分離獲取種源；8)對選擇出的產(chǎn)生蟲草素高的組織分離種源進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性評價(jià)實(shí)驗(yàn)，最后篩選得到一株高產(chǎn)蟲草素的新菌株，定名為ycc Gy 1016新菌株。其中所述遺傳穩(wěn)定性評價(jià)實(shí)驗(yàn)，指按如下步驟程序操作，至少連續(xù)栽培3個(gè)批次，來確認(rèn)種源種性的穩(wěn)定性。 I)采用馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母膏2g，磷酸ニ氫鉀2g，硫酸鎂lg， 水IOOOmL配方按常規(guī)繁育生產(chǎn)用液體菌種。2)采用750毫升的玻璃罐頭瓶為容器，每瓶45克小麥，加水70毫升，I. 05公斤/ 平方厘米壓カ滅菌60分鐘，冷卻接種。3)菌瓶先放于20°C避光培養(yǎng)6天，然后轉(zhuǎn)入光暗交叉培養(yǎng)，每天白天以4000勒克斯強(qiáng)度光照，晚上暗培養(yǎng)，環(huán)境濕度85%，每天通風(fēng)3次。4)整個(gè)生產(chǎn)周期60天，子實(shí)體長度控制在8-12厘米，其它按常規(guī)操作，每批采用后抽樣測定產(chǎn)量和蟲草素含量。實(shí)施例I本專利申請保護(hù)的是ー株能夠提高蟲草素含量的北蟲草新品種的生產(chǎn)方法。該品種是通過低劑量銫137放射性元素輻射后篩選獲得，定名為yCC Gyl016。具體實(shí)現(xiàn)步驟是首先選擇目前生產(chǎn)中廣泛使用的北蟲草品種ycc-01作為輻射育種的出發(fā)菌株；將ycc-01利用如下培養(yǎng)基配方葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸 ニ氫鉀3克、硫酸鎂2克、復(fù)合維生素100毫克及蒸餾水1000毫升，按常規(guī)方法生產(chǎn)液體種源；再按常規(guī)方法制備加富PDA培養(yǎng)基，取直徑10厘米培養(yǎng)皿同步高壓滅菌，倒平板、 冷卻后涂布稀釋2500倍的含有分生孢子的液體種源菌液0. 3毫升，均勻涂布于平板上，在 18-25°C避光定植培養(yǎng)24-36小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入輻射處理；輻射源選擇低劑量銫137，劑量50Gy，距離30cm，照射300s，照射后在20°C暗培養(yǎng) 7天，然后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度4000勒克斯，培養(yǎng)時(shí)間4天，選擇菌落生長正常，菌絲不徒長，菌絲轉(zhuǎn)色深的菌落，挑取保存；進(jìn)行菌落篩選，在宏觀層面，選擇菌落生長正常，邊緣整齊、菌絲不徒長，菌絲轉(zhuǎn)色深的菌落；在微觀層面通過顯微鏡進(jìn)行觀察，選擇菌絲粗細(xì)均勻、細(xì)胞核數(shù)量多、菌絲分枝適度、分生孢子著生呈念珠狀態(tài)，選擇符合上述要求的菌落挑取保存；將挑取菌落進(jìn)行編號，按常規(guī)方法擴(kuò)繁母種和液體菌種，并進(jìn)行栽培對出草正常， 子實(shí)體形態(tài)正常、產(chǎn)量高的菌落制備液體菌種，培養(yǎng)基配方為葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母浸粉3克，磷酸ニ氫鉀3克，硫酸鎂2克，蒸餾水1000毫升，以出發(fā)菌株ycc-01為對照， 常規(guī)培養(yǎng)后測定菌絲體中蟲草素含量和液體培養(yǎng)基中蟲草素含量；其蟲草素測定方法采用高效液相色譜法。經(jīng)過檢測，對蟲草素含量高菌落進(jìn)行提純、復(fù)壯；按常規(guī)制備液體菌種，按每瓶鮮蠶蛹10個(gè)、干小麥20克、飲用水30毫升，滅菌后接種，按常規(guī)培養(yǎng)，待出草后選子實(shí)體形態(tài)好的，進(jìn)行組織分離獲取種源。對選擇出的產(chǎn)生蟲草素高的組織分離種源進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性評價(jià)實(shí)驗(yàn)，最后篩選得到一株高產(chǎn)蟲草素的新菌株，定名為ycc Gy 1016新菌株。所述遺傳穩(wěn)定性評價(jià)實(shí)驗(yàn)，指按如下步驟程序操作，至少連續(xù)栽培3個(gè)批次，來確認(rèn)種源種性的穩(wěn)定性。I)采用馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母膏2g，磷酸ニ氫鉀2g，硫酸鎂lg， 水IOOOmL配方按常規(guī)繁育生產(chǎn)用液體菌種。2)采用750毫升的玻璃罐頭瓶為容器，每瓶45克小麥，加水70毫升，I. 05公斤/ 平方厘米壓カ滅菌60分鐘，冷卻接種。3)菌瓶先放于20°C避光培養(yǎng)6天，然后轉(zhuǎn)入光暗交叉培養(yǎng)，每天白天以4000勒克斯強(qiáng)度光照，晚上暗培養(yǎng)，環(huán)境濕度85%，每天通風(fēng)3次。4)整個(gè)生產(chǎn)周期60天，子實(shí)體長度控制在8-12厘米，其它按常規(guī)操作，每批采用后抽樣測定產(chǎn)量和蟲草素含量。經(jīng)檢測ycc Gy 1016菌株與出發(fā)菌株ycc-01相比，在出草方面形態(tài)正常，產(chǎn)量性狀在0. 05水平比較差異不顯著，蟲草素產(chǎn)率在0. 05水平比較，差異達(dá)到顯著水平。具體結(jié)果yCC Gy 1016菌株生物轉(zhuǎn)化率為5. 62克(干)/45克小麥，出發(fā)菌株ycc-01生物轉(zhuǎn)化率為5. 68克(干)/45克小麥；ycc Gy 1016菌株蟲草素產(chǎn)率481. 6毫克/公斤，ycc-01菌株蟲草素產(chǎn)率126. 3暈克/公斤。實(shí)施例2輻射育種高產(chǎn)蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產(chǎn)方法，首先選擇目前生產(chǎn)中廣泛使用的北蟲草品種ycc-01作為輻射育種的出發(fā)菌株；將ycc-01利用如下培養(yǎng)基配方葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸 ニ氫鉀3克、硫酸鎂2克、復(fù)合維生素100毫克及蒸餾水1000毫升，按常規(guī)方法生產(chǎn)液體種源；再按常規(guī)方法制備加富PDA培養(yǎng)基，取直徑10厘米培養(yǎng)皿同步高壓滅菌，倒平板、 冷卻后涂布稀釋3000倍的含有分生孢子的液體種源菌液0. 3毫升，均勻涂布于平板上，在 18-25°C避光定植培養(yǎng)24-36小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入輻射處理；輻射源選擇低劑量銫137，劑量500Gy，距離30cm，照射2s，照射后在20°C暗培養(yǎng)6 天，然后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度5000勒克斯，培養(yǎng)時(shí)間3天，選擇菌落生長正常，菌絲不徒長，菌絲轉(zhuǎn)色深的菌落，挑取保存；其他同實(shí)施例I實(shí)施例3輻射育種高產(chǎn)蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產(chǎn)方法，首先選擇目前生產(chǎn)中廣泛使用的北蟲草品種ycc-01作為輻射育種的出發(fā)菌株；將ycc-01利用如下培養(yǎng)基配方葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸 ニ氫鉀3克、硫酸鎂2克、復(fù)合維生素100毫克及蒸餾水1000毫升，按常規(guī)方法生產(chǎn)液體種源； 再按常規(guī)方法制備加富PDA培養(yǎng)基，取直徑10厘米培養(yǎng)皿同步高壓滅菌，倒平板、 冷卻后涂布稀釋3000倍的含有分生孢子的液體種源菌液0. 3毫升，均勻涂布于平板上，在 18-25°C避光定植培養(yǎng)24-36小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入輻射處理；輻射源選擇低劑量銫137，劑量200Gy，距離30cm，照射200s，照射后在20°C暗培養(yǎng) 5天，然后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度6000勒克斯，培養(yǎng)時(shí)間2天，選擇菌落生長正常，菌絲不徒長，菌絲轉(zhuǎn)色深的菌落，挑取保存；其他同實(shí)施例I。下面的實(shí)驗(yàn)是對北蟲草誘變菌株yCCGyl016遺傳穩(wěn)定性及產(chǎn)生蟲草素能力的評價(jià)實(shí)驗(yàn)ー北蟲草誘變菌株ycc Gy 1016遺傳穩(wěn)定性評價(jià)I. I遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)由于誘變菌株在連續(xù)繼代培養(yǎng)時(shí)的性狀常常不穩(wěn)定，所以要對鈷60輻射誘變處理后得到的菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)。將誘變菌株yccGyl016和對照原始菌株YCC-Ol — 起在PDA斜面上連續(xù)轉(zhuǎn)接10代，每代均進(jìn)行栽培試驗(yàn)，結(jié)果見表I、表2。
權(quán)利要求
1.輻射育種高產(chǎn)蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產(chǎn)方法，通過低劑量銫137放射性元素輻射后篩選獲得，定名為ycc Gy 1016 ;具體生產(chǎn)方法是通過下述步驟實(shí)現(xiàn)的1)選擇目前生產(chǎn)中廣泛使用的北蟲草品種ycc-01作為輻射育種的出發(fā)菌株；2)ycc-01培養(yǎng)基配方葡萄糖20克、蛋白胨5克、酵母浸粉3克、磷酸ニ氫鉀3克、硫酸鎂2克、復(fù)合維生素100毫克及蒸餾水1000毫升，按常規(guī)方法生產(chǎn)液體種源；3)按常規(guī)方法制備加富PDA培養(yǎng)基，其配方為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蛋白胨3g，酵母膏2g，磷酸ニ氫鉀2g，硫酸鎂lg，水IOOOmL ;取直徑10厘米培養(yǎng)皿同步高壓滅菌，倒平板、冷卻后涂布稀釋1000-3000倍的含有分生孢子的液體種源菌液0. 1-0. 5毫升， 均勻涂布于平板上，在18-25°C避光定植培養(yǎng)24-36小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入輻射處理；4)輻射源選擇低劑量銫137，劑量50Gy-500Gy，距離30cm，照射2_300s，照射后在20°C 暗培養(yǎng)2-7天，然后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度4000-6000勒克斯，培養(yǎng)時(shí)間2_4天，然后根據(jù)菌落生長形態(tài)進(jìn)行菌落篩選；5)菌落篩選，在宏觀層面，選擇菌落生長正常，邊緣整齊、菌絲不徒長，菌絲轉(zhuǎn)色深的菌落；在微觀層面通過顯微鏡進(jìn)行觀察，選擇菌絲粗細(xì)均勻、細(xì)胞核數(shù)量多、菌絲分枝適度、分生孢子著生呈念珠狀態(tài)，選擇符合上述要求的菌落挑取保存；6)將挑取菌落進(jìn)行編號，按常規(guī)方法擴(kuò)繁母種和液體菌種，并進(jìn)行栽培，對出草正常， 子實(shí)體形態(tài)正常、產(chǎn)量高的菌落制備液體菌種，培養(yǎng)基配方為葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母浸粉3克，磷酸ニ氫鉀3克，硫酸鎂2克，蒸餾水1000毫升，以出發(fā)菌株ycc-01為對照， 常規(guī)培養(yǎng)后測定菌絲體中蟲草素含量和液體培養(yǎng)基中蟲草素含量；7)經(jīng)過檢測，對蟲草素含量高菌落進(jìn)行提純、復(fù)壯；按常規(guī)制備液體菌種，按每瓶鮮蠶蛹10個(gè)、干小麥20克、飲用水30毫升，滅菌后接種，按常規(guī)培養(yǎng)，待出草后選子實(shí)體形態(tài)好的，進(jìn)行組織分離獲取種源；8)對選擇出的產(chǎn)生蟲草素高的組織分離種源進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性評價(jià)實(shí)驗(yàn)，最后篩選得到一株高產(chǎn)蟲草素的新菌株，定名為ycc Gy 1016新菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的輻射育種高產(chǎn)蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產(chǎn)方法，其特征在于所述遺傳穩(wěn)定性評價(jià)實(shí)驗(yàn)，指按如下步驟程序操作，至少連續(xù)栽培3個(gè)批次，來確認(rèn)種源種性的穩(wěn)定性；1)采用馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母膏2g，磷酸ニ氫鉀2g，硫酸鎂化，水 IOOOmL配方按常規(guī)繁育生產(chǎn)用液體菌種；2)采用750毫升的玻璃罐頭瓶為容器，每瓶45克小麥，加水70毫升，I.05公斤/平方厘米壓カ滅菌60分鐘，冷卻接種；3)菌瓶先放于20°C避光培養(yǎng)6天，然后轉(zhuǎn)入光暗交叉培養(yǎng)，每天白天以4000勒克斯強(qiáng)度光照，晚上暗培養(yǎng)，環(huán)境濕度85%，每天通風(fēng)3次；4)整個(gè)生產(chǎn)周期60天，子實(shí)體長度控制在8-12厘米，其它按常規(guī)操作，每批采用后抽樣測定產(chǎn)量和蟲草素含量。
全文摘要
輻射育種高產(chǎn)蟲草素的北冬蟲夏草種源的生產(chǎn)方法，是為了解決目前為提高北蟲草的蟲草素含量，所采用的通過向培養(yǎng)基中添加一定數(shù)量的蛋白源其提高幅度有限，效果不理想的技術(shù)問題而設(shè)計(jì)的。該方法通過輻射、誘變和篩選實(shí)現(xiàn)培育目標(biāo)菌株的目的。目標(biāo)菌株yccGy1016是通過對出發(fā)菌株ycc-01進(jìn)行特點(diǎn)參數(shù)的輻射處理和對變異菌落的篩選純化，以及對產(chǎn)生蟲草素指標(biāo)的科學(xué)檢測和栽培穩(wěn)定性的評價(jià)，最后獲得該專利所提及的高產(chǎn)蟲草素北蟲草新菌株的生產(chǎn)方法。經(jīng)檢測菌株ycc Gy 1016產(chǎn)生蟲草素能力是出發(fā)菌株ycc-01的3.8倍。這一成果對于人工生產(chǎn)功能性北蟲草具有重要價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號A01G1/04GK102599005SQ20111002281
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月20日
發(fā)明者劉詩揚(yáng), 徐方旭, 李鋒, 王俊偉, 王升厚, 董忠生 申請人:沈陽師范大學(xué)